Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen mithilfe der OpenProt-Datenbank zu enthüllen neue Proteine übersetzt aus dem nicht-kanonischen Open Reading Frames
11. April 2019
OpenProt ist eine frei zugängliche Datenbank, die eine Polycistronic Modell der eukaryotic Genome erzwingt. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von OpenProt Datenbanken bei der Massenspektrometrie Datasets zu verhören. Mit OpenProt kann Datenbank zur Auswertung von Proteomic Experimenten für Entdeckung von Roman und bisher nicht nachweisbar Proteinen.
OpenProt ist die erste Datenbank, die eine polysystronische Annotation eukaryotischer Genome ermöglicht, das Kodierungspotenzial von Protogenen erkennt und die Entdeckung bisher nicht nachweisbarer Proteine ermöglicht. Wir haben dieses Protokoll so konzipiert, dass es für alle Benutzer zugänglich ist, ohne umfangreiche bioinformatische Fähigkeiten zu erfordern. Um die heutigen Herausforderungen in der Medizin zu verstehen und anzugehen, müssen wir die proteomische Landschaft und alle Akteure und ihre Dynamik vollständig verstehen.
OpenProt bietet diese Möglichkeit. Obwohl openProt hier für die Analyse von patonomischen Experimenten verwendet wird, kann es auch mit anderen Systemen verwendet werden, da es einfach eine klarere Definition des Proteoms bietet. Öffnen Sie zunächst die OpenProt-Website und verwenden Sie den Link aus dem Oberen Seitenmenü, um die Downloadseite zu öffnen.
Klicken Sie auf die Arten von Interesse auf der Grundlage der Analyse'experimentelleDaten und der gewünschten Proteintyp. Klicken Sie auf AllProts, Isoforms und RefProds, um Dateien zu generieren, die alle bekannten und neuartigen Proteintypen enthalten, die in der OpenProt-Datenbank vorhanden sind, und klicken Sie auf die Anmerkung, aus der die Proteinsequenzen entnommen werden. Klicken Sie auf die Höhe der Belege, die für die Proteinbetrachtung gemäß dem Forschungsziel erforderlich sind.
Klicken Sie dann auf alle vorhergesagten Dateien, die alle OpenProt-Vorhersagen enthalten, und klicken Sie auf das gewünschte Dateiformat, das Sie herunterladen möchten. Wählen Sie für proteomische Anaysen die FASTA-Proteindatei aus. Die Readme-Datei enthält alle notwendigen Informationen zum Dateiformat.
Melden Sie sich für die Datenbankbehandlung bei einer entsprechenden Proteomics-Toolinstanz an, und erstellen Sie einen neuen Verlauf. Um die heruntergeladene OpenProt-Datenbank zu importieren, klicken Sie auf Hochladen. Um den Datenbankbehandlungsworkflow einzugeben, wechseln Sie zur Workflowseite, klicken Sie erneut auf Hochladen, und klicken Sie auf Workflow ausführen.
Wählen Sie dann die importierte OpenProt-Datenbank als Eingabe aus und benennen Sie die erhaltene Fasta-Datei in etwas Sinnvolles um. Die Datenbank kann für Proteomikanalysen verwendet werden. Öffnen Sie zur Vorbereitung der Massenspektrometriedatei das frei verfügbare MS-Konvertierungstool aus der proteo Wizard Suite, und laden Sie die zu analysierende Datendatei hoch.
Wählen Sie das Verzeichnis für die Ausgabe und legen Sie das gewünschte Dateiformat auf mzML fest und verwenden Sie dann den Wavelet-basierten Algorithmus auf den Massenspektrometriestufen eins und zwei, um einen Peak-Picking-Filter auszuwählen und die Konvertierung zu starten. Erstellen Sie für die Proteinquantifizierung eine neue Historie, und ziehen Sie die zuvor erstellte Datenbank in die neue Historie. Klicken Sie auf Hochladen, um die transformierte mzML-Datendatei zu importieren.
Öffnen Sie die Workflowseite, klicken Sie erneut auf Hochladen, um den gewünschten Workflow zu importieren, und wählen Sie Workflow ausführen aus, um die verschiedenen Parameter zu überprüfen. Wählen Sie die importierte mzML-Datendatei aus und geben Sie die zuvor erstellte Datenbank als Fasta-Datenbankdatei ein. Da der Workflow verwendet die X!
Tandem-Suchmaschine, klicken Sie auf Hochladen, um das X zu importieren! Tandem-Standardkonfigurationsdatei. Um die erhebliche Vergrößerung bei der Verwendung der gesamten OpenProt databse zu berücksichtigen, verwenden Sie eine strenge falsche Erkennungsrate.
