Name: Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Lernen Sie die Mass Cytometry-Analyse von Knochenmark-Neutrophilen-Linienzellen. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität kurzlebiger myeloider Zellen und ermöglicht die Identifizierung seltener Immunzellpopulationen.

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Wir danken dem LJI Flow Cytometry Kern für die Unterstützung bei der Massenzytometrie. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien R01HL134236, P01HL136275 und R01CA202987 (alle an C.C.H) und ADA7-12-MN-31 (04) (zu C.C.H. und Y.P.Z) unterstützt.

Alle Experimente folgten den anerkannten Richtlinien des La Jolla Institute for Allergy and Immunology Animal Care and Use Committee, und die Zulassung für die Verwendung von Nagetieren wurde vom La Jolla Institute for Allergy and Immunology nach Kriterien gemäß den der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health.
1. Ernte Maus Knochenmark (BM)
<ol><li>Kaufen Sie C57BL/6J Mäuse von einem kommerziellen Anbieter. Füttern Sie die Standard-Nagetier-Chow-Diät und beherbergen Sie sie in Mikroisolatorkäfigen in einer pathogenenfreien Anlage.</li>
	<li>Verwenden Sie männliche Mäuse, 6-10 Wochen alt, für experimentelle Zwecke. Euthanisieren durch CO2-Inhalation gefolgt von der Zervixdislokation.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf ein steriles chirurgisches Pad mit der Bauchseite nach oben. Sterilisieren Sie die Haut des Bauch- und Hinterbeinebereichs, indem Sie 70% Ethanol sprühen. Verwenden Sie ein Paar sezierende chirurgische Schere, um die Bauchhöhle zu schneiden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Haut, um Hinterbeine freizulegen. Verwenden Sie ein Paar stumpfe Spitze Dressing Zange, um die Maus Tibia direkt unter dem Knöchel zu halten. Verwenden Sie ein weiteres Paar gekrümmte Ankleidezangen, um die Tibia unter den stumpfen, spitzen Ankleidezangen zu stabilisieren. Brechen Sie die Tibia und setzen Sie den Knochen durch Abreißen des Muskels mit der stumpfen Spitze Dressing Zange. HINWEIS: Die Tibia ist lose am Kniegelenk befestigt und kann mit den stumpfen Klappenzangen leicht herausgepickt werden.</li>
	<li>Die Tibia in kalte 1x PBS geben.</li>
	<li>Als nächstes bewegen Sie die stabilisierenden gekrümmten Verbandszangen nach unten zum Oberschenkelknochen. Schieben Sie die stumpfe Spitze Dressing Zange unter dem Kniegelenk und halten Sie die Kniescheibe. Dislozieren Sie die Kniescheibe, indem Sie sie sanft nach oben ziehen. Setzen Sie den Oberschenkelknochen aus, indem Sie den an der Kniescheibe befestigten Muskel abreißen. Halten Sie den freiliegenden Oberschenkelknochen durch die gekrümmten Verbandszangen und schneiden Sie den Oberschenkelknochen von der Unterseite des Knochens mit einer sezierenden chirurgischen Schere ab.</li>
	<li>Den Oberschenkelknochen in kalte 1x PBS geben.</li>
	<li>Lochen Sie ein Loch in 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit einer 18 G Nadel.</li>
	<li>Legen Sie sowohl Tibia als auch Oberschenkelknochen in das gleiche 0,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit dem offenen Ende der Knochen nach unten zum Loch.</li>
	<li>Legen Sie das 0,5 ml-Rohr mit Tibia und Oberschenkelknochen in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenrohr.</li>
	<li>Drehen Sie die doppelschichtigen Rohre, die sowohl Tibia als auch Oberschenkelknochen bei 5.510 x g für 30 s in der Mikrozentrifuge enthalten.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der BM aus den Knochen extrahiert und an der Unterseite des Rohres gepelt wird. Den 0,5 ml-Schlauch mit den heiligen Knochen. Die Maus BM ist bereit für die nächsten Schritte. HINWEIS: Human BM wird zu klinischen Ressourcen geerntet, wie zuvor beschrieben11.</li>
</ol>2. Flecken BM-Zellen für CyTOF
<ol><li>Setzen Sie den BM in 1 mL 1x Red Blood Cell (RBC) Lysepuffer aus. Für humane BM, resuspendieren Sie die gesamte BM in einem 10x Volumen von 1x Red Blood Cell (RBC) LysePuffer. 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.</li>
	<li>Drehen Sie das Rohr bei 350 x g für 5 min bei 4 °C. Wiederholen Sie für humanes BM Schritt 2.1 und 2.2, bevor Sie mit Schritt 2.3 fortfahren.</li>
