Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen
27. April 2019
SUMO ist ein essentielles und hoch konserviertes, kleines, ubiquitin-ähnliches Modifikatorprotein. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung eines stresstoleranten rekombinanten, rekombinanten SUMO-Fantifen-Proteins (kmUTAG) zur Visualisierung von nativen, nicht markierten SUMO-Konjugaten und deren Lokalisierung in einer Vielzahl von Zelltypen.
Die Bedeutung dieses Protokolls ist die Verwendung eines neuartigen fluoreszierenden SUMO-trapping UTAG-Proteins zum Nachweis des Proteinmodifizierers SUMO in verschiedenen eukaryotischen Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ein einfaches Protokoll für den antikörperfreien Nachweis von SUMO in einer Vielzahl von Zellen, einschließlich Säugetiergewebekultur und Nematodengonden. SUMO spielt eine wichtige Rolle bei Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen, was die Notwendigkeit robuster und zuverlässiger Instrumente für die Detektion und funktionelle Analyse von SUMO-modifizierten Proteinen unterstreicht.
Da SUMO hochkonserviert ist, kann das fluoreszierende SUMO-trapping UTAG-Protein verwendet werden, um konjugierte SUMO in vielen verschiedenen Organismen zu kennzeichnen. Dieses Video zeigt seine Verwendung in Säugetierzellen. Darüber hinaus beschreibt der Volltext seine Verwendung in nematoden Oozyten.
Die visuelle Demonstration dieser Technik liefert kritische Hinweise für die Behandlung von Zellen vor der Färbung und SUMO-Erkennung. Zunächst können Gewebekulturzellen der Wahl auf 22-Millimeter-Rundabdeckungen in sechs bohren DEN TC-Platten bis zu 70 bis 80 % konfluent wachsen. Waschen Sie die Zellen kurz mit einem Milliliter DPBS.
Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie jedem Brunnen zwei Milliliter frische 4%PFA und DPBS hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die festen Zellen dreimal für fünf Minuten in einem Milliliter DPBS, während Sie die Platte verneinen.
Um die Zellen zu permeabilisieren, inkubieren Sie für 15 Minuten mit 1%Triton X-100 in DPBS. Waschen Sie die Zellen wieder, wie zuvor. Inkubieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern von 1 Molarglycin HCL pH 2 für 10 Sekunden.
Dann neutralisieren Sie den pH-Wert sofort mit 500 Mikroliter n10 SUMO Protease Puffer, oder SPB. Nach dem Waschen der Zellen wie zuvor, entfernen Sie die Abdeckung rutscht aus dem Brunnen und legen Sie sie in eine Feuchtigkeitskammer. Nur für UTAG-FL-Färbungeininformationen ein Mikrogramm UTAG-FL mit 100 Mikrolitern 1X SPB mit fünf Millimolaren TCEP in einem Rohr mischen.
Dann pipette die Mischung auf die Zellen auf der Abdeckung rutschen und inkubieren bei Raumtemperatur für eine Stunde in der Feuchtigkeitskammer. Um die Abdeckung saugen rutscht, Pipette 200 Mikroliter DPBS auf jeder Abdeckung rutschen und lassen An Ort und Stelle für 10 Minuten. Wiederholen Sie die Wäsche zwei weitere Male.
Entfernen Sie die Deckelscheine von der letzten Wäsche und kehren Sie auf einen vorgereinigten Mikroskopieschlitten mit einem Tropfen Montagemedium um. Lagern Sie die Proben über Nacht in einem 20 Grad Celsius Gefrierschrank, bevor Sie unter dem Mikroskop betrachten. Visualisieren Sie die Zellen mithilfe der entsprechenden Filtersätze für DAPI und Texas Red.
Bitte lesen Sie den vollständigen Text für ein Protokoll, wie Man SUMO und feste Nematoden-Gonaden beschriften kann. Während die Kennzeichnung von Säugetierzellen ziemlich einfach ist, erfordert die Etikettierung von Nematodenoozyten eine vorherige Ausbildung in Gonadensektionen. KmUTAG-FL inkubiert mit festen PMT2-Zellen zeigte eine deutliche nukleare Färbung.
Sowohl diffuse nukleare Färbung als auch ausgeprägte Kernbrennpunkte waren sichtbar. Die kerntechnische Lokalisierung wurde durch Co-Färbung mit DAPI bestätigt. In Übereinstimmung mit der SUMO-Fangaktivität von KmUTAG-FL erinnerte das nukleare Lokalisierungsmuster an die SUMO23-Färbung.
Die Co-Färbung mit Anti-SUMO23 8A2 Antikörpern bestätigte die Kolokalisierung von KmUTAG-FL mit dem SUMO23-Signal. Dies bestätigt die Wirksamkeit von KmUTAG-FL zum Nachweis von SUMO23 in Säugetierzellen. Isolierte Gonaden aus eizellenproduzierenden Erwachsenenhermaphrodit c.
