Name: Studium der Cryptosporidium-Infektion in 3D-Gewebe-abgeleiteten Human Organoid Culture Systems durch Mikroinjektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Lernen Sie die Mikroinjektion von Cryptosporidium parvum in humane Darm- und Luftwegs-Organoide. Diese Methode ermöglicht präzise Studien zu Wirt-Pathogen-Interaktionen in 3D-Gewebemodellen.

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Wir danken Deborah A. Schaefer von der School of Animal and Comparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, USA, dass sie uns bei der Herstellung und Analyse von Oozysten geholfen hat. Wir danken auch Franceschi Microscopy and Imaging Center und D.L. Mullendore an der Washington State University für die TEM-Vorbereitung und Bildgebung von isolierten organoiden Oozysten.
D.D. erhält ein VENI-Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. erhält ein VENI-Stipendium der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO-ALW, 863.14.002) und wurde von Marie-Curie-Stipendien der Europäischen Kommission unterstützt (Vorschlag 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). Die Zu diesen Ergebnissen führenden Forschungsarbeiten wurden vom Europäischen Forschungsrat im Rahmen des ERC Advanced Grant Agreement Nr. 67013 und des NIH NIAIH unter R21 AT009174 bis RMO gefördert. Diese Arbeit ist Teil des Oncode-Instituts, das zum Teil von der Niederländischen Krebsgesellschaft finanziert und durch ein Stipendium der Niederländischen Krebsgesellschaft finanziert wurde.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Kultur von Cryptosporidium Parasiten in Darm- und Atemwegsorganoiden bietet ein genaues Modell, um Wirt-Parasiten-Wechselwirkungen zu studieren10, hat aber auch viele andere Anwendungen. Zum Beispiel erfordern die aktuellen Methoden zur Auswahl und Verbreitung genetisch veränderter Cryptosporidium-Parasiten die Durchfahrt in Mäuse19, die keine Isolierung von Parasiten zulässt, die für eine In-vivo-Infektion wesentliche Modifikationen aufweisen. Organoidkul...

Die Entwicklung von Medikamenten oder Impfstoffen zur Behandlung und Vorbeugung von Cryptosporidium-Infektionen wurde durch das Fehlen von In-vitro-Systemen behindert, die die In-vivo-Situation beim Menschen genau nachahmen1,2. Viele der derzeit verfügbaren Systeme erlauben entweder nur eine kurzfristige Infektion (<5 Tage) oder unterstützen nicht den gesamten Lebenszyklus des Parasiten3,4. Andere Systeme, die die vollständige Entwicklung des Parasiten ermöglichen, basieren auf verewigten Zelllinien oder Krebszelllinien, die die physiologische Situation beim Menschen nicht getreu rekapitulieren5,6,7 . Organoide oder "Mini-Organe" sind 3D-Gewebe abgeleitete Strukturen, die in einer extrazellulären Matrix mit verschiedenen gewebespezifischen Wachstumsfaktoren ergänzt angebaut werden. Organoide wurden aus verschiedenen Organen und Geweben entwickelt. Sie sind genetisch stabil und