	<li>Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet ungestört lassen. Das Pellet mit 1 ml kalt1x PBS aussetzen. Filtern Sie das Pellet in ein 15 ml konisches Rohr durch ein 70 m Zellsieb. Die BM-Zellen sind nun vollständig in die Röhre aus dem Muskel- und Knochenrest isoliert. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 9 ml kalte 1x PBS in das Rohr geben.</li>
	<li>Drehen Sie das 15 ml-Rohr bei 350 x g für 5min bei 4 °C.</li>
	<li>Den Überstand vorsichtig ansaugen und die BM-Zellen mit 10 ml kaltem PBS wieder aufsetzen. Nehmen Sie ein Aliquot von Zellen zum Zählen. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Aliquot 5 x 106 BM Zellen in ein neues 15 ml Rohr für CyTOF Färbung.</li>
	<li>Drehen Sie das 15 ml Rohr aliquot bei 350 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Sorgsam den Überstand ansaugen und die BM-Zellen mit 125 nM Cisplatin in 1 ml CyTOF Staining Buffer als Lebensfähigkeitsindikator für die Probe wieder aussetzen. 5 min bei RT inkubieren.</li>
	<li>Nach der Inkubation 4 ml CyTOF-Färbepuffer in das Rohr geben. Drehen Sie das Rohr bei 350 x g für 5 min bei 4 °C. Für menschlicheBM, fügen Sie 10% menschliches AB-Serum in den CyTOF-Färbungspuffer.</li>
	<li>Sorgsam den Überstand ansaugen und die BM-Zellen mit einer 50-L-Fc-Rezeptor-Blockierlösung wieder aussetzen. 10 min bei 4 °C inkubieren. Überspringen Sie diesen Schritt für human BM.</li>
	<li>Fügen Sie der Probe 50 L des hausgemachten CyTOF-Antikörpercocktails5 hinzu, so dass das Gesamtfärbevolumen 100 l beträgt. Sanft Pipette zu mischen. 30 min bei 4 °C inkubieren. Das Endvolumen des Antikörpercocktails beträgt 100 l für Maus-BM- und Human-BM-Proben.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml CyTOF-Färbepuffer in jedes Rohr nach der Inkubation, um die Zellen zu waschen, drehen Sie das Rohr bei 350 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.12 für insgesamt zwei Wähbe.</li>
	<li>Bereiten Sie eine frische 1,6% Formaldehydlösung aus dem 16% Stock ampule vor. 1 Teil des Vorrats formaldehyd mit 9 Teilen von 1x PBS verdünnen.</li>
	<li>Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Pellet mit 1 ml frischer 1,6% FA-Lösung wieder aufhängen. 15 min bei RT inkubieren.</li>
	<li>Drehen Sie das Rohr bei 800 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet mit 125 nM Interkalationslösung in 1 ml Fix/Perm-Puffer wieder aufhängen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in Interkalationslösung über Nacht bei 4 °C.</li>
</ol>3. Bereiten Sie Zellen für die CyTOF-Akquisition vor
<ol><li>Sanft Wirbel und Spin-Zellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen durch Zugabe von 2 ml CyTOF-Färbepuffer, Spinzellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.</li>
	<li>Resuspend Zellen in 1 ml diH2O. Reservieren Sie ein kleines Volumen (ca. 10 l) von jedem Rohr, um Zellen zu zählen.</li>
	<li>Spinzellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.3 und 3.4.</li>
	<li>Den Überstand vorsichtig ansaugen und die Zellen im Pellet lassen. Die BM-Zellen sind nun bereit für die Resuspension auf die Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml für die CyTOF-Erfassung.</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li>
<li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li>
<li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li>
<li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+data+using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li>
<li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).</li>
<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+profiler%E2%80%99s+guide+to+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A deep profiler’s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li>
<li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+New+insights+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).</li>
<li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In den vergangenen Jahrzehnten wurde die fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie als Hauptmethode zur Untersuchung zellulärer Abstammungundlzeichen und Heterogenität1,2,3verwendet. Obwohl die Durchflusszytometrie mehrdimensionale Daten lieferte, ist diese Methode durch die Auswahl von Parametern und spektralen Überlappungen eingeschränkt. Um die Schwäche der Durchflusszytometrie zu überwinden, nutzten wir CyTOF, das schwere Met...

In den letzten Jahrzehnten waren Zytometrie-Methoden ein leistungsfähiges Werkzeug, um das hämatopoetische System im BM zu untersuchen. Zu diesen Methoden gehören fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrie und die neue Methode der CyTOF mit schwermetallbeschriftten Antikörpern. Sie haben durch die Identifizierung ihrer einzigartigen Oberflächenmarker-Expressionsprofile zu Entdeckungen vieler Zelltypen in einer heterogenen biologischen Probe geführt. Erhöhte Spektrumüberlappungen, die mit mehr Kanälen verbunden sind, führen zu einer höheren Datenungenauigkeit in fluoreszenzaktivierten Durchflusszytometrieanwendungen. Daher werden unerwünschte Zellen routinemäßig entfernt, um Zellpopulationen von Interesse für die Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrieanalyse zu bereichern. Beispielsweise gelten Ly6G (oder Gr-1) und CD11b als reife myeloische Zellmarker und Ly6G+ (oder Gr-1+) und CD11b+ Zellen werden routinemäßig aus BM-Proben entfernt, indem magnetische Anreicherungskits verwendet werden, bevor die Durchflusszytometrieanalyse hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) oder durch Kombination dieser Marker in einem Dump-Cocktail-Kanal1,2,3. Ein weiteres Beispiel ist, dass Neutrophile routinemäßig aus menschlichen Blutproben entfernt werden, um periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) für immunologische Studien anzureichern. Ganzes Knochenmark, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, wird jedoch selten intakt für die Zytometrieanalyse untersucht.
In letzter Zeit ist CyTOF zu einem revolutionären Werkzeug geworden, um das hämatopoetische System4,5,6zuuntersuchen. Mit CyTOF werden die fluorophor-markierten Antikörper durch schwere, von Reportern gekennzeichnete Antikörper ersetzt. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung von über 40 Markern ohne die Sorge um die Überlappung des Spektrums. Es hat die Analyse intakter biologischer Proben ohne Vorabbauschritte oder einen Deponiekanal ermöglicht. Daher können wir das hämatopoetische System umfassend mit hoher Content-Dimensionalität aus herkömmlichen 2D-Flow-Zytometrie-Plots betrachten. Zellpopulationen, die in der Vergangenheit während des Erschöpfungs- oder Gatingprozesses weggelassen wurden, können nun mit den von CyTOF4,5erzeugten hochdimensionalen Daten ans Licht gebracht werden. Wir haben ein Antikörper-Panel entwickelt, das gleichzeitig 39 Parameter im hämatopoetischen System misst, mit einem Fokus auf die myeloische Linage7. Im Vergleich zu den herkömmlichen Flow-Zytometrie-Daten ist die Interpretation und Visualisierung der beispiellosen einzelzelligen hochdimensionalen Daten, die von CyTOF generiert werden, eine Herausforderung. Computerwissenschaftler haben Maßalitätsreduktionstechniken zur Visualisierung hochdimensionaler Datensätze entwickelt. In diesem Artikel verwendeten wir den Algorithmus viSNE, der t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) Technik verwendet, um die CyTOF-Daten zu analysieren und das hochdimensionale Ergebnis auf einer 2-dimensionalen Karte zu präsentieren, während die hochdimensionale Struktur konserviert wird. der Daten8,9,10. Im tSNE-Diagramm werden ähnliche Zellen in Teilmengen gruppiert, und die Farbe wird verwendet, um das Feature der Zellen hervorzuheben. In Abbildung 1 werden die myeloischen Zellen z. B. in mehrere Zellteilmengen verteilt, basierend auf den Ähnlichkeiten ihrer Expressionsmuster von 33 Oberflächenmarkern, die aus CyTOF resultieren (Abbildung 1)4. Hier untersuchten wir Mausknochenmark mit unserem zuvor berichteten 39-Marker CyTOF Panel durch viSNE-Analyse7. viSNE-Analyse unserer CyTOF-Daten ergab eine nicht identifizierte Zellpopulation, die sowohl HSPC -(CD117+) als auch Neutrophilen (Ly6G+) Merkmale zeigte (Abbildung 2)7.
Abschließend stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung eines frischen ganzen Knochenmarks für die CyTOF-Analyse vor. In diesem Artikel haben wir als Beispiel Mausknochenmark verwendet, während dieses Protokoll auch zur Verarbeitung menschlicher Knochenmarkproben verwendet werden kann. Die spezifischen Details für menschliche Knochenmarkproben sind auch im Protokoll vermerkt. Der Vorteil dieses Protokolls ist, dass es Details wie Inkubationszeit und Temperatur enthält, die optimiert wurden, um Neutrophilen-Linienzellen im gesamten Knochenmark zu erhalten, um eine Untersuchung des intakten gesamten Knochenmarks zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann auch leicht für Fluoreszenz-aktivierte Durchflusszytometrieanwendungen geändert werden.

