Menschliche Blastozysten Biopsie und Vitrifikation

Sowohl die Blastozystenbiopsie als auch die Vitrifizierung waren eine Revolution in der IVF, der In-vitro-Fertilisation, die es Embryologen aus der ganzen Welt ermöglichte, genetische Präimplantationstests an menschlichen Embryonen mit minimalem Risiko für den Embryo durchzuführen. Die Trophectoderm-Biopsie hat das Abrufen von etwa sieben Zellen aus einem ausgewachsenen Embryo ermöglicht und somit eine robuste nachgelagerte genetische Analyse ermöglicht. Darüber hinaus hat sich dieser Ansatz bisher nicht ausgewirkt.

Die klinische Effizienz dieses Workflows ermöglicht es Patienten mit monogenen Erkrankungen und allen Patienten mit erhöhtem Risiko für Chromosomenanomalien innerhalb ihrer Blastozyste, von genetischen Präimplantationstests zu profitieren. Es gibt noch Raum für eine Verbesserung der derzeitigen Strategien der Embryonenauswahl. Zum Beispiel stellen miRNomic und proteomische Profilierung faszinierende Optionen dar, um genetische Präimplantationstests an einer einzigen Trophektodermbiopsie zu ergänzen.

Unerfahrene Bediener haben oft Schwierigkeiten, die Zona pellucida zu öffnen und zu durchdringen. Es ist nur eine Frage des Fokus. Die Blastozyste, Laserobjektiv und Pipetten sollten sich auf derselben Brennebene befinden.

Nach der Kennzeichnung der Biopsieschale mit den Details des Patienten, mit einem permanenten, ungiftigen Marker, Nummerieren Sie jeden 10-Mikroliter-Tropfen hePES-gepuffertes Medium mit dem Embryo und Zyklus-ID. Mit einer 300-Mikrometer-Stripping-Pipette, übertragen Sie eine lebensfähige, vollständig erweiterte Blastozyste auf den ersten Tropfen der Biopsieschale und spülen Sie den Tropfen, um das überschüssige Kulturmedium zu entfernen, bevor Sie die Blastozyste in den zweiten Tropfen in die Schale bewegen. Legen Sie die Schale unter ein invertiertes Mikroskop und grundieren Sie die Biopsiepipette mit Medium aus dem dritten Tropfen der Biopsieschale. Unter einer 20-fachen Vergrößerung die Blastozyste ausrichten, um bei sieben Uhr eine klare Sicht auf die innere Zellmasse zu erhalten, und den Embryo auf der Haltepipette sichern.

Konzentrieren Sie sich auf die Zona pellucida, so dass sowohl die Pipetten als auch die Blastozyste auf der gleichen Brennebene sind. Wechseln Sie zum Laserobjektiv und positionieren Sie den Laserpointer auf der Zona pellucida auf der gegenüberliegenden Seite der inneren Zellmasse. Bohren Sie die Zona pellucida mit zwei bis drei Laserpulsen, und drücken Sie vorsichtig die Biopsiepipette gegen die Zona pellucida, damit das Medium durch die Bresche geblasen werden kann, um die Trophektodermzellen von der inneren Oberfläche zu lösen.

Wenn das Trophektoderm abgetrennt ist, durch das Loch eindringen und sieben bis acht Trophektodermzellen mit sanfter Absaugung in die Biopsiepipette aspirieren. Bewegen Sie die Biopsiepipette bei mäßiger Absaugung, um die Zielzellen zu dehnen, leicht nach hinten und richten Sie den Laser auf den dünnsten Teil der angesaugten Zellen. Feuer zwei bis fünf Laserpulse an den Knoten zwischen den Zellen, um die Zielzellen vom Körper des Embryos zu trennen.

Wenn das Trophektodermfragment von der Blastozyste getrennt wurde, lassen Sie das Fragment in den gleichen Biopsietropfen weit von der Blastozyste ab, um zu verhindern, dass das Fragment wieder in die Biopsiepipette gesaugt wird. Lösen Sie die Blastozyste aus der Haltepipette und heben Sie beide Pipetten sofort an, um zu verhindern, dass das Fragment an Pipetten klebt. Dann bilde das biopsied Fragment für Qualitätskontrolle Zwecke.

Wenn alle Blastozysten biopsied wurden, wie gerade gezeigt, verschieben Sie die Biopsieschale zurück auf die laminare Strömungshaube und beschriften Sie die Postbiopsie-Kulturschale mit der Paar-ID und jedem Tropfen mit dem Embryo und Zyklus-IDs. In Anwesenheit eines Zeugen die Blastozyste in einem sauberen IVF-Medium abspülen und die Blastozyste zu ihrem entsprechenden Tropfen in der Postbiopsieschale bewegen. Dann legen Sie die Postbiopsieschale auf eine 37-Grad-Celsius, 6% Kohlendioxid und 5% Sauerstoff-Inkubator.

