Röntgenbeugung von intakten Murine Skelettmuskel als Werkzeug zur Untersuchung der strukturellen Basis von Muskelerkrankungen
18. Juli 2019
Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Durchführung von Kleinwinkel-Röntgenbeugungsexperimenten mit intakten Mausskelettmuskeln. Mit der breiten Verfügbarkeit von transgenen Mausmodellen für menschliche Krankheiten kann diese experimentelle Plattform ein nützliches Prüffeld für die Aufklärung der strukturellen Grundlagen genetischer Muskelerkrankungen bilden.
Physiologisch intakte Mausskelettmuskeln können hochwertige Röntgenbeugungsmuster erzeugen, die viele strukturelle Informationen enthalten, die Einblicke in physiologische Prozesse geben können. Röntgenbeugung ist die einzige Technik, die die Erfassung von hochauflösenden Strukturinformationen aus lebenden Muskelgewebe unter realen physiologischen Bedingungen in echtzeit physiologischer Zeit ermöglicht. Viele Muskelerkrankungen werden vererbt.
Mit der erhöhten Verfügbarkeit, die meisten Myopathienmodelle genetisch zu modifizieren, kann die Röntgenbeugung strukturelle Einblicke in Krankheitsmechanismen liefern und therapeutische Strategien aufzeigen. Die meisten Extensor digitorum longus und soleus Muskeln sind besonders bequem für diesen Zweck. Aber viele andere Muskeln bei Kleintieren können intakt seziert und in ähnlicher Weise behandelt werden.
Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, schalten Sie den kombinierten Motorkraftwandler, die Motorkraftwandlersteuerung mit einem hochleistungsstarken biphasischen Stromstimulator und eine Computersteuerungsdatenerfassungssteuerung ein. Als nächstes sprühen Sie die Haut auf die Hinterseite der Maus mit kalter Ringer-Lösung und verwenden Sie eine feine Sezierschere, um die Haut um den Oberschenkel zu schneiden. Mit Der Nummer fünf Zangen, ziehen Sie schnell die Haut nach unten, um die Muskeln zu belichten und die Hinterbeine amputieren.
Legen Sie die Gliedmaße in eine elastomerbeschichtete Sezierenstellerschale mit sauerstoffhaltiger Ringer-Lösung und legen Sie die Schale unter ein binokulares Sezierenmikroskop. Um den Sohle-Muskel zu ernten, fixieren Sie die Hinterbeine mit dem Gastrocnemius-Muskel nach oben. Verwenden Sie eine feine Schere, um die distale Sehne der Gastrocnemius/Soleus Muskelgruppe zu schneiden.
Schneiden Sie die Faszien auf beiden Seiten des Magen-Darm-Muskels ab, damit die Muskeln sanft und langsam vom Knochen weggehoben werden können. Dann befreien Sie die proximale Sehne des Sohlenmuskels. Pin down der Muskelgruppe mit dem Magen-Darm-Muskel und der distalen Sehne in der Schale.
Heben Sie den Sosolesmuskel sanft über die proximale Sehne an, um ihn vom Magen-Darm-Muskel zu trennen, so dass so viel von der Sohlensehne intakt wie möglich bleibt. Um den Extensor digitorum longus oder EDL Muskel zu ernten, stecken Sie die Hintergliedin in der Schale mit dem tibialis vorderen Muskel nach oben und schneiden Sie die Faszien entlang der tibialis vorderen Muskel. Verwenden Sie Zangen, um die Faszien klar zu ziehen und schneiden Sie die distale Sehne des tibialis vorderen Muskels.
Heben Sie den tibialis vorderen Muskel an und schneiden Sie ihn sorgfältig aus, ohne den EDL-Muskel zu ziehen, und schneiden Sie die seitliche Seite des Knies auf, um die beiden Sehnen freizulegen. Schneiden Sie die proximale Sehne, so dass wir einen Großteil der Sehne wie möglich noch am Muskel befestigt und ziehen Sie sanft an der Sehne, um den EDL-Muskel zu heben. Dann schneiden Sie die distale Sehne, sobald sie ausgesetzt ist.