<table><tbody><tr><td>CyTOF Antikörper (Maus)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD45 (Klon 30-F11) -89Y</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3089005B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mensch/Maus CD45R/B220 (Klon RA36B2)-176Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3176002B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD105 (Klon MJ7/18)-gereinigt</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 120402; RRID:AB_961070</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD115 (CSF-1R) (Klon AFS98)-gereinigte</td><td>Biolegende</td><td>Kat# 135502; RRID:AB_1937293</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD117/c-kit (Klon 2B8)-166Er</td><td>Fluidigm</td><td>Kat# 3166004B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD11a (Klon M17/4)-gereinigt</td><td>Biolegend</td><td>Kat# 101101; RRID:AB_312774</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD11b (Klon M1/70)-148Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Kat# 3148003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD11c (Klon N418)-142Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Kat# 3142003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD127 (IL-7R&alpha;) (Klon A7R34)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Kat# 133919; RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD150 (Klon TC1512F12.2)-167Er</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3167004B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD16.2 (Fc&gamma; RIV) (Klon 9E9)-gereinigte</td><td>Biolegende</td><td>Kat# 149502; RRID:AB_2565302</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD162 (Klon 4RA10 (RUO)) - gereinigt</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 557787; RRID:AB_647340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD169 (Siglec-1) (Klon 3D6.112)-gereinigte</td><td>Biolegende</td><td>Kat# 142402; RRID:AB_10916523</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-CD182 (CXCR2) (Klon SA044G4)-gereinigte</td><td>Biolegende</td><td>Kat# 149302; RRID:AB_2565277</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-CD183 (Klon CXCR3-173)-gereinigte</td><td>Biolegend</td><td>Kat# 126502; RRID:AB_1027635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD335 (NKp46) (Klon 29A1.4)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 137625; RRID:AB_2563744</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD34 (Klon MEC14.7)-gereinigte</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 119302; RRID:AB_345280</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD41 (Klon MWReg30)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919; RRID:AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD43 (Klon S11)-146Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Kat# 3146009B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD48 (Klon HM48.1)-156Gd</td><td>Fluidigm</td><td>Kat# 3156012B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD62L (Klon MEL-14)-MaxPar Ready</td><td>ThermoFisher</td><td>Kat# 14-1351-82; RRID:AB_467481</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD71 (Klon RI7217)-Gereinigte</td><td>Biolegend</td><td>Kat# 113802; RRID:AB_313563</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD90 (Klon G7)-gereinigte</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 105202; RRID:AB_313169</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus F4/80 (Klon BM8)-159TB</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3159009B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Fc&epsilon; RI&alpha; (Klon MAR-1)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 134321; RRID:AB_2563768</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-GM-CSF (MP1-22E9 (RUO)) - gereinigt</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 554404; RRID:AB_395370</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus I-A/I-E (Klon M5/114.15.2)-174Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Kat# 3174003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Ki67 (Klon B56 (RUO))-gereinigt</td><td>BD Biosciences</td><td>Kat# 556003; RRID:AB_396287</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly-6A/E (Sca-1) (Klon D7)-169Tm</td><td>Fluidigm</td><td>Kat# 3169015B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly6B (Klon 7/4)-Gereinigter</td><td>Abcam</td><td>Kat# ab53457; RRID:AB_881409</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Ly-6G (Klon 1A8)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 127637; RRID:AB_2563784</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus NK1.1 (Klon PK136)-165Ho</td><td>Fluidigm</td><td>Kat# 3165018B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus Siglec-F (Klon E50-2440 (RUO))-gereinigt</td><td>BD Biosciences</td><td>Kat# 552125; RRID:AB_394340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus TCR&beta; (Klon H57-597)-143Nd</td><td>Fluidigm</td><td>(Klon H57-597)-143Nd</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus TER-119/Erythroide Zellen (Klon TER-119)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 116241; RRID:AB_2563789</td><td></td></tr><tr><td>Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antikörper-Stabilisator</td><td>CANDOR Bioscience</td><td>Cat# 130050</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin-194Pt</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201194</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 1x Erythrozyten-Lysepuffer</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Transkriptionsfaktor-Färbepuffer-Set</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>EQ Vier-Element-Kalibrierperlen</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201078</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Omega Scientific</td><td>Cat# FB-02</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>GE Lifesciences</td><td>Cat#SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Intercalator-Ir</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201192B</td><td></td></tr><tr><td>MAXPAR Antikörpermarkierungskits</td><td>Fluidigm</td><td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 158127</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# S2002</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>Cat# 25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Experimentelles Modell: Organismus/Stämme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus: C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Best.-Nr.: 000664</td><td></td></tr><tr><td>Software Alogrithm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bead-based Normalizer</td><td>Finck et al., 2013</td><td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td><td></td></tr><tr><td>Cytobank</td><td>Cytobank</td><td>Cytobank https://www.cytobank.org/</td><td></td></tr> <tr><td>Cytofkit v1.r.0</td><td>Chen et al., 2016</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td><td></td></tr><tr><td>t-SNE</td><td>van der Maaten und Hinton, 2008</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung des ganzen knochenmarks für die mass cytometry analyse von neutrophilen-linienzellen