rekapitulieren die meisten Funktionen der Organe ihrer Herkunft und können in der Kultur für längere Zeit erhalten werden. Wir haben eine Methode zur Infizierung menschlicher Darm- und Lungenorganoide mit Cryptosporidium entwickelt, die ein genaues In-vitro-Modell für die Untersuchung von Wirtsparasiten-Wechselwirkungen bietet, die für die Darm- und Atemkryptosporidiose relevant sind8 ,9,10,11,12,13. Im Gegensatz zu anderen veröffentlichten Kulturmodellen ist das Organoidsystem repräsentativ für reale Wirtparasiten-Wechselwirkungen, ermöglicht die Vollendung des Lebenszyklus, so dass alle Stadien des Parasiten-Lebenszyklus untersucht werden können, und hält die Parasitenausbreitung aufrecht. für bis zu 28 Tage10.
Cryptosporidium parvum ist ein apicomplexan Parasit, der das Epithel der Atemwege und Darmtrakt infiziert, verursacht längere Durchfallerkrankungen. Die resistente Umweltstufe ist die Oozyste, die in kontaminierten Lebensmitteln und Wasser gefunden wird14. Nach der Ein- oder Einatmung exzyst die Oozyste und setzt vier Sporozoiten frei, die sich an Epithelzellen anheften. Sporozoiten gleiten auf Wirtszellen und greifen Wirtszellrezeptoren an, aber der Parasit dringt nicht vollständig in die Zelle ein und scheint die Wirtszelle dazu zu bringen, sie zu verschlingen15. Der Parasit, der in einem intrazellulären, aber extrazytoplasmatischen Fach verinnerlicht wird, verbleibt an der apikalen Oberfläche der Zelle und replizieren sich innerhalb eines parasitophorischen Vakuols. Es durchläuft zwei Runden asexueller Fortpflanzung – ein Prozess, der Merogonie genannt wird. Während der Merogonie entwickeln typ I Meronts, die acht Merozoiten enthalten, die freigesetzt werden, um in neue Zellen einzudringen. Diese Merozoiten dringen in neue Zellen ein, um sich zu Typ-II-Meronten zu entwickeln, die vier Merozoiten enthalten. Diese Merozoiten infizieren bei ihrer Freigabe Zellen und entwickeln sich zu Makrogamonts und Mikrogamonen. Mikrogamete werden freigesetzt und befruchten die Makrogameten, die Zygoten produzieren, die zu Oozysten reifen. Reife Oozysten werden anschließend in das Lumen freigesetzt. Oozysten sind entweder dünnwandige, die sofort exzyst, um das Epithel neu zu infizieren, oder dick wandgebunden, die in die Umwelt freigesetzt werden, um den nächsten Wirt14zu infizieren. Alle Stadien des Cryptosporidium-Lebenszyklus wurden in dem zuvor von unserer Gruppe10entwickelten Organoid-Kultursystem identifiziert.
Da menschliche Organoide das menschliche Gewebe9,11,13originalgetreu replizieren und alle replizierenden Stadien von Cryptosporidium10unterstützen, sind sie das ideale Gewebekultursystem zum Studium Cryptosporidium Biologie und Wirt-Parasiten-Wechselwirkungen. Hier beschreiben wir die Verfahren zur Infizierung von Organoiden mit Cryptosporidium-Oozysten und exzysierten Sporozoiten und zur Isolierung der neuen Oozysten, die in diesem Gewebekultursystem produziert werden.