Um den geernteten Muskel zu montieren, fixieren Sie den Muskel über die Sehnen und trimmen Sie so viel von dem zusätzlichen Fett, Faszien und Sehnen wie möglich. Legen Sie eine Sehne in einen vorgebundenen Knoten und verwenden Sie Nahtbinden Zangen, um die Naht fest zu binden. Binden Sie den zweiten Knoten um den Metallhaken und wiederholen Sie den Vorgang am anderen Ende der Sehne.
Befestigen Sie dann den kurzen Haken an der Unterseite der Versuchskammer und den langen Haken am Dual-Mode-Kraftwandlermotor. Blase die Lösung in der Versuchskammer mit 100%Sauerstoff. Um das Stimulationsprotokoll und die Muskellänge zu optimieren, passen Sie die am Wandlermotor befestigten Mikromanipulatoren an, um eine Ausgangsspannung zwischen 15 und 20 Millinewton zu erzeugen, um die besten Stimulusparameter zu finden, um den Muskel zu dehnen.
Stellen Sie die Stimulationsspannung auf 40 Volt ein. Der Stimulationsstrom wird systematisch erhöht, bis es keine zusätzliche Erhöhung der Zuckkraft gibt. Um die optimale Länge zu finden, erhöhen Sie die Muskellänge und aktivieren Sie den Muskel mit einem einzigen Zucken, bis die aktive Kraft aufhört zu erhöhen.
Führen Sie eine eine Sekunde tetanische Kontraktion durch, um die Montage zu testen und den Muskel bei Bedarf wieder auf die optimale Grundkraft zu dehnen. Dann notieren Sie die Muskellänge in Millimetern mit einem digitalen Sättel. Um die Strahlposition zu bestimmen, verwenden Sie ein Röntgenpapier, das einen dunklen Fleck als Reaktion auf Röntgenstrahlen erzeugt, und einen Video-Fadenkreuzgenerator, um ein Fadenkreuz zu erstellen, das an der Brennmarkierung auf dem Papier ausgerichtet ist.
Mithilfe der von BioCAT gelieferten grafischen Benutzeroberfläche zum Probenpositionierer zentrieren Sie den Muskel auf der Strahlposition und bewegen Sie die Probenstufe, um die Probenkammer mit 10 bis 20 Millimetern pro Sekunde zu oszillieren, um die Röntgendosis während der Belichtung über den gesamten Muskel zu verteilen. Beobachten Sie die Probe, während sie sich bewegt, um große Faszienbereiche zu vermeiden, die Kollagen enthalten, und um sicherzustellen, dass sie während des gesamten Weges ihrer Reise beleuchtet bleibt. Bewaffnen Sie den Detektor und warten Sie auf den Auslöser aus dem Datenerfassungssystem.
Lösen Sie dann die mechanischen daten und Röntgendaten gleichzeitig aus, um sie zu synchronisieren. Die Röntgenmuster werden kontinuierlich während des gesamten Protokolls mit einer Belichtungszeit von 10 Millisekunden und einer Expositionsdauer von 50 Millisekunden gesammelt. Bei dieser repräsentativen isometrischen tetanischen Kontraktion wurde der EDL-Muskel 0,5 Sekunden lang ruhend gehalten, bevor er für eine Sekunde aktiviert wurde, gefolgt von einer 1,5-Sekunden-Entspannung.
Das Muskel-Röntgen-Beugungsmuster kann Nanometer-Auflösung strukturelle Informationen von Strukturen innerhalb des Sarcomere geben. Myosin-basierte Schichtlinien, die dicke Filamente enthalten, sind stark und scharf in Mustern aus ruhenden Muskeln, während actinbasierte Schichtlinien, die dünne Filamente enthalten, in Mustern, die sich anmuskeln, stärker hervortun. Unterschiedliche Muster, die durch Subtraktion des Ruhemusters vom Kontraktiermuster gewonnen werden, können Licht auf strukturelle Veränderungen während der Kraftentwicklung in gesunden und kranken Muskeln werfen.
Durch die Verfolgung dieser strukturellen Veränderungen auf der Millisekunden-Zeitskala der molekularen Ereignisse während der Muskelkontraktion und Entspannung können die Röntgenbeugungsmuster wesentliche strukturelle Informationen offenbaren. In dieser repräsentativen äquatorialen Reflexionsanalyse mit der Äquator-Routine im Open-Source-Paket MuscleX zeigt das äquatoriale Intensitätsverhältnis die Nähe von Myosin zu Aktin im ruhenden Muskel an und ist eng mit der Anzahl der befestigten Querbrücken bei der Kontraktion des murinen Skelettmuskels korreliert. Der Abstand zwischen den beiden 1, 0 Reflexionen hängt umgekehrt mit dem Interfilamentabstand zusammen.
Eine saubere Sezierung ist der Schlüssel für ein erfolgreiches intaktes Muskel-Röntgenexperiment, also versuchen Sie, mechanische Schäden während der Muskelvorbereitung zu vermeiden. Jedes physiologische Standardprotokoll mit ganzen Muskeln kann in diesen Experimenten implementiert werden und kann verwendet werden, um Muskelaktivierung, Entspannung und Cross-Bridge-Verhalten bei schneller mechanischer Vergänglichkeit zu studieren. Die genetische Manipulation von Mäusen wird immer ausgeklügelter.
Neue transgene Mausmodelle werden es ermöglichen, spezifischere und aufschlussreichere Experimente zu entwickeln, um neue therapeutische Richtungen für menschliche Myopathien aufzuzeigen.
Übersicht
In diesem Artikel werden Protokolle zur Durchführung von Röntgen-Kleinwinkelstreuexperimenten an intakten Skelettmuskeln von Mäusen vorgestellt. Die Methode liefert Einblicke in die strukturellen Grundlagen genetischer Muskelerkrankungen und nutzt die Verfügbarkeit transgener Mausmodelle aus.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biophysik
- Muskelphysiologie
Hintergrund
- Röntgenbeugung liefert strukturelle Informationen mit hoher Auflösung aus lebendem Muskelgewebe.
- Das Verständnis von Muskelerkrankungen kann von Erkenntnissen profitieren, die durch die strukturelle Analyse gewonnen werden.
- Transgene Mausmodelle stehen zunehmend zur Untersuchung von Myopathien zur Verfügung.
- Bestimmte Muskeln wie der Musculus extensor digitorum longus und der Musculus soleus eignen sich für diese Experimente.
Zweck der Studie
- Aufklärung der strukturellen Veränderungen im Muskel während Kontraktion und Erschlaffung.
- Bereitstellung einer Plattform zur Untersuchung der Mechanismen erblicher Muskelkrankheiten.
- Angabe potenzieller therapeutischer Strategien basierend auf strukturellen Erkenntnissen.
Verwendete Methoden
- Gewinnung intakter Skelettmuskeln von Mäusen.
- Durchführung von Röntgenbeugungsexperimenten unter physiologischen Bedingungen.
- Verwendung eines Kraftaufnehmers mit Doppelmodus zur Muskelstimulation.
- Sammlung von Röntgenbeugungsmustern zur Analyse struktureller Veränderungen im Nanometerbereich.
Hauptergebnisse
- Röntgenbeugungsmuster zeigen strukturelle Informationen über Sarkomere.
- Unterschiede in den Mustern zwischen ruhenden und kontrahierenden Muskeln liefern Einblicke in die Kraftentwicklung.
- Strukturelle Veränderungen können während der Muskelaktivität im Millisekundenbereich verfolgt werden.
- Die Erkenntnisse tragen zum Verständnis der Muskelphysiologie und Krankheitsmechanismen bei.
Schlussfolgerungen
- Die Studie zeigt die Nützlichkeit der Röntgenbeugung in der Muskelforschung auf.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können therapeutische Ansätze bei Muskelerkrankungen unterstützen.
- Diese Methode vertieft unser Verständnis der Muskelphysiologie und -pathologie.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Röntgenbeugung intakter muriner Skelettmuskulatur ermöglicht die strukturelle Analyse im Nanometerbereich unter physiologischen Bedingungen und liefert so einen direkten Zusammenhang zwischen Genotyp und funktionellem Phänotyp in Modellen von Muskelerkrankungen. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung, indem er sarcomerische Strukturveränderungen während der Kraftentwicklung aufzeigt, und bietet eine mechanistische Entlastung für therapeutische Strategien bei erblichen Myopathien. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in präklinischen Modellen, indem sie die Interfilamentabstände und die Dynamik der Querbrückenbindung auf Millisekunden-Zeitskalen quantifiziert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem genetische Modifikationen mit sarcomerischen Strukturveränderungen im intakten Muskel verknüpft werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch Echtzeit-Strukturmessungen von Myosin-Aktin-Wechselwirkungen während der Kontraktion.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Vorhersagegenauigkeit durch Quantifizierung struktureller Korrelate der Querbrücken-Bindung und des Interfilamentabstands.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe vor, indem die native Muskelarchitektur und -physiologie erhalten bleibt.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch kontrollierte Stimulationsprotokolle und synchronisierte Röntgendatenakquisition.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstreicht die Eignung für Hochdurchsatz-Screenings anhand quantitativer struktureller Ausgabedaten wie equatorialer Intensitätsverhältnisse und Layer-Line-Analysen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem strukturelle Veränderungen in transgenen Modellen mit menschlichen Myopathie-Mechanismen verknüpft werden.
- Operativer Wert: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem eine longitudinale strukturelle Überwachung ermöglicht wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem strukturelle Biomarker des Krankheitsverlaufs identifiziert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Validierung, indem sie eine strukturelle Phänotypisierung der Muskelaktivität unter physiologischen Bedingungen ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung, Klärung von Signalwegen und biologische Entlastung durch strukturelle Analyse der Sarkomerdynamik unterstützt.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays, Reproduzierbarkeit und quantitative Ausgaben mittels synchronisierter mechanischer und Röntgendatenakquisition.
- Analytik: Betont Messungen, Nachweise oder statistische Ergebnisse, die Teams bei dem Vergleich von Bedingungen helfen, einschließlich equatorialer Intensitätsverhältnisse und Reflexabstände.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit präklinischer Kontinuität oder Biomarkerabstimmung, indem strukturelle Veränderungen in Krankheitsmodellen verfolgt werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar, anstatt als Einmaltechnik, durch standardisierte Montage- und Stimulationsprotokolle.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeit.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirksamkeit und verringertes biologisches Risiko in späteren Phasen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung und Förderentscheidungen.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Expertise in der Muskelphysiologie, Röntgenbeugung und dem Umgang mit transgenen Modellen.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich Synchrotron-Strahllinien, Kraftaufnehmer im Dual-Mode und synchronisierter Datenerfassungssysteme.
- Standardisierungsanforderungen über Teamgrenzen hinweg für Muskelpräparation, -montage und Stimulationsprotokolle in verschiedenen Laboren.
- Anpassungsüberlegungen für verschiedene Modellsysteme, insbesondere für unterschiedliche murine Muskeln und Krankheitsmodelle.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind, darunter die Notwendigkeit einer sauberen Präparation, um Faszienkontamination zu vermeiden und die Probenechtheit während der Belichtung aufrechtzuerhalten.