Führen Sie zur Qualitätskontrolle das Dateiinfo-Tool auf der ID-Filterausgabe aus, um allgemeine Leistungsmetriken bereitzustellen, z. B. die Anzahl der Peptidspektrumübereinstimmungen oder die Anzahl der identifizierten Peptide und Proteine. Kehren Sie zum OpenProt-Datenbankmining zur OpenProt-Website zurück, und öffnen Sie die Suchseite. Klicken Sie auf die Arten, für die das Protein identifiziert wurde, und geben Sie die Protein-Beitrittsnummer in das Proteinabfragefeld ein.
Klicken Sie auf Überspannung, und es wird eine Tabelle mit grundlegenden Informationen für das abgefragte Protein angezeigt. Klicken Sie als Nächstes auf den Link "Details". Die neu geöffnete Seite enthält einen Genombrowser, der sich auf das abgefragte Protein konzentriert, sowie weitere Informationen.
Um Protein- oder DNA-Sequenzen zu erhalten, klicken Sie auf die Protein- oder DNA-Links aus den Info-Registerkarten bzw. klicken Sie auf die Registerkarten, um die detaillierten Informationen über den Nachweis des Ribosomen-Profilierungsnachweises für Massenspektrometrie und die Konservierung und die Identifizierung von Proteindomänen zu durchsuchen. In dieser repräsentativen Analyse wurden die meisten der im Originalpapier identifizierten Proteine auch mit dem OpenProt-2_pep oder der OpenProt_all-Datenbank identifiziert, was zeigt, dass OpenProt-Datenbanken in der Lage sind, Proteinidentifikation und -quantifizierung zu erzeugen, die mit denen der aktuellen Verfahren auf der Grundlage der InterPro KB-Datenbanken vergleichbar sind. 11 gut unterstützte Proteine, die derzeit noch nicht in Datenbanken mit Anmerkungen gekennzeichnet sind, wurden in allen Datensätzen mit selbstbewussten Peptiden mit der OpenProt-2_pep-Datenbank identifiziert.
29 neuartige Proteine wurden in allen Datensätzen mit selbstbewussten Peptiden mit Hilfe der OpenProt_all-Datenbank entdeckt. Die empfohlene strenge falsche Entdeckungsrate hatte keinen Einfluss auf die sichersten Proteinidentifikationen, obwohl sie die Gesamtzahl der identifizierten Proteine verringerte. Ein neuartiges Protein wurde als Interaktor des Raf-1-Proteins entdeckt.
Diese Proteine waren zuvor nicht durch Massenspektrometrie oder Ribosomenprofilierung nachgewiesen worden und zeigten ein qualitativ hochwertiges Spektrum. Denken Sie daran, sicherzustellen, dass die ausgewählten Parameter dem experimentellen Design entsprechen, und überprüfen Sie immer die Qualität der sportlichen Beweise, wenn sie neuartige Proteinfunde melden. Dieses Protokoll ist an alle Top-Down-Proteomik-Experimente angepasst, insbesondere bei Verwendung mit funktioneller Proteomik.
Dies wird ein viel tiefes Screening und Verständnis von Protein-Wechselwirkungen und zellulären Bahnen ermöglichen. OpenProt hebt die erhebliche Unterschätzung der protomischen Landschaft hervor, die durch aktuelle genomische Notationen vermittelt wird, und betont die polysystronische Natur eukaryotischer Gene. Es ist ein ganz neuer Weg für die Forschung.
Das Schöne an diesem Protokoll ist, dass es keine umfangreichen bioinformatischen Fähigkeiten erfordert und dass es, da es entfernte Server verwendet, auf jedem Computer ausgeführt werden kann.
Übersicht
OpenProt ist eine bahnbrechende Datenbank, die ein polycistronisches Modell eukaryotischer Genome unterstützt und die Entdeckung zuvor nicht nachweisbarer Proteine ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt, wie OpenProt-Datenbanken zur Analyse von Massenspektrometrie-Datensätzen genutzt werden können, um proteomische Entdeckungen auch Forschern ohne umfangreiche bioinformatische Kenntnisse zugänglich zu machen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Proteomik
- Genomik
- Bioinformatik
Hintergrund
- OpenProt ermöglicht die polysystronische Annotation eukaryotischer Genome.
- Es erkennt das kodierende Potenzial von Proto-Genen.
- Die Datenbank verbessert das Verständnis der proteomischen Landschaft.
- Sie bietet eine klarere Definition des Proteoms für verschiedene Analysen.
Zweck der Studie
- Ein Protokoll für die Verwendung von OpenProt in proteomischen Analysen vorzustellen.
- Die Identifizierung neuartiger Proteine durch Massenspektrometrie zu ermöglichen.
- Die proteomische Analyse für Benutzer mit unterschiedlichen Kompetenzniveaus zugänglich zu machen.
Verwendete Methoden
- Zugriff auf die OpenProt-Datenbank und Auswahl der Arten von Interesse.
- Herunterladen von Proteindateien in verschiedenen Formaten zur Analyse.
- Verwendung des MS Convert-Tools zur Vorbereitung von Massenspektrometrie-Daten.
- Einsatz von Workflows zur Proteinquantifizierung und -identifikation.
Hauptergebnisse
- Identifizierung von 29 neuartigen Proteinen und 11 gut unterstützten Proteinen, die zuvor nicht annotiert waren.
- Vergleichbare Proteinidentifizierung mit bestehenden Datenbanken demonstriert.
- Unterschätzung der proteomischen Landschaft durch aktuelle genomische Annotationen hervorgehoben.
- Aufgezeigt, dass das Protokoll für verschiedene Proteomik-Experimente anpassbar ist.
Schlussfolgerungen
- OpenProt verbessert die Entdeckung von Proteinen in eukaryotischen Genomen erheblich.
- Das Protokoll ist benutzerfreundlich und erfordert keine umfangreichen bioinformatischen Kenntnisse.
- Es eröffnet neue Wege für die Forschung in der Proteomik und funktionellen Studien.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Current genome annotations underestimate the eukaryotic proteome by imposing arbitrary ORF length and single-ORF-per-transcript constraints, limiting target discovery in early drug development. OpenProt addresses this gap by enabling polycistronic annotation, revealing novel proteins from non-canonical ORFs that may represent underexplored therapeutic targets or off-liability risks. This expands the target validation landscape and improves predictive confidence in preclinical target selection by reducing false negatives in proteomic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying proteins translated from non-coding regions, 5'/3' UTRs, or overlapping CDSs, clarifying proteome complexity.
- Operational Value: Supports functional target validation through detection of novel proteins with mass spectrometry evidence, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by uncovering proteins with potential disease relevance, improving confidence in target prioritization decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by providing comprehensive protein sequence databases that reflect the true proteomic landscape.
- Operational Value: Improves assay standardization and reproducibility through use of species-specific, evidence-tiered OpenProt databases in mass spectrometry workflows.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by reducing false negatives in proteomic screens via expanded search space with appropriate FDR controls.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by identifying novel proteins expressed in models used for preclinical validation, linking discovery to functional outcomes.
- Mechanistic De-risking: Facilitates biomarker alignment by detecting proteins with conserved domains or interaction profiles, such as the Raf-1 interactor, enabling pathway-level validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing proteins missed in conventional annotations, reducing late-stage biological surprises.
Pipeline & Workflow Integration
OpenProt integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization, enhancing proteome-wide screening with minimal bioinformatics overhead.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying proteins from non-canonical ORFs that may modulate disease-relevant signaling networks.
- Screening: Enhances assay readiness and quantitative output reliability by enabling comprehensive database searches with controlled FDR, improving detection of low-abundance or novel targets.
- Analytics: Generates peptide spectrum matches, protein identification, and quantification data that allow cross-condition comparison and target validation.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by identifying proteins with conservation, domain architecture, or interaction evidence relevant to human biology.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic knowledge base across species and projects, reducing redundant database curation efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by revealing the polycistronic nature of eukaryotic genes and reducing false negatives in proteomic discovery.
- Operational Value: Promotes standardization and scalability through freely accessible, species-specific protein databases compatible with mainstream proteomics tools.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier identification of high-confidence novel targets, reducing investment in false leads.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by expanding the target space with evidence-based novel proteins, informing advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires basic proteomics expertise in mass spectrometry data handling and database searching, though no advanced bioinformatics skills are needed.
- Necessitates access to proteomics tools capable of importing FASTA databases and running search engines like X!Tandem with custom workflows.
- Demands cross-team standardization on FDR thresholds and database versions (e.g., OpenProt_all vs OpenProt_2_pep) to ensure reproducibility across studies.
- Involves adaptation considerations when applying the database to non-model organisms or specialized sample types, guided by evidence level selection.
- Includes practical limitations such as increased database size requiring stringent FDR settings to maintain identification confidence, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:52
OpenProt Database Download
1:53
Database Handling
2:41
Mass Spectrometry File Preparation
3:13
Protein Quantification
4:13
Quality Control and OpenProt Database Mining
5:25
Results: Representative Interactor and Mass Spectrometry Identification of a Novel Protein
6:40
Conclusion