Elegans Nematoden wurden mit Anti-SUMO-Antikörpern gekennzeichnet. In Übereinstimmung mit früheren Berichten lokalisierte Sichten antikörperzunächst das Kernplasma der späten myotischen Prophase-Oozyten. Es verteilte sich dann auf den zentralen Ringkomplex der gepaarten Homologe, als die Kernhülle zusammenbrach und die Chromosomen auf die Metaphasenplatte zusteuerten.
In parallelen Präparaten zeigten Mit KmUTAG-FL beschriftete Gonaden ähnliche Muster. KmUTAG-FL verlagerte sich von der Kennzeichnung des Nukleoplasmas hin zur Konzentration auf den Ringkomplex, als Eizellen begannen und den Prozess des Nuklearen Hüllenabbaus abschlossen. Diese Ergebnisse bestätigen KmUTAG-FL als nützliches Werkzeug für die Analyse von Myose- und SUMO-bezogenen Prozessen in c.
Elegans und möglicherweise andere Nematoden. Bei der Fixierung ist es wichtig, frisches Paraformaldehyd und eine kurze Fixierungszeit zu verwenden, um SUMO nativ gefaltet zu halten, so dass es von der KmUTAG erkannt werden kann. Da die tertiäre Struktur von SUMO sehr konserviert ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass SUMO-Varianten aus zusätzlichen Modell- und Nicht-Modellsystemen mit dem KmUTAG-FL-Reagenz analysiert werden können.
Derzeit verwenden wir dieses neuartige fluoreszierende SUMO-Trapping-UTAG-Protein, um die Funktion von SUMO während zellulären Stresses zu untersuchen. Bitte beachten Sie abschließend, dass alle Schritte mit dem fixativen Paraformaldehyd in einer Sicherheitshaube des Labors durchgeführt werden müssen und dieses Reagenz ordnungsgemäß entsorgt werden muss.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines neuartigen fluoreszierenden SUMO-Fangproteins (kmUTAG) zum Nachweis von SUMO-Konjugaten in verschiedenen eukaryotischen Zellen. Die Technik ermöglicht die antikörperfreie Visualisierung von SUMO, was entscheidend für das Verständnis seiner Rolle bei Krebs- und neurodegenerativen Erkrankungen ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Proteinsmodifikation
Hintergrund
- SUMO ist ein kleines ubiquitinähnliches Modifikationsprotein, das über verschiedene Arten hinweg hochgradig konserviert ist.
- Es spielt bedeutende Rollen bei zahlreichen zellulären Prozessen, einschließlich der Stressantwort und der Proteinlokalisation.
- Zuverlässige Nachweismethoden für SUMO-modifizierte Proteine sind für die funktionelle Analyse unerlässlich.
- Dieses Protokoll nutzt ein rekombinantes SUMO-Falle-Protein, um SUMO in verschiedenen Zelltypen sichtbar zu machen.
Zweck der Studie
- Eine einfache Methode zur Detektion von SUMO-Konjugaten ohne Verwendung von Antikörpern bereitstellen.
- Die Anwendung von kmUTAG in Säugerzellen und Nematoden-Oozyten demonstrieren.
- Das Verständnis der Rolle von SUMO in Gesundheit und Krankheit vertiefen.
Verwendete Methoden
- Fluoreszenzmarkierung von SUMO unter Verwendung des kmUTAG-Proteins.
- Visualisierung von SUMO-Konjugaten in Säugerzellkulturen.
- Anwendung der Technik in Nematoden-Gonaden.
- Analyse der SUMO-Lokalisation in verschiedenen eukaryotischen Zellen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von SUMO-Konjugaten in verschiedenen Zelltypen.
- Nachweis der Wirksamkeit von kmUTAG für die antikörperfreie Detektion.
- Erkenntnisse zur Lokalisation und Funktion von SUMO-modifizierten Proteinen.
- Mögliche Anwendungen bei der Untersuchung der Rolle von SUMO in Krebs- und neurodegenerativen Erkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Das kmUTAG-Protein ist ein wertvolles Hilfsmittel zur Detektion von SUMO in verschiedenen Organismen.
