Name: Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Erfahren Sie, wie CFDA in Arabidopsis-Wurzeln und Hypokotyle geladen wird, um den interzellulären Transport und die Phloemaktivität zu untersuchen. Diese Methode visualisiert die Verteilung von Carboxyfluorescein in den Sprossgeweben.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31671257) und dem Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry (LXT-16-18) finanziert.

1. Arabidopsis vertikales Wachstum im MS-Medium
<ol><li>Das Innere des Laminarstromschrankes muss vor dem Gebrauch mit 30 min UV-Licht und 15 Minuten Luftstrom behandelt werden. Achten Sie darauf, die Glastür zu schließen, wenn UV-Licht eingeschaltet ist. Sprühen Sie alle Werkzeuge und Platten mit 70% Ethanol, bevor Sie sie in den Schrank legen.</li>
	<li>Bereiten Sie das Murashige und Skoog (MS) Medium in einer Standard-Petrischale mit 90 mm Durchmesser unter einem laminaren Fließschrank vor. NOTE: Das MS-Medium enthält folgende Komponenten: 20,6 mM NH4 NO3, 18,8 mM KNO 3, 1.25 mM KH2PO4, 1.5 mM MgSO4 · 7H 2 O, 3 mM CaCl2· 2H2 O, 0,1 mM MnSO4· H2 O,1.03 μMNa2MoO4· 2H2 O,0,1 mMH3 BO3, 30 μM ZnSO 4 · 7H 2 O, 0,1 μM CuSO4 · 5H 2 O, 0,1 μM CoCl2 · 6H 2 O, 1.39 μM KI, 97, M FeSO4·7H2O, 114.5 μM Ethylenediaminetetraacetikinsäure (EDTA), 4.07 μM Nikotinic Acid, 2.44 μM Pyridoxin HCl, 0,15 μM Thiamin HCl, 2,68 mM Glycin, 555 μM myo-inositol, 87,7 mM Saccharose und 10 g/L Agar.</li>
	<li>Die sterilisierten Spitzen oder Zahnstocher anfeuchten, indem Sie die Spitze oder Zahnstocher auf das MS-Medium berühren, dann die sterilisierten Samen einzeln auf die feste Position jedes Petrischellers tauchen, das durch die Aussaatkarte angezeigt wird.</li>
	<li>Die Petrischale mit Paraffinfolie und Klebeband versiebenhalten und vertikal auf einen klaren Stand in einem Wachstumsraum (22 ° C, 70% Feuchtigkeit) mit einem Tageszyklus von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit (Beleuchtung von 6 bis 22 Uhr) legen. Die Arabidopsis-Anlage ist nach der Aussaat am Tag 9-13 für die CFDA-Verladung bereit. Achtung: Die folgende Prozedur wird am Nachmittag von 14 bis 17 Uhr durchgeführt.</li>
</ol>2. CFDA-Verladung mit dem Wurzelschneideverfahren
<ol><li>Bereiten Sie sofort vor dem Einsatz eine neue CFDA-Arbeitslösung vor. Die 1 mM CFDA Lagerlösung, die in-20 ° C Gefrierschrank mit sterilem ultrarem Wasser gelagert ist, verdünnen Sie eine Arbeitskonzentration von 5 μM.</li>
	<li>Die mikroporöse Paraffin-Membranfolie (siehe Materialtabelle) in kleine Stücke von 3 mm x 3 mm schneiden.</li>
	<li>Entdecken Sie die wachsenden Pflanzen im Raum bei 22 ° C und löschen Sie die überschüssige Feuchtigkeit mit einem Papiertuch. Legen Sie die kleinen Filmstücke unter jede Wurzel. Hinweis: Von diesem bis zu Schritt 2.6 sollte der gesamte Prozess innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen sein.</li>
	<li>Die Pflanzen auf den Petrischülel heben. Schneiden Sie die Wurzeln in einer Position von 5-10 mm unter dem Wurzel-Hypokotyl-Kreuz. Legen Sie den Dreh auf den Film auf das Medium zurück.</li>
	<li>Unter einem Trennmikroskop werden vorsichtig 0,25 μL CFDA auf das Schneidende jeder Wurzel aufgetragen. Vermeiden Sie es, auf andere Pflanzenteile zu spritzen.</li>
	<li>Die Platte bedecken und die Pflanzen 2-3 h im Wachstumsraum unter Licht lassen.</li>
	<li>Spülen Sie die gebeizten Pflanzen dreimal sequenziell in drei separaten Bechern, die mit destilliertem Wasser gefüllt sind, und beobachten Sie dann die Pflanzen unter einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop mit Zoom von 1,4 x bis 3,3x (siehe Materialliste). Für die Fluoreszenzerkennung verwenden Sie einen hocheffizienten Filterwürfel (470/20 nm Anregung, 495 nm Split und 525/50 nm Emission), der montiert wird, um das Fluoreszenzsignal zu übertragen.</li>
</ol>3. CFDA Verladung mit Hypocotyl-Kneigeverfahren
<ol><li>Bereiten Sie sofort vor dem Einsatz eine neue CFDA-Arbeitslösung vor. Die 1 mM CFDA Lagerlösung, die in-20 ° C Gefrierschrank mit sterilem ultrarem Wasser gelagert ist (siehe Materialtabelle), wird auf eine Arbeitskonzentration von 5 μM geparkt.</li>
	<li>Die mikroporöse Paraffin-Membranfolie (siehe Materialtabelle) in kleine Stücke von 3 mm x 3 mm schneiden.</li>
	<li>Entdecken Sie die wachsenden Pflanzen im Raum bei 22 ° C und löschen Sie die überschüssige Feuchtigkeit mit einem Papiertuch. Hinweis: Von diesem bis zum Schritt 3.7 sollte der gesamte Prozess innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen sein.</li>
	<li>Legen Sie ein kleines Stück Film unter die Wurzel-Hypocotyl-Knotenpunkt jeder Pflanze.</li>
	<li>Verwenden Sie Zangen, um das Hypokotyl in der Nähe des Wurzel-Hypokotyl-Knokls unter einem sich abgetrennten Mikroskop sanft zu kneifen.</li>
	<li>Unter einem Abschnittmikroskop vorsichtig 0,1 μL CFDA auf die Wundstelle auftragen. Vermeiden Sie es, auf andere Pflanzenteile zu spritzen.</li>
	<li>Bedecken Sie die Platte und lassen Sie die Pflanzen unter Licht (22 ° C) für 2-3 h.</li>
	<li>Spülen Sie die gebeizten Pflanzen dreimal sequenziell in drei separaten Bechern, die mit destilliertem Wasser gefüllt sind, und beobachten Sie dann die Pflanzen unter einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop mit Zoom von 1,4 x bis 3,3x (siehe Materialliste). Für die Fluoreszenzerkennung sollten Sie einen hocheffizienten Filterwürfel (470/20 nm Anregung, 495 nm Split und 525/50 nm Emission) montieren, um das Fluoreszenzsignal zu übertragen.</li>
</ol>

<ol><li>Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%285%29Carboxyfluorescein+as+a+tracer+of+phloem+sap+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation.</a> American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).</li>
<li>Wright, K. M., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+probe+HPTS+as+a+phloem-mobile%2C+symplastic+tracer%3A+an+evaluation+using+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy.</a> Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+Lucifer+Yellow+CH+in+potato+tuber+storage+tissues%3A+A+comparison+of+symplastic+and+apoplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport.</a> Planta. 176 (4), 533-540 (1988).</li>
<li>Knoblauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Phloem-Mobile+Probes%3A+Properties+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications.</a> Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).</li>
<li>Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+phloem+unloading+in+the+root+tip+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).</li>
<li>Viola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberization+in+Potato+Involves+a+Switch+from+Apoplastic+to+Symplastic+Phloem+Unloading%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading.</a> The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).</li>
<li>Roberts, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Nicotiana+benthamiana%3A+Comparison+of+a+Fluorescent+Solute+with+a+Fluorescent+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus.</a> The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).</li>
<li>Péron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+Phloem+Unloading+and+Expression+of+Sucrose+Transporters+in+Vegetative+Sinks+of+the+Parasitic+Plant+Phelipanche+ramosa+L+%28Pomel%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel).</a> Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).</li>
<li>Spallek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+hormonal+control+of+host+root+morphology+by+parasitic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).</li>
<li>Complainville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodule+initiation+involves+the+creation+of+a+new+symplasmic+field+in+specific+root+cells+of+medicago+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species.</a> The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).</li>
<li>Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+fluorescent+dyes+Lucifer+Yellow+%28LYCH%29+and+carboxyfluorescein+%28CF%29+in+Medicago+truncatula+Gaertn.+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules.</a> Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).</li>
<li>Robards, A. W., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+and+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).</li>
<li>Roberts, A. G., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+and+the+control+of+symplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata and the control of symplastic transport.</a> Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).</li>
<li>Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-coupling+in+the+root+epidermis+of+Arabidopsis+is+progressively+reduced+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development.</a> Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).</li>
<li>Palevitz, B. A., Hepler, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+dye+coupling+of+stomatal+cells+of+Allium+and+Commelina+demonstrated+by+microinjection+of+Lucifer+yellow%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow.</a> Planta. 164 (4), 473-479 (1985).</li>
<li>van Bel, A. J. E., Kempers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+isolation+of+the+sieve+element-companion+cell+complex+in+the+phloem+of+Ricinus+communis+and+Salix+alba+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems.</a> Planta. 183 (1), 69-76 (1991).</li>
<li>Erwee, M. G., Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplast+domains+in+extrastelar+tissues+of+Egeria+densa+Planch%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch.</a> Planta. 163 (1), 9-19 (1985).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+communication+between+primary+and+developing+lateral+roots+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).</li>
<li>Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Unidirectional+Flow+through+Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata.</a> Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).</li>
<li>Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+symplasmic+domains+in+the+embryo+and+seed+of+Sedum+acre+L.+%28Crassulaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae).</a> Planta. 245 (3), 491-505 (2017).</li>
<li>Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+Arabidopsis+spreads+from+the+root+to+the+shoot%2C+through+a+gating+barrier%2C+by+template-dependent%2C+non-vascular%2C+cell+to+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement.</a> Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).</li>
<li>Radford, J. E., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tissue-preparation-induced+callose+synthesis+on+estimates+of+plasmodesma+size+exclusion+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits.</a> Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).</li>
<li>Kollist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Responses+to+Abiotic+Stress%3A+Priming+the+Landscape+for+the+Signal+Transduction+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network.</a> Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).</li>
<li>Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Symplastic+Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley.</a> Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).</li>
<li>Botha, C. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xylem+sap+retrieval+pathway+in+rice+leaf+blades%3A+evidence+of+a+role+for+endocytosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?</a> Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Aufstrebende Studien haben gezeigt, dass Pflanzen schnell auf äußere Reize23reagieren können, einschließlich Manipulationen, diein die experimentellen Verfahren eingeführt werden 22. In unserem ersten Experiment führt unsere Aufsicht über dieses Wissen oft zu einem Ferkeln. Mit diesen Lektionen schlagen wir vor, dass bei der Durchführung dieses Experiments folgende Vorsichtsmaßnahmen im Auge behalten werden: (1) die Samen nach der Ernte sollten in einem Aufbewahrungsschrank...

Viele fluoreszierende Tracer mit einer Reihe von spektralen Eigenschaften, wie 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1,8Hydroxypyren-1,3,3,6-Trisulphonsäure2, Luzifer gelb CH (LYCH)3, Esculin und CTER4, wurden entwickelt und In Pflanzen zur Überwachung der Bewegung und der Phloem-Aktivität. In der Regel wird ein Symplastikfarbstoff in einen Schnitt im Zielgewebe geladen und die sequenzielle Zerstreuung des Reporters in andere Teile der Anlage wird die interzelluläre Kommunikation demonstrieren. Obwohl der Mechanismus der Farbstoffaufnahme nicht vollständig verstanden ist, ist das Prinzip, das der CF-Bewegung in lebenden Zellen zugrunde liegt, weithin anerkannt. Die Ester-Form von CF (CF Diacetat, CFDA) ist nicht fluoreszierend, aber membrandurchlässig. Diese Eigenschaft ermöglicht eine schnelle Membrandiffusion des Farbstoffs in Zellen. Einmal in lebenden Zellen, intrazelluläre Estoren entfernen die Acetatgruppen an der 3 ' und 6 ' Position der CFDA und lösen die fluoreszierende und membranundurchlässige CF (Abbildung1, alternativ Wright et al.2); CF kann sich dann durch die Plasmodesmata zu anderen Pflanzenteilen bewegen.
Ein etabliertes Verfahren mit CFDA ist, dass es in Quellblätter geladen werden kann und verwendet werden kann, um das Phloem-Streaming und die Phloem-Entladung im Spülgewebe vieler Arten zu überwachen, z.B. wie CF Entladen in der Arabidopsis-Wurzel 5, Phloem-Entladung Während der Kartoffeltuberisation6, Phloem-Entladung in der Nicotiana-Spüle Blätterblätter7, und so weiter. Durch ähnliche Ladeansätze haben andere Studien diesen Farbstoff übernommen, um die symplastische Verbindung zwischen Wirt und Parasit8,9zudemonstrieren oder die symbiotischen Beziehungen10, 11 aufzudecken.
Eine andere Möglichkeit, diesen Farbstoff zu verwenden, besteht darin, ihn mittels Mikroinjektion in bestimmte Zellen oder einzelne Zellen zu laden, um sein Verteilungsmuster zu bestimmen. Solche ausgeklügelten Techniken haben unser tieferes Verständnis von plasmodesmata-vermittelter interzellulärer Kommunikation erheblich erleichtert, insbesondere bei der Entwicklung des Konzepts dersymplastischen Domäne 12,13. Zum Beispiel führte die Mikroinjektion von CFDA in Cotyyledon-Zellen von Arabidopsis zu dem Farbkupplungsmuster in der Hypokotyl-Epidermis, aber ohne Kopplung in den darunterliegenden Zellen oder in der Wurzelepidermis, daher bildet die Hypocotyl-Epidermis eine Symplastik-Domain14. Ähnliche Domänen, wie die Stomatalwachszellen 15, Siebelement-Begleitzellen 16, Wurzelhaarzellen14 und Wurzeldeckel 17,18wurden durch Mikroinjektionstechnikidentifiziert. Am erstaunlichsten ist, dass sich einige Domains in eine bestimmte Richtung bewegen können. Nehmen wir zum Beispiel die Trichom-Domäne: Die Mikroinjektion einer Leuchtstoffarzene in die tragende Epidermzellzelle führt zum Tracer-Fluss in die Trichome-Domäne,die Reverse Injektion hält jedoch nicht bei 19. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht hat auch ähnliche Situationen in den symplastischen Domänen des Sedum Embryo20 gefunden. So implizieren alle oben genannten Fälle, dass der Austausch von Ladestationen zu neuartigen Erkenntnissen in die Symplastik-Kommunikation führen kann. Unser vorheriges Experiment, den Weg des robo-to-shoot mobilen Schweigens zu zerlegen, identifizierte eine neuartige Symplastik-Domäne oder die HEJ-Zone (Hypocotyl-Epicotyl-Knotenpunkt), die durch die Wurzelbelastung (nicht-kanonische Sink-Belastung) CFDA weiter verifiziert wurde. Experiment21. Hier erarbeiten wir die Wurzel-zu-Shof-CF-Bewegung mit einer einfachen Methode weiter und erhalten durch die Verschiebung der Ladestationen eine mögliche Symplastik-Domäne. Darüber hinaus kann dieses Verfahren an die Differenzierung genetischer Hintergründe angepasst werden, die den Fernverkehr verändert haben.

<table><tbody><tr><td>KNO3&nbsp; &nbsp;</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&middot; H2O&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10019818</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10024018</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H2O</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&middot; 7H2O</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10009717</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10017018</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Myo-Inositol &nbsp;</td><td>MACKLIN</td><td>I811835</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinsäure&nbsp;</td><td>MACKLIN</td><td>N814565</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxin HCl</td><td>MACKLIN</td><td>V820447</td><td></td></tr><tr><td>Thiamin HCl</td><td>MACKLIN</td><td>T818865</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>MACKLIN</td><td>G800880</td><td></td></tr><tr><td>Agar Pulver</td><td>Novon</td><td>ZZ14022</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom V16</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>SDPTOP</td><td>SRE-1030</td><td></td></tr><tr><td>200&mu; l Pipette</td><td>Dragon Laboratory Instruments</td><td>713111110000-20-200ul</td><td></td></tr><tr><td>2.5&mu; l Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette&nbsp;</td><td>PINZETTE</td><td>ST-15</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Doppelseitige Klinge aus Edelstahl</td><td>Gillette</td><td>Platinum-Plus Doppelklinge</td><td></td></tr></tbody></table>

shootward movement of cfda tracer loaded in the bottom sink tissues of arabidopsis

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

Der Symplastik-Tracer 5 (6)-carboxyfluorescein Diacetat (CFDA) wurde in lebenden Pflanzen weit verbreitet eingesetzt, um die interzelluläre Verbindung, den Phloemtransport und das Gefäßmuster zu demonstrieren. Dieses Protokoll zeigt die Bewegung von unten nach oben (CF) in der Arabidopsis , indem das Wurzelschneiden bzw. das Hypokotyl-Kipingverfahren verwendet wird. Diese beiden verschiedenen Verfahren führen zu unterschiedlichen Wirkungsgraden der CF-Bewegung: Etwa 91% des Erscheinungsbildes von CF in den Triebe mit dem Hypokotyl-Knicken, während nur etwa 70% des Erscheinungsbildes von CF mit dem Wurzelschneideverfahren. Die einfache Änderung der Ladestationen, die zu erheblichen Veränderungen in der mobilen Effizienz dieses Symplastikfarbstoffs führt, deutet darauf hin, dass CF-Bewegung der Symplastik-Regelung unterliegen könnte, wahrscheinlich durch die Knotenhypokotyl-Kreuzung.

Die Bewegung von Symplastic ist häufig Umweltschwankungen unterworfen. Die Störung des Pflanzenanbauzustandes, und auch der Prozess der Gewebeaufbereitung wird die Größe der Ausschlussgrenze von Plasmodesmata beeinflussen, wodurch sichder Symplastik-Transport 22. Um die Färbung zu verbessern, beschränken wir unseren Betrieb auf den Wachstumsraum, in dem Temperatur und Feuchtigkeit streng kontrolliert werden, und führen auch das gesamte Verfahren so schnell wie mögl...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie man den CFDA in verschiedene Standorte der unteren Teile von Arabidopsis zuladen. Wir stellen dann das resultierende Verteilungsmuster von CF in den Triebe vor.

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, ...