<table><tbody><tr><td>Basalmembran-Extrakt (extrazelluläre Matrix)</td><td>amsbio</td><td>3533-010-02</td><td><stark>&nbsp; </td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo Antikörper (Oocyst-spezifischer Antikörper)</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLR-1X</td><td>Endkonzentration = Verwenden Sie 2-3 Tropfen/Objektträger</td></tr><tr><td>Crypto-Grab IgM-beschichtete Magnetbeads</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 15 Zahnstange</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12301D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 2 Gepäckträger</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12321D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EMD Millipore&nbsp; Isopore Polycarbonat-Membranfilter - 3&micro; m</td><td>EMD-Millipore</td><td>TSTP02500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Schneller grüner Farbstoff</td><td>SIGMA</td><td>F7252-5G&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Femtojet 4i Mikroinjektor</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glaskapillaren mit einem Durchmesser von 1 mm</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td>&<td>nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel (extrazelluläre Matrix)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrofugenröhrchen 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>T9661-1000EA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro-Loader-Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>612-7933</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher P-97</td><td>Verschlussinstrument</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Normales Eselsserum</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumhypoclorit (5% verwenden)</td><td>Clorox</td><td>50371478</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Super Stick Slides</td><td>Waterborne, Inc</td><td>S100-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Swinnex-25 47 mm Polycarbonat Filterhalter</td><td>EMD-Millipore</td><td>SX0002500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Taurocholsäure-Natriumsalzhydrat</td><td>SIGMA</td><td>T4009-5G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8221840500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmittel</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific industries, Inc</td><td>SI0236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td><stark>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</stark></td><td><stark>&nbsp; </stark></td><td><stark>&nbsp; </td><td>Endmenge</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 mL vorrätig in 500 mL DMEM</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL vorrätig in 500 mL DMEM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td>5 mL vorrätig in 500 mL DMEM</td></tr><tr><td><stark> INTESTINALE ORGANOID-OME (Expansionsmedien)</stark></td><td><stark>&nbsp; </stark></td><td><stark>&nbsp; </stark></td><td><stark>Endkonzentration</stark</td></tr><tr><td>>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>0,5 & Mikro; M</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>bis zu 100 mL herstellen</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006-1mg</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>NIC</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin CM</td><td>Im Haus*</td><td>&nbsp;</td><td>10 %</td></tr><tr><td>P38-Hemmer (SB202190)</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>10 &μm; M</td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Tocris</td><td>2296/10</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1 mL/500 mL Medium</td></tr><tr><td>RSpoI CM</td><td>Im Haus*</td><td>&nbsp;</td><td>20 %</td></tr><tr><td>Wnt3a CM</td><td>Im Haus*</td><td>&nbsp;</td><td>50%</td></tr><tr><td>Im Haus* - Zellleitungen werden auf Anfrage zur Verfügung gestellt</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td><STARK>DARM ORGANOID MEDIA-OMD (Differenzierungsmedien)</stark></td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>Zur Differenzierung von Organoiden wurden expandierende Dünndarm-Organoide sechs bis sieben Tage nach der Teilung in einem Wnt-reichen Medium gezüchtet und dann in einem Differenzierungsmedium (Entzug von Wnt, Nicotinamid SB202190, in einem Differenzierungsmedium (Entzug von Wnt, Nicotinamid, SB202190, Prostaglandin E2 aus einem Wnt-reichen Medium oder OME)</td></tr><tr><td>LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differenzierungsmedium)</td><td>&nbsp; </stark></td><td><stark>&nbsp; </stark></td><td><stark>Endkonzentration</stark></td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>bis zu 100 mL herstellen</td></tr><tr><td>ALK-I A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>0,0763888889</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>25 ng/ml</td></tr><tr><td>N-Acetylcystein</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>Direkt mit dem Unternehmen Kontakt aufnehmen</td><td>10%</td></tr><tr><td>p38 MAPK-I</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>1 &micro; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1:500</td></tr><tr><td>RhoKI Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817_100 mg</td><td>2,5 &micro; m</td></tr><tr><td>Rspo UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>Wenden Sie sich direkt an das Unternehmen</td><td>10</td></tr><tr><td>%Reduktionspuffer (zur Resuspension von Oozysten und Sporozoiten zur Injektion)</td><td>&nbsp; </stark></td><td><stark>&nbsp; </stark></td><td><stark>Endkonzentration</stark></td></tr><tr><td>L-Glutathion reduziert</td><td>Sigma</td><td>G4251-10MG</td><td>0,5 &mu; g/&mu; L von OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Betain</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td>0,5 &mu; g/&mu; L von OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>168149-2,5G</td><td>0,5 &mu; g/&mu; L OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Linolensäure</td><td>Sigma</td><td>L1376-10MG</td><td>6,8 &mu; g/mL von OME/OMD /LOM</td></tr><tr><td>Taurin</td><td></td><td>Sigma T0625-10MG</td><td>0,5 &mu; g/&mu; L von OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Blocking Puffer (für die Immunfluoreszenzfärbung)</td><td>&nbsp; </stark></td><td><stark>&nbsp; </td><td>Endkonzentration</td></tr><tr><td>Esel/Ziegenserum</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>2%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>70011044</td><td>Make to 100 mL</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P1379</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>Liste der verwendeten Antikörper </td><td>&nbsp; </stark></td><td><stark>&nbsp; </stark></td><td><stark>&nbsp; </td></tr><tr><td>Alexa 568 Anti-Kaninchen</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>Verdünnung-1:500; RRID: AB_143157</td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo Comprehensive Kit - Fluorescein-markierter Antikörper Crypto-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLK</td><td>Verdünnung - 1:200</td></tr><tr><td>Crypta-Grab IMS Beads - Magnetische Kügelchen beschichtet mit monoklonalen Antikörpern</td><td>reaktiv Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>Verdünnung - 1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Verdünnung - 1:1.000; RRID : AB_2629482</td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa 674</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>Verdünnung - 1:1.000; RRID: AB_2620155</td></tr><tr><td>Kaninchen-Anti-gp15-Antikörper, der von R. M. O' erzeugt wurde Connor (Co-Autor).</td><td>Auf Anfrage</td><td>Auf Anfrage</td><td>Verdünnung - 1:500</td></tr><tr><td>Sporo-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A600FLR-1X</td><td>Verdünnung - 1:200</td></tr></tbody></table>