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll vor, das optimiert ist, um Neutrophilen-Linienzellen in frischem BM für die gesamte BM CyTOF-Analyse zu erhalten. Wir nutzten ein myeloisch-voreingenommenes 39-Antikörper-CyTOF-Panel, um das hämatopoetische System mit einem Fokus auf die Neutrophilen-Linienzellen mit diesem Protokoll zu bewerten. Das CyTOF-Ergebnis wurde mit einem Open-Resource-Dimensionsreduktionsalgorithmus viSNE analysiert, und die Daten wurden vorgestellt, um das Ergebnis dieses Protokolls zu demonstrieren. Wir haben neue neutrophil-lineage Zellpopulationen auf der Grundlage dieses Protokolls entdeckt. Dieses Protokoll der frischen gesamten BM-Präparation kann für 1), CyTOF-Analyse verwendet werden, um nicht identifizierte Zellpopulationen aus ganz BM zu entdecken, 2), die Untersuchung ganzer BM-Defekte bei Patienten mit Bluterkrankungen wie Leukämie, 3), fluoreszenzaktivierte Durchflusszytometrieprotokolle, die frische sermierte bm verwenden.

Abbildung 1 wird als Beispiel aus CyTOF-Experimenten dargestellt. Auf diesem tSNE-Diagramm wurden die Zellen über mehrere Mausgewebe basierend auf der Ähnlichkeit ihrer Oberflächenmarker-Expressionsprofile, die von einem CyTOF-Panel mit 33 Parametern gemessen wurden, in Teilmengen gruppiert. Zellen mit ähnlichen Eigenschaften wurden automatisch gruppiert, z. B. Die Neutrophile, Makrophagen oder die DCs basierend auf der Expression der 33 Marker auf jeder Zelle.
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Hier stellen wir ein Protokoll zur Verarbeitung von frischem Knochenmark (BM) vor, das von der Maus oder dem Menschen isoliert ist, um die analyse von Neutrophilenzellen durch die hochdimensionale Massenzytometrie (Cytometrie durch Time-Of-Flight, CyTOF) zu verarbeiten.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Dieses Massenzytometrie-Protokoll bewahrt die Integrität des gesamten Knochenmarks und ermöglicht die Rettung der Informationen, die während der konventionellen Probenvorbereitung für die Analyse unter untersuchter Zellen verloren gegangen sind. Dieses schnelle und mühelose Knochenmark-Isolationsprotokoll erleichtert den Erwerb lebensfähiger kurzlebiger myeloischer Zellpopulationen wie seltener Neutrophilen-Lineage-Subsets. Die Verwendung von Massenzytometrie zur Identifizierung zuvor unterschätzter Immunzellen wie Neutrophilen-Linienzellen kann weitreichende Auswirkungen auf eine Vielzahl von Krankheiten haben.Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der kurzlebigen myeloischen Zellen, die im Knochenmark vorhanden sind und leicht auf andere Gewebetypen wie den soliden Tumor angewendet werden können. Wir haben das Protokoll vereinfacht, um es so benutzerfreundlich wie möglich zu gestalten, aber wie in allen biologischen Studien kann es einige Übungsläufe benötigen, um es zu verwalten. Wenn Sie dies zum ersten Mal tun, können Sie zuerst alle Ihre Reagenzien fertig stellen und dann das Protokoll strikt befolgen.Wenn Probleme auftreten, können Sie eine Verbindung zum CyTOForum herstellen und mit anderen CyTOF-Benutzern sprechen, die Ihnen bei der Fehlerbehebung helfen