Die weit verbreitete Sonde CFDA, kurz für Carboxyfluorescein-Diacetat, ist nicht fluoreszierend. Die beiden H3-Gruppen und die 3'6'Position auf dieser Verbindung machen sie membranpermeant. Wo einmal in den Zellen, interne zelluläre Acetate werden die Acetat-Gruppen entfernen und die neue Form von CFDA freisetzen.Das ist ein Carboxyfluorescein, oder das CF, das fluoreszierend ist. Und weil diese neue Form weniger membranpermeant ist, das Gewicht, alle Zellen sollen sich durch die interzellulären Poren oder die Plasmodesmata in Pflanzen bewegen, das macht dieses Diacetat zur idealen Sonde, um den interzellulären Transport in Phloemaktivität zu untersuchen. Im heutigen Video werden wir die CFD-Belastung in die Wurzel bzw. Hypocotyl der Arabidopsis-Pflanzen demonstrieren, und wir werden zeigen, wie sich die beiden leicht unterschiedlichen Verfahren auf die Bewegung von unten nach oben dieser fluoreszierenden Sonde auswirken.Erzielen Sie die Färbung Ergebnisse konsequent, speichern wir die geernteten Arabidopsis Samen in vier Grad Celsius, 40% Feuchtigkeit Schrank. Neu geerntete Samen, die in diesem Zustand für mehr als sieben Tage gelagert werden, werden leicht für die Aussaat verwendet. Um sicherzustellen, dass jede Pflanze in einem relativ ähnlichen Raum in der Petrischale angebaut wird, verwenden wir eine Samenzonenkarte.Jetzt die sterilisierte Spitze benetzen, in die sterilisierten Samen eintauchen und die Samen einsaimmern nacheinander auf der vorgesehenen Position. Nach der Aussaat die Petrischale mit Parafilm und Klebeband versiegeln, auf einen Petrischalenständer legen, damit sie vertikal wachsen kann. Hier sind die Werkzeuge, die wir in diesem Experiment verwenden werden.Bitte beachten Sie, dass wir den Farbstoff besser so schnell wie möglich laden sollten. Normalerweise beenden Sie den gesamten Prozess in 10 bis 15 Minuten. Bevor wir das CFDA-Ladeexperiment durchführen, bereiten wir immer eine frische CFDA-Lösung vor.Hierbei die ein Millimolar CFDA vor dem sofortigen Gebrauch in fünf Mikromolarkonzentrationen mit Wasser verdünnen. Schneiden Sie den Parafilm in kleine Stücke in drei mal drei Millimeter Größe. Da es Kondensation auf dem Deckel und boden der Petrischale gibt, müssen wir sie mit Papiertuch ausräumen, um zu vermeiden, dass Farbstoff herumfließt.Ein kleines Parafilmstück wird unter die Wurzel gelegt. Heben Sie die Pflanzen an und legen Sie sie auf den Deckel. Schneiden Sie die Wurzeln etwa fünf bis zehn Millimeter unter dem Hypocotyl.Nehmen Sie die Triebe zurück auf die kleinen Stücke von Parafilm. Tragen Sie nun vorsichtig einen Mikroliter CFDA auf das Schneidende der Wurzel auf. Versuchen Sie, eine Kontamination aller Protopflanzen zu vermeiden.Dann den Deckel bedecken und dann für zwei Stunden im Wachstumsraum lassen. Die Hypocotyl-Pinching-Methode. Das kleine Parafilmstück wird, wie bisher vorbereitet, unter die Wurzel-Hypocotyl-Kreuzung gestellt.Wir verwenden ein Forecep, um das Hypocotyl vorsichtig in der Nähe des Wurzelgewebes zu kneifen, und tragen sorgfältig 0,1 Mikroliter CFDA auf die eingeklemmte Seite auf und lassen die Pflanze für zwei Stunden. Die Fotos von neun bis zwölf Tage nach Zonenfärbepflanzen. Sie alle zeigen das vaskuläre Färbungsmuster sowohl in den Kotyledonen als auch in den wahren Blättern.Nur in einem sehr seltenen Fall zeigte das Cotyledonblatt ein halbblättriges Färbungsmuster. Im Grunde haben die beiden Methoden also keinen Unterschied im CF-Färbemuster gemacht, aber wenn wir Farbstoffe in immer mehr Pflanzen laden, stellen wir fest, dass die beiden Verfahren einen signifikanten Unterschied in der Effizienz ergeben. Mit der Root-Cut-Methode zeigen etwa 70% der Pflanzen das fluoreszierende Signal im Trieb.Aber die Effizienz kann mit der Hypocotyl-Pinching-Methode auf 91% erhöht werden. Wir haben auch die Root-Pinching-Methode ausprobiert, aber diese Methode führt zu einer noch geringeren Effizienz, es ist etwa 30%Daher scheint es der Weg, den Farbstoff zu laden, nicht für die Färbung Unterschied zu berücksichtigen. Der Unterschied liegt höchstwahrscheinlich in den Verladestellen, die durch eine symplastische Barriere getrennt werden könnten.Wir zeigten, wie wir die CFDA in die Arabidopsis-Wurzeln und Hypocotyl laden. Wir haben zwei leicht unterschiedliche Verfahren verwendet, und diese beiden leicht unterschiedlichen Verfahren führen zu signifikanten Unterschieden in dieser unteren bis oberen Sondenbewegung. Wir schlagen vor, dass diese Methode uns helfen könnte, eine potenzielle symplastische Barriere für wurzelabgeleitete Triebsignale zu identifizieren.

shootward-movement-cfda-tracer-loaded-bottom-sink-tissues

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Die molekulare Basis der räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen wird untersucht mit Hilfe von transgenen Pflanzen, die Gewebe-und Organ-spezifische Phytochrom Mängel aufweisen. Die Isolierung von spezifischen Zellen mit induzierter Phytochrom-Chromophor Abreicherung durch Fluorescence-Activated Cell Sorting gefolgt von Microarray-Analysen wird genutzt, um Gene in räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen beteiligt sind.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Makromolekulare Handel zwischen Pflanzenzellen können durch transiente Expression eines Fluoreszenz-markierten Proteins von Interesse und die Analyse ihrer intra-und interzelluläre Verteilung durch konfokale Mikroskopie beurteilt werden.