- Diese Methode vereinfacht die Untersuchung der biologischen Funktionen von SUMO.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können diese Technik nutzen, um SUMO-assoziierte Signalwege in Gesundheit und Krankheit zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die antikörperfreie Detektion von SUMO-Modifikationen ermöglicht eine robuste Zielvalidierung in krankheitsrelevanten Systemen, insbesondere bei Onkologie- und Neurodegenerationsprogrammen, bei denen die SUMOylierung die Proteinstabilität und -funktion beeinflusst. Das kmUTAG-Reagenz stellt ein rekombinantes, über artgrenzen hinweg einsetzbares Werkzeug bereit, das die Variabilität von Assays verringert und durch die direkte Visualisierung endogener SUMO-Konjugate in lebenden oder fixierten Zellen die mechanistische Entlastung von Risiken unterstützt. Dieser Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsforschung, indem er antikörperabhängige Artefakte eliminiert und eine standardisierte Untersuchung des SUMO-Weges über verschiedene Modellsysteme hinweg ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die direkte Untersuchung der SUMO-abhängigen Proteinsregulation ohne Antikörperinterferenz und unterstützt die Überprüfung von Hypothesen zu Zielstrukturen in Modellen für Krebs- und neurodegenerative Erkrankungen.
- Operativer Wert: Die rekombinante Herstellung gewährleistet eine konsistente Qualität zwischen Chargen sowie Skalierbarkeit für Hochdurchsatz-Screening-Kampagnen, die Nachweise der SUMO-Aktivität erfordern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Fluoreszenzsignale zum SUMO-Konjugationsstatus und ermöglicht die Standardisierung von Assays für verbindungsinduzierte Veränderungen der SUMOylierung.
- Operationaler Wert: Kompatibel mit Standardmikroskopie- und Fixierungsprotokollen, wodurch eine Integration in bestehende zellbasierte Assay-Plattformen ohne spezielle Geräte möglich ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht vergleichende Untersuchungen zur SUMO-Lokalisation von Säugetierzellen bis hin zu Nematoden-Oozyten und unterstützt die translationale Abstimmung von Biomarkern in konservierten Stressantwortwegen.
- Operativer Wert: Funktioniert in fixierten Gewebeproben und ermöglicht die retrospektive Analyse von SUMO-Dynamiken in präklinischen Krankheitsmodellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in frühe Entdeckungsworkflows ein, bei denen die Modulation des SUMO-Signalwegs ein Wirkmechanismus ist, und liefert eine orthogonale Validierung für biochemische oder genetische SUMO-Störungsstudien vor der Optimierung von Leitsubstanzen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die hypothesengetriebene Untersuchung, indem die gezielte SUMO-Konjugation als Antwort auf Modulatoren von Signalwegen oder genetische Knockdowns bestätigt wird.
- Screening: Ermöglicht die reproduzierbare Detektion der Bildung von SUMO-Foci als phänotypischen Endpunkt in Hochdurchsatz-Screening-Assays.
- Analytik: Liefert quantitative Daten zur subzellulären Lokalisation (kern- vs. zytoplasmatisch, diffus vs. fokal), die mit Wirkstoffbehandlungen oder genetischem Hintergrund korreliert werden können.
- Translationale Forschung: Zeigt die Erhaltung von SUMO-Transportmustern über Arten hinweg auf und unterstützt die Übertragung von Ergebnissen aus Fadenwurmmodellen auf Säuger-Systeme.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das rekombinante kmUTAG-FL kann eingelagert und zwischen Abteilungen als standardisierter Reagenz zur Überwachung des SUMO-Wegs geteilt werden.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert falsch-positive Ergebnisse bei der SUMO-Detektion, indem die Bindung an freies SUMO minimiert wird, wodurch die Zuverlässigkeit konjugatspezifischer Signale erhöht wird.
- Operationaler Wert: Entfällt die Notwendigkeit für Antikörpereinkauf, -validierung und -titration und verkürzt somit die Entwicklungszeiten und senkt die Kosten von Assays.
- Strategischer Wert: Ermöglicht Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf der direkten Visualisierung der Zielinteraktion mit der SUMO-Maschinerie und reduziert mechanistische Unklarheiten in frühen Projekten.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Substanzen, die die SUMOylierung modulieren, indem funktionelle, lokalisationsbasierte Nachweise der Signalwegaktivität bereitgestellt werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, Fixierung und Fluoreszenzmikroskopie für die korrekte Probenvorbereitung und Visualisierung.
- Setzt den Zugang zu einer Fluoreszenzmikroskopie mit geeigneten Filterblöcken für DAPI- und Texas-Red-Kanäle voraus.
- Die Markierung von Nematoden-Oozyten erfordert vorherige Erfahrung in der Gonaden-Dissektion, was die unmittelbare Skalierbarkeit in nicht spezialisierten Laboren einschränkt.
- Die Fixierung mit frischem Paraformaldehyd ist entscheidend, um die tertiäre Struktur von SUMO zu erhalten, und erfordert standardisierte Reagenzienhandhabung an allen Standorten.
- Obwohl die Methode in Säugetierzellen und C. elegans wirksam ist, kann eine empirische Validierung bei neuen Modellsystemen notwendig sein, um die Kompatibilität mit kmUTAG-FL zu bestätigen.