studium der cryptosporidium-infektion in 3d-gewebe-abgeleiteten human organoid culture systems durch mikroinjektion

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Cryptosporidium parvum ist eine der Hauptursachen für menschliche Durchfallerkrankungen. Um die Pathologie des Parasiten zu verstehen und effiziente Medikamente zu entwickeln, ist ein In-vitro-Kultursystem erforderlich, das die Bedingungen im Wirt rekapituliert. Organoide, die den Geweben ihrer Herkunft sehr ähnlich sind, sind ideal für die Untersuchung von Wirtsparasiten-Wechselwirkungen. Organoide sind dreidimensionale (3D) Gewebe-abgeleitete Strukturen, die aus adulten Stammzellen abgeleitet werden und über einen längeren Zeitraum in kulturgemäß wachsen, ohne eine genetische Aberration oder Transformation zu durchlaufen. Sie haben eine gut definierte Polarität mit apikalen und basolateralen Oberflächen. Organoide haben verschiedene Anwendungen in Medikamententests, Bio-Banking, und Krankheitsmodellierung und Wirt-Mikroben-Interaktionsstudien. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, wie man die Oozysten und Sporozoiten von Cryptosporidium für die Infektion menschlicher Darm- und Atemwegsorganoide vorbereitet. Wir zeigen dann, wie Mikroinjektion verwendet werden kann, um die Mikroben in das Organoidlumen zu injizieren. Es gibt drei Hauptmethoden, mit denen Organoide für Wirt-Mikroben-Interaktionsstudien verwendet werden können: Mikroinjektion, mechanisches Scheren und Plattieren und durch die Herstellung von Monolayern. Die Mikroinjektion ermöglicht die Erhaltung der 3D-Struktur und ermöglicht eine präzise Kontrolle der Parasitenvolumina und den direkten apikalen Seitenkontakt für die Mikroben. Wir liefern Details für ein optimales Wachstum von Organoiden für die Bildgebung oder Oozystenproduktion. Schließlich zeigen wir auch, wie die neu erzeugten Oozysten aus dem Organoid für die weitere Weiterverarbeitung und Analyse isoliert werden können.

Die hier vorgestellten Protokolle führen zur effizienten Reinigung von Oozysten und Sporozoiten (Abbildung 1A) bereit für die Mikroinjektion. Das Excystationsprotokoll führt zur Freisetzung von Sporozoiten von ca. 70–80% der Oozysten, daher ist es wichtig, die verbleibenden Oozysten und Schalen durch einen 3-m-Filter herauszufiltern. Die Filtration führt zu einer fast 100% Sporozoitreinigung (Abbildung 1B). Darüber hinaus trägt die Zugabe eines grünen Farbstoffs...

Wir beschreiben Protokolle zur Vorbereitung von Oozysten und zur Reinigung von Sporozoiten zur Untersuchung der Infektion von menschlichen Darm- und Atemwegsorganoiden durch Cryptosporidium parvum. Wir zeigen die Verfahren für die Mikroinjektion von Parasiten in das Darmorganoidlumen und die Immunfärbung von Organoiden. Schließlich beschreiben wir die Isolierung der erzeugten Oozysten von den Organoiden.

Studium der Cryptosporidium-Infektion in 3D-Gewebe-abgeleiteten Human Organoid Culture Systems durch Mikroinjektion