können. Bei der biologischen Probenvorbereitung können einfache Tricks mit dem Endergebnis einen großen Unterschied machen. Eine visuelle Demonstration ist für einen neuen Benutzer viel einfacher, das Protokoll zu erfassen.Wenn Sie dies zum ersten Mal tun, können Sie Ihre Reagenzien zuerst fertig stellen und dann strikt dem Protokoll folgen. Für die Knochenmarkernte eine sechs bis zehn Wochen alte C57 schwarze Sechsmaus in die Supine-Position auf einem sterilen chirurgischen Pad legen und 70% Ethanol verwenden, um den Bauch und die Hinterbeine zu sterilisieren. Verwenden Sie eine sezierende chirurgische Schere, um die Bauchhöhle zu öffnen und die Haut zu entfernen, um die Hinterbeine freizulegen.Halten Sie die Maustibia mit einem Paar stumpf gekippten Anreifungszangen direkt unter dem Knöchel und verwenden Sie ein Paar gekrümmte Verbandszangen, um die Tibia unter den stumpf gekippten Anreifungszangen zu stabilisieren. Verwenden Sie die stumpf gekippten Anziehzange, um die Tibia zu brechen und den Muskel zu entfernen, um den Knochen freizulegen. Bevor Sie die Tibia in kalteS PBS legen, bewegen Sie die stabilisierenden gekrümmten Verbandszangen zum Oberschenkelknochen und schieben Sie die stumpf gekippten Verbandszangen unter das Kniegelenk, um die Kniescheibe zu halten.Ziehen Sie vorsichtig nach oben, um die Kniescheibe zu verrenken und entfernen Sie den Muskel von der Kniescheibe, um den Oberschenkelknochen freizulegen. Halten Sie den freiliegenden Oberschenkelknochen durch die gekrümmten Verbandszangen und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um den Oberschenkelknochen von der Unterseite des Knochens zu schneiden. Legen Sie dann den Oberschenkelknochen in PBS.Als nächstes verwenden Sie eine 18-Spur-Nadel, um ein Loch in ein 0,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu schlagen und legen Sie beide Knochen in das Rohr mit den offenen Enden der Knochen nach unten in das Loch. Legen Sie das 0,5-Milliliter-Rohr in ein 1,7 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und drehen Sie die doppelschichtigen Rohre in einer Mikrozentrifuge. Bestätigen Sie am Ende der Zentrifugation, dass das Knochenmark an den Boden des Rohres extrahiert wurde.Um die Knochenmarkzellen für die Massenzytometrie zu färben, setzen Sie das Knochenmark in einem Milliliter roter BlutkörperchenLysepuffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur wieder auf. Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und das Pellet in einem Milliliter kalten PBS wieder aufhängen. Filtern Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Sieb in ein 15 Milliliter konisches Rohr und waschen Sie die Zellen mit neun Millilitern frischer, kalter PBS.Setzen Sie das Knochenmarkzellpellet in 10 Milliliter frischer, kalter PBS zum Zählen wieder auf und übertragen Sie fünfmal 10 in die sechste Zelle aliquot in eine neue 15 Milliliter-Röhre. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Massenzytometrie-Färbungspuffer, ergänzt durch 125 Nanomolar Cisplatin. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur die Zellen in vier Milliliter frischer Massezytometriepuffer waschen.Das Pellet in 50 Mikroliter FC-Rezeptor-Blockierlösung wieder aussetzen. Nach 10 Minuten bei vier Grad Celsius 50 Mikroliter des von Interesse sindden Antikörpercocktails in die Zellen geben und sanft pfeifen, um sie zu mischen. Die Temperatur in verschiedenen Inkubationsschritten ist sehr wichtig, um die Lebensfähigkeit der Knochenmarkzellen zu erhalten.Nach 30 Minuten bei vier Grad Celsius die Zellen zweimal in zwei Millilitern frischer Massezytometriepuffer pro Wäsche waschen, bevor die Zellen in einem Milliliter frisch zubereitetem 1,6%Formaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur wieder aufgesetzt werden. Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und das Pellet in einem Milliliter festen Permpuffer sanieren, ergänzt mit 125 nanomolaren Interkalationslösung für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius. Vor der Analyse der Zellen durch Massenzytometrie, sanft Wirbel und Zentrifugieren der Zellsuspension vor dem Waschen der Zellen in zwei Milliliter frische Masse Zytometrie Färbung Puffer.Als nächstes waschen Sie die Zellen zweimal in einem Milliliter destilliertem Wasser pro Wäsche, sorgfältig aspirating der Überstand nach der zweiten Wäsche, bevor sie die Zellen wieder auf einmal 10 bis sechs Liter Pro Milliliter Masse Zytometrie Pufferkonzentration für Masse Zytometrie-Analyse. In diesem T verteilten stochastischen Einbettungsdiagramm wurden die Zellen über mehrere Mausgewebe basierend auf der Ähnlichkeit ihrer Oberflächenmarker-Expressionsprofile, gemessen durch ein 33-Parameter-Massenzytometrie-Panel, in Teilmengen gruppiert. Zellen mit ähnlicheren Eigenschaften wurden automatisch basierend auf der Ausprägung dieser Marker auf jeder Zelle gruppiert.Mit dieser Methode wurde die Integrität des gesamten Knochenmarks erhalten, was zur Entdeckung einer bisher unbekannten Zellpopulation führte, die gleichzeitig neutrophilund hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen mitdrückt. Diese Zellpopulation, die zuvor in myeloischen Vorläuferstudien aufgrund der ly6G-positiven Zellerschöpfung weggelassen wurde, weist ein deutliches Muster der Oberflächenmarkerexpression auf. Noch wichtiger ist, dass diese Daten zur Entdeckung einer kleinen Teilmenge des Ly6G-positiven Zellclusters führten, die Ly6G nicht ausdrückt, aber eng an die CD117-positiven Ly6G-positiven Zellen gruppiert wurde, was auf die Ähnlichkeit dieser Zellen mit der Neutrophilen-Linie auf der Grundlage der Expression der 33 Oberflächenmarker hindeutet, die in diesem Massenzytometrie-Experiment verwendet werden.Eine 13 Farbfloreszenz aktivierte Zellsortierung Panel könnte dann gebaut werden, so dass die Isolierung der neutrophilen Vorläufer durch Durchflusszytometrie für nachgeschaltete funktionelle Assays. Es ist wichtig, den Knochenmark-Isolationsverfahren so schnell wie möglich durchzuführen und die Zellen während des Färbevorgangs bei vier Grad Celsius zu halten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von frischem ganzem Knochenmark aus den Hintergliedmaßen der Maus, um ganze BM-Defekte bei Patienten mit Blutkrankheiten wie Leukämie zu untersuchen.

Knochenmarkentnahme aus der Hintergliedmaße der Maus

Wir beschreiben ein Protokoll für die Isolierung und Reinigung von Neutrophilen aus Maus-Knochenmark durch Dichtegradientenzentrifugation und Neutrophilen-Kennzeichnung mit CellTracker Farbstoffe. Dies stellt eine einfache, schnelle, reproduzierbare und kostengünstige Methode zur Gewinnung einer großen Anzahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien oder Adoptiv-Transfer-und Tracking-Experimenten.

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Wir berichten unter Verwendung eines Protokolls fluoreszenzaktivierte Zell plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-Mäusen anfällig für funktionelle Studien von pDC zu isolieren Sortierung.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Hier bieten wir eine Methode zum Identifizieren und isolieren große Zahlen von GM-CSF myeloische Zellen unter Verwendung von high-Speed Zellsortierung angetrieben. Fünf verschiedene Populationen (gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen, Vorläuferzellen der Granulozyten/Makrophagen, Monozyten, Monocyte abgeleitet Makrophagen und Monocyte abgeleitet DCs) können identifiziert werden, basierend auf Ly6C und CD115 Ausdruck.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Die MDS-Diagnose ist schwierig bei fehlender morphologischer Kriterien oder nicht-informativen Zytogenetik. MFC könnte dazu beitragen, den MDS diagnostischen Prozess zu verfeinern. Nützlich für die klinische Praxis zu werden, die MFC-Analyse muss auf Parametern beruhen mit ausreichender Spezifität und Sensitivität und Daten sollten zwischen verschiedenen Betreibern reproduzierbar sein.

Datenbank-geführte Durchflusszytometrie zur Auswertung von Knochenmark myeloische Zellen Reifung

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

In dieser Arbeit beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Färbung von murinen Knochenmarkzellen zum Phänotyp hämopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen zusammen mit den unterstützenden endothelialen und mesenchymalen Stammzellen der Nische. Eine Methode zur Anreicherung von Zellen, die sich im endostealen und zentralen Knochenmarkbereich befinden, ist ebenfalls enthalten.

Durchflusszytometrische Analyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen des murinen Knochenmarks und stromalen Nischenzellen

Wir beschreiben schrittweise Protokolle zur Messung der mitochondrialen Atmung von Maus und humanen Neutrophilen und HL60-Zellen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator.

Echtzeitmessung des mitochondrialen bioenergetischen Profils von Neutrophilen

Der Erfolg von Einzelzell-/Einzelkern-Transkriptomik und Multi-Omics hängt weitgehend von der Qualität der Zellen/Zellkerne ab. Daher muss die Isolierung von Zellen/Zellkernen aus Gewebe und deren Aufreinigung hochgradig standardisiert sein. Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von Zellkernen aus Gehirn und Knochenmark für den nachgeschalteten Einzelkern-Multiom-Assay.

Hochwertige Präparation von Hirn- und Knochenmarkkernen für Einzelkern-Multiom-Assays

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

Dieses Manuskript skizziert ein Protokoll zur Erstellung einer ATAC-seq-Bibliothek von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Mäusen, mit dem Ziel, eine optimale Lebensfähigkeit der Neutrophilen und eine hohe Bibliotheksqualität zu gewährleisten. Es bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur BMC-Vorbereitung, zur immunomagnetischen Sortierung und zum Aufbau von Bibliotheken und dient insbesondere für Neueinsteiger in die Erforschung von Neutrophilen als wertvolle Anleitung.

ATAC-Seq-Bibliothek Präparation von aus dem Knochenmark gewonnenen Neutrophilen der Maus

Lernen Sie die Mass Cytometry-Analyse von Knochenmark-Neutrophilen-Linienzellen. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität kurzlebiger myeloider Zellen und ermöglicht die Identifizierung seltener Immunzellpopulationen.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

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