Verwenden von Microtiter Dish Radiolabeling für mehrere In-Vivo-Messungen von Escherichia coli (p)ppGpp gefolgt von dünnschichtiger Chromatographie

Diese Methode misst das Niveau der globalen Regulierungsbehörde ppGpp unter verschiedenen Wachstumsbedingungen und Stresssituationen. PpGpp kann in gram positiven und negativen Bakterien gefunden werden, sowie in Chloroplasten. PpGpp hat einen schnellen Beginn in Sekunden, die zu einer schnellen zweiten Beziehung führen, sobald Spannung erzeugt wird.

Gleichzeitig hat es eine kurze Halbwertszeit, bis zu 30 Sekunden. Daher ist es notwendig, viele Kultur in Zeitintervallen zu überwachen, die von 10 Sekunden bis Stunden variieren können, einschließlich betonter Übergänge. Wir radiolabel Bakterienkulturen in Mikrotiter-Gerichten ermöglicht probenmit hohem Durchsatz, die mehrere technische und biologische Replikationen ermöglichen.

Achten Sie bei der Arbeit mit radioaktiven Stoffen darauf, die richtigen Sicherheitsmaßnahmen zu befolgen. Bereiten Sie alle Medien wie im Textprotokoll beschrieben vor, um mit diesem Verfahren zu beginnen. Wachsen Sie Übernachtkulturen in MOPS-Medien mit drei Millimolaren-Natriumphosphat.

Fügen Sie 550 Mikroliter MOPS-Medien, die 0,2 mikromolaren Natriumphosphatträger und 30 Mikroliter jedes bakteriellen Inokulums zu den Brunnen einer 24-Well-Platte. Dies führt zu einem anfänglichen Inokulum mit einem OD600 von 0,1. Fügen Sie frische Medien zu einem sowie eine Sterilitätskontrolle hinzu.

Legen Sie die Platte in einen Schüttelninkubator bei 37 Grad Celsius, schütteln Sie bei 900 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten. Das Wachstum kann mit einem Plattenleser mit einer Replizierungsplatte parallel in Medien ohne p32 überwacht werden, wobei ein Plattenleser während der Inkubation unter den gleichen Bedingungen inkubiert wird. Als nächstes fügen Sie 100 Mikrocuries p32-Orthphosphat zu jedem Brunnen der Platte hinzu.

Wachsen Sie die Kulturen in einem schütteren Inkubator für ein bis zwei Verdoppelungen, damit externe Etiketten weitgehend mit interzellulären Nukleotidbecken gleichgesetzt werden können. Für die korrekte Visualisierung wurde in diesem Video kein aktives Material verwendet. In einem echten Experiment ist eine ordnungsgemäße Abschirmung sowie eine ständige Überwachung der Kontamination mit einem Vermessungsmesser erforderlich.

Erstens, induzieren Stress mit einer Methode geeignet für die Art von Stress untersucht. Als nächstes fügen Sie 20 Mikroliter jeder beschrifteten Zellprobe in eine separate 0,2 Milliliter PCR-Röhre, die 20 Mikroliter eiskalte sechs Molar-Ameisensäure enthält. Die Proben sofort auf Trockeneis legen.

Verbessern Sie die Effizienz der zellulären Extraktion um drei Zyklen des Einfrierens und Auftauens. Kurz vor der Erkennung pei Zellulose Dünnschicht Chromatogramme, Zentrifugieren Sie die Proben für eine Minute mit maximaler Geschwindigkeit, um Zellablagerungen zu pellet. Legen Sie zunächst eine 20 mal 20 Zentimeter große PEI-Zellulose-TLC-Platte fest.

Verwenden Sie eine Schere, um die oberen fünf Zentimeter zu entfernen. Und verwenden Sie einen weichen Bleistift, um eine Ursprungslinie einen Zentimeter vom Rand zu markieren. Tragen Sie ein Fünf-Mikroliter-Tröpfchen jeder Probe auf die PEI-Oberfläche auf.

Bevor der Fleck trocknen kann, übertragen Sie die Platte in einen Tank, der eine Schicht aus 1,5 molarem Monokaliumphosphat enthält, die flach genug ist, um den Ursprungsprobenfleck nicht zu berühren. Bedecken Sie den Tank mit einer luftdichten Dichtung und lassen Sie den flüssigen Aufstieg an die Spitze des 15 Zentimeter großen getrimmten Blechs zu. Danach das ausgereifte Chromatogramm entfernen und bei Raumtemperatur an die Luft trocknen.

Schneiden und entsorgen Sie den oberen Teil des Chromatogramms, das den freien P32 enthält, in radioaktiveabfälle. Verwenden Sie einen Phosphorbildschirm, um die radioradiographischen Filme über Nacht auszusetzen. Entwickeln Sie am nächsten Tag den Film und verwenden Sie einen Phosphorimager, um das grüne Signal des Phosphors zu erfassen und zu quantitieren.

Verwenden Sie dann die ImageJ-Software, um die radioaktiven Flecken zu quantifizieren. Nach der Provokation von Stress oder Hunger für die Zeit ausreichend, um ppGpp Akkumulation zu ermöglichen, verwenden Sie eine geeignete Methode, um die Spannung umzukehren. Nehmen Sie alle 20 bis 30 Sekunden proben und verarbeiten Sie die Proben wie zuvor beschrieben.

Sobald der TLC entwickelt ist und die ppGpp-Ebenen während des Zeitverlaufs erhalten sind, zeichnen Sie den verbleibenden ppGpp-Gehalt auf einem semilogarithmischen Plot im Vergleich zur Zeit. In dieser Studie werden Zellen, die in MOPS angebaut werden und alle Aminosäuren mit Ausnahme von ILV enthalten, mit P32 gekennzeichnet. Nach der Beschriftung wird L-Valin zur Herstellung von Isoleucin-Hunger hinzugefügt.

Nach fünf Minuten kam es zu einem zweieinhalbjährigen Anstieg der Tetra- und Pentaphosphatspiegel von Guanosin. Eine negative Kontrolle einer zellfreien beschrifteten Probe wird verwendet, um mögliche Verbindungen zu erkennen, die nicht orthophosphat in der P32-Quelle sind. Die Umkehrung des Isoleucin-Hungers kann durch Chloramphenicol erreicht werden, ein Inhibitor der Proteinsynthese, der den Verbrauch von geladenem Isoleucin tRNA reduziert und wiederum hohe Verhältnisse von geladener zu ungeladener tRNA wiederherstellt.

Die Aktivierung der stark rela-vermittelten ppGpp-Synthetase wird abgeschafft, was ein Maß der ppGpp-Degradation ungestört durch Restsynthese ermöglicht. In diesem Fall zerfällt ppGpp mit einer Halbwertszeit von ca. 64 Sekunden. Es ist wichtig, die Zellen für ein paar Generationen wachsen zu lassen, um eine gleichmäßige Kennzeichnung zu erreichen, bevor Stress oder Hunger induzieren.

Da ppGpp unter Bakterien weit verbreitet ist, kann diese Methode auf andere Organismen angewendet werden. Eine Änderung der TLC-Entwicklungsmethode könnte die ordnungsgemäße Trennung aller regulatorischen Nukleotide wie ppApp ermöglichen. P52 ist ein besseres Emitter-Isotop, daher ist es wichtig, die richtige Abschirmung zu verwenden und Rückstände ordnungsgemäß zu entsorgen.