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Mit diesem Sporozoit-Reinigungs- und Mikroinjektionsverfahren kann im Wesentlichen jede Wirtsmikrobe in jedem gewebeabgeleiteten Organsystem untersucht werden. Mit dieser Technik können wir die Menge an reinen Sporozoiten kontrollieren, die in das organoide Lumen oder die apikale Seite des Organoids injiziert werden. Um C.parvum sporozoite zu reinigen, übertragen Sie die Oozyste in ein 15-Milliliter-Rohr und suspendieren Sie die Zellen um ein mal 10 bis zur siebten Oozyste pro Milliliter-Excystation mittlere Konzentration.Nach 60 bis 90 Minuten bei 37 Grad Celsius 14 Milliliter einer geeigneten Waschlösung mit den Oozysten mischen und die Zellen durch Zentrifugation sedimentieren. Aspirieren Sie den Überstand sorgfältig, um zu vermeiden, Oozysten zu verlieren und setzen Sie das sporozoische Pellet dreimal 10 bis zur siebten Oozyste pro ein bis zwei Milliliter DMEM-Konzentration wieder aus. Um alle verbleibenden Oozysten und Schalen zu entfernen, legen Sie einen 10-Milliliter-Spritzenlauf mit einem 47-Milliliter-Filterhaltergerät, das mit einem Drei-Mikrometer-Porenfilter in Porengröße ausgestattet ist, in ein 15-Milliliter-Rohr bei vier Grad Celsius.7,5 Milliliter der Sporozoitsuspension in die Filterbaugruppe geben. Wenn das gesamte Volumen durch die Schwerkraft durch das Sieb gegangen ist, waschen Sie alle verbleibenden Zellen durch das Sieb mit weiteren 7,5 Milliliter DMEM. Wenn die gesamte Wäsche durch das Sieb gegangen ist, sammeln Sie die gefilterte Sporozoitsuspension durch Zentrifugation für 10 Minuten und beschriften Sie das Pellet in 50 bis 100 Mikroliter eines geeigneten organoiden Kulturmediums, ergänzt mit 0,05% schnellem grünen Farbstoff, und L-Glutathion, Betain, L-Cystein, Linolsäure und Taurin, die den reduzierenden Puffer enthalten.Um die Parasiten in die apikale Seite eines 3D-Organoids zu mikroinjizieren, verwenden Sie zunächst einen Mikropipette-Puller, um Glasinjektionskapillaren vorzubereiten. Verwenden Sie Zangen, um die Spitze der Kapillare auf einen Durchmesser von neun bis 12 Mikrometern zu schneiden, um einen einfachen Fluss von Sporozoiten oder Oozysten zu ermöglichen, wenn Sie Oozysten direkt injizieren möchten, und verwenden Sie Mikroladerspitzen, um jede Kapillare mit einem schnellen grünen Farbstoff zu füllen, der als Oozyste oder Sporozoitsuspension gekennzeichnet ist. Dann laden Sie die erste sporozoitgefüllte Kapillare in einen Mikroinjektor und verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop mit einer 5-fachen Vergrößerung und einem konstanten Druck, um 100 bis 200 Nanoliter der Suspension in jedes Organoid zu mikroinjizieren.Das Excystationsprotokoll führt zur Freisetzung von Sporozoiten von etwa 70 bis 80% der Oozysten. Daher ist es wichtig, die verbleibenden Oozystenschalen durch eine Drei-Mikrometer-Filtration herauszufiltern. Entfernen Sie fast 100% der nicht exzysierten Oozysten.Darüber hinaus trägt die Zugabe eines grünen Farbstoffs zur Injektion aller Organoide bei und ermöglicht die Visualisierung der injizierten Organoide für mindestens 24 Stunden nach der Injektion. Obwohl es sich um eine gut praktizierte Methode handelt, kann die Rasterelektronenmikroskopie verwendet werden, um sicherzustellen, dass der Excystationsprozess die Sporozoiten oder die Oozysten nicht beschädigt hat. Die Injektion gleicher Mengen von Oozysten in das organoide Lumen kann durch einfache mikroskopische Bildgebung visuell bestätigt werden.Immunfluoreszenz-Assays können auch verwendet werden, um die Arten von Zellen zu erforschen, die mit Cryptosporidium infiziert sind. Nachdem die differenzierten Organoide fünf Tage lang infiziert wurden, kann das Vorhandensein von Sporozoiten in den Oozysten bestätigt werden, indem ein Teil der Oozysten auf einen Klebeschlitten ausgetrocknet, die Oozysten mit Methanol fixiert und DAPI-Färbung mit einem geeigneten oozystenspezifischen Antikörper kombiniert wird. Für maximale Ergebnisse, verwenden Sie frische Oozysten, verwenden Sie die gleiche Kapillare für alle Injektionen, und ändern Sie die Medien jeden Tag nach der Injektion.Mit dieser Technik beginnen verschiedene Labore nun, Organoide zu verwenden, um Wirts-Mikroben-Wechselwirkungen zu untersuchen. Wir untersuchen Kommensale sowie andere Krankheitserreger in ähnlichen organoiden Mikrokulturen. Da Cryptosporidium ein menschlicher Parasit ist, ist es wichtig, diese Experimente gemäß den Sicherheitsvorschriften der Stufe 2 durchzuführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir eine in vitro Methode zur Reinigung von Sporozoiten aus dickwandigen Oozysten des pathogenen Parasiten Cryptosporidium parvum. Die isolierten Sporozoiten können für Infektionsstudien verwendet werden.

In vitro Sporozoit-Isolierung aus Cryptosporidium parvum Oozysten

Dieses Video demonstriert eine Mikroinjektionstechnik zur Entwicklung eines menschlichen Darm-Organoid-Infektionsmodells. Das infektiöse Sporozoitenstadium des Parasiten Cryptosporidium parvum wird in das Organoidlumen mikroinjiziert. Nach dem Eindringen in die Epithelzellen des Organoids durchläuft es eine asexuelle und sexuelle Fortpflanzung, um seinen Lebenszyklus zu vervollständigen und die Infektion zu verbreiten.

Eine Technik zur Entwicklung einer Parasiteninfektion in Darmorganoiden durch Mikroinjektion

Dieses Protokoll erklärt primären Lgr5-positve Organoid Kultur und die anschließende Leistung der retroviralen Transduktion. Dies ermöglicht Cre-induzierbare Überexpression oder Knockdown der gelieferten Transgen und ermöglicht funktionelle Studien im organotypischen neues in vitro durchgeführt werden   Modellsystem.

Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

In diesem Videoprotokoll erklären wir Schritt für Schritt die lentivirale Transduktion in Organoiden des primären Darmepithels und die Verarbeitung und nachgelagerte Analyse dieser Kulturen mittels quantitativer RT-PCR, RNA-Microarray und Immunhistochemie.

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Aus Stammzellen gewonnene Kulturen bergen ein enormes Potenzial zur Modellierung von Infektionskrankheiten. Hier wird die Kultur von mausischen und menschlichen Magenorganoiden beschrieben, die aus adulten Stammzellen gewonnen werden. Den Organoiden wird der Magenerreger Helicobacter pylori mikroinjiziert.

Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur von humanen und murinen Magen Organoide und Mikroinjektion von Helicobacter Pylori

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit folgende pharmakologische Behandlung im menschlichen Darm Organellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und live-Cell-Mikroskopie.

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

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Verwendung von humaninduzierten, zellabgeleiteten Intestarz-Organoiden zur Untersuchung und Modifizierung des epithelialen Zellschutzes gegen Salmonellen und andere Krankheitserreger

Hier stellen wir zwei Protokolle vor, die die Modellierung von intestinalen apikal-spezifischen Interaktionen ermöglichen. Organoid-abgeleitete intestinale Monoschichten und Air-Liquid-Interface (ALI)-Kulturen erleichtern die Erzeugung von gut differenzierten Epithelien, die sowohl von luminaler als auch von basolateraler Seite zugänglich sind, während polaritätsinvertierte Darmorganoide ihre apikale Seite freilegen und für Hochdurchsatz-Assays zugänglich sind.

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

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Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von murinen Dünndarmkrypten und kultivieren intestinale 3D-Organoide aus den Krypten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Generierung von Organoiden aus einer einzelnen intestinalen Stammzelle in Abwesenheit einer subepithelialen zellulären Nische.

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

Die Studie präsentiert eine Methode zur in-vitro-Untersuchung bakterieller Infektionen unter Verwendung von Gewebestammzell-abgeleiteten Intestinalorganoiden. Das Protokoll beschreibt, wie man Organoide in zwei Dimensionen kultiviert und differenziert, sie mit adhärent-invasiven Escherichia coli infiziert und wichtige Werte bewertet, darunter das Durchbrechen der Epithelbarriere, die Bildgebung der Infektion und die Antwort der epithelialen RNA.

Eine zweidimensionale Organoidkultur auf Invasin- oder Basementmembranextrakt zur Untersuchung von Wirts-Bakterien-Interaktionen

Lernen Sie die Mikroinjektion von Cryptosporidium parvum in humane Darm- und Luftwegs-Organoide. Diese Methode ermöglicht präzise Studien zu Wirt-Pathogen-Interaktionen in 3D-Gewebemodellen.

Studium der Cryptosporidium-Infektion in 3D-Gewebe-abgeleiteten Human Organoid Culture Systems durch Mikroinjektion

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