Ein Cell-to-cell Makromolekulare Transport Assay In Planta Verwendung Biolistic Bombardment

Wir beschreiben die Verwendung von Perfluordecalin als infiltrative Eindeckmedium. Dies ist eine einfache Methode zur Verbesserung der Tiefe der Bildgebung...

Eine einfache Methode zur Bildgebung Arabidopsis Leaves Mit Perfluordecalin als Infiltrative Imaging Medium

Zellspezifische Analyse<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Kultivierung von Arabidopsis-Keimlinge in der RootChip, ein Mikrofluidik-Imaging-Plattform, die eine automatisierte Kontrolle der Wachstumsbedingungen kombiniert mit mikroskopischen Wurzel Überwachungs-und FRET-basierten Messung der intrazellulären Metaboliten.

Zeitraffer-Fluoreszenz-Imaging von Arabidopsis Wurzelwachstum mit Rapid Manipulation der Root-Umgebung mit dem RootChip

Ca2 + Signalweg reguliert verschiedene biologische Prozesse in Pflanzen. Hier präsentieren wir Ansätze zur Überwachung abiotischen Stress induziert räumliche und zeitliche Ca 2 +-Signale in Arabidopsis Zellen und Geweben unter Verwendung der genetisch codierten Ca2 +-Indikatoren Aequorin oder Case12.

Mess räumliche und zeitliche Ca 2 + Signale in Arabidopsis-Pflanzen

Wir berichten über eine einfache und vielseitige Methode zur Durchführung von fluoreszierenden live-Imaging von Arabidopsis Thaliana Blätter über einen längeren Zeitraum hinweg. Wir verwenden eine transgene Arabidopsis -Pflanze mit dem Ausdruck einer fluoreszierenden Reporter-gen unter der Kontrolle von einer Immunität im Zusammenhang mit Promoter als Vorbild für die räumlich-zeitliche Verständnis der Pflanze Immunantworten.

Eine vielseitige Methode für die Montage von Arabidopsis verlässt für intravitalen Zeitraffer Aufnahmen

Die Übersetzung der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) bietet die Möglichkeit, Entwicklungsprogramme mit minimaler Verarbeitung von Organen und Geweben zu sezieren. Das Protokoll liefert hochwertige RNA aus Zellen, die mit einem grünen fluoreszierenden Protein (GFP)-markierten ribosomalen Untereinheit begezielt sind. Nachgeschaltete Analysewerkzeuge wie qRT-PCR oder RNA-seq zeigen Gewebe- und zelltypspezifische Expressionsprofile auf.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

Extrazelluläre Glutamat-ausgelöste systemische Kalziumsignalisierung ist entscheidend für die Induktion von pflanzlichen Abwehrreaktionen auf mechanische Wunden und Pflanzenfresserangriffe in Pflanzen. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die räumliche und zeitliche Dynamik dieser beiden Faktoren mit Arabidopsis thaliana-Pflanzen zu visualisieren, die kalzium- und glutamatempfindliche fluoreszierende Biosensoren exprimieren.

Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei Arabidopsis

Hier werden mehrere häufig verwendete Methoden vorgestellt, um die Membrantransportereignisse einer Plasmamembranrezeptorkinase zu untersuchen. Dieses Manuskript beschreibt detaillierte Protokolle, einschließlich der Vorbereitung des Pflanzenmaterials, der pharmakologischen Behandlung und der konfokalen Bildgebung.

Bildbasierte Methoden zur Untersuchung von Membrantransportereignissen in stomatalen Zellen

Erfahren Sie, wie CFDA in Arabidopsis-Wurzeln und Hypokotyle geladen wird, um den interzellulären Transport und die Phloemaktivität zu untersuchen. Diese Methode visualisiert die Verteilung von Carboxyfluorescein in den Sprossgeweben.

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

Weitere Videos entdecken