In Gegenwart des Zeugen und in einer laminaren Strömungshaube bei Raumtemperatur beschriften Sie die PCR-Rohre mit einem dauerhaften, ungiftigen Marker. Beschriften Sie den Deckel einer 60 x 15-Millimeter-Schlauchkulturschale mit den biopsied embryo-IDs und fügen Sie der Schale zwei 10-Mikroliter-Tropfen Biopsie-Waschlösung hinzu. Prime eine 140-Mikrometer-Stripping-Pipette mit Biopsie-Waschlösung aus dem zweiten Tropfen der Schlauchschale unter dem Stereomikroskop, um die Trophektodermfragmente zu visualisieren.

Lösen Sie vorsichtig eine Biopsie-Waschlösung auf dem Trophektoderm-Fragment und laden Sie das Fragment in die Stripping-Pipette. Bewegen Sie das Fragment auf den zweiten Tropfen der Biopsie-Waschlösung, und spülen Sie das Gewebe zwei- bis dreimal sorgfältig ab. Übertragen Sie das Trophektodermfragment mit Ladelösung auf den Boden des entsprechend beschrifteten PCR-Rohrs, wobei darauf zu achten ist, dass die Wände des Rohres nicht mit der Spitze der Abisolierpipette berührt werden.

Wenn alle Fragmente zu ihren Rohren hinzugefügt wurden, drehen Sie alle Rohre in einer Minizentrifuge für ein paar Sekunden, um die Fragmente zu sedimentieren. Dann lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius, bis sie zum Testen an das verweisende Genetische Labor geliefert werden. Innerhalb von 30 Minuten nach der Trophektodaderm-Biopsie, beschriften Sie eine Verglasungsplatte mit den Daten des Patienten und den IDs der Blastozysten, die verglast werden müssen.

Mit speziellen kalttemperaturbeständigen Kryoetiketten beschriften Sie die Verglasungsstützen mit dem Vor- und Nachnamen des Patienten, der Paar-ID, der ID des Embryos, der darauf geladen wird, und dem Datum des Eingriffs. Geben Sie bei Raumtemperatur 300 Mikroliter Ausgleichslösung für jede Blastozyste aus, die verglast wird, und verwenden Sie in Gegenwart eines Zeugen eine 300-Mikrometer-Stripping-Pipette, um die Blastozyste in ein Volumen der Gleichgewichtslösung zu bewegen. Lassen Sie die Blastozyste in der Gleichgewichtslösung für 13 bis 15 Minuten.

Nach einer anfänglichen Schrumpfung des Volumens wird eine allmähliche Reexpansion beobachtet. Am Ende des Gleichgewichts 300 Mikroliter Verglasungslösung in den zweiten Brunnen der Verglasungsplatte geben und die vollständig neu erweiterte Blastozyste für eine Minute auf die Verglasungslösung übertragen. Am Ende der Inkubation spülen Sie die Blastozyste, um die Gleichgewichtslösung zu verdünnen und in Gegenwart eines Zeugen die Blastozyste auf die Verglasungsunterstützung zu laden.

Entfernen Sie den Überschuss der Verglasungslösung. Ein subtiler Lösungsfilm sollte die Blastozyste umgeben. Tauchen Sie die Verglasungunterstützung in flüssigen Stickstoff, und bewegen Sie die Unterstützung kräftig, um das Risiko der Blasenbildung in der Nähe der Probe zu reduzieren.

Legen Sie dann die Schutzkappe auf die Stütze, während die Verglasungsstütze noch in flüssigen Stickstoff getaucht ist. Von den 1, 544 Trophectoderm-Biopsie-Verfahren, die während dieses repräsentativen Zweijahreszeitraums durchgeführt wurden, wurden zwischen ein und vier Blastozysten pro Verfahren für drei bis 22 Minuten pro Verfahren biopsied. In diesen Parzellen wird der mittlere Zeitpunkt der Biopsie für jeden Bediener entlang der Studientrimester mit einem mittleren Gesamtwert von 8,24 Minuten angezeigt.

Es ist hilfreich, ein Bild von jedem biopsied Fragment für Qualitätskontrolle Zwecke zu erfassen, um zu beurteilen, ob die Ursache der nicht schlüssigen Diagnosen war zuzurechenbar auf die Dimension und /oder Qualität des Fragments, auf die Schläuche, oder einige Probleme bei der Verarbeitung der Probe im genetischen Labor. In dieser Studie wurden 572 euploide Blastozysten erwärmt, um sich nach einer Diagnose von Euploidie einer Embryoübertragung zu unterziehen. Alle Blastozysten verherrmelten innerhalb von 30 Minuten, wobei 2,4% der Blastozysten nicht zwischen 31 und 90 Minuten wieder expandierten und 4,9% nicht über 90 Minuten nach dem Wiedererwärmen wieder expandierten.

Vor allem bei schlechter Qualität und/oder Tag sieben Blastozysten scheint der Zeitpunkt zwischen Biopsie und Vitrifizierung entscheidend, um eine erneute Expansion nach der Erwärmung zu erreichen. Achten Sie darauf, sich vor dem Öffnen der Zona pellucida zu konzentrieren, wenn Sie die Kreuzung zwischen der Trophektodermzelle und dem Abfeuern aussetzen, und achten Sie auch darauf, eine erneute Ausbreitung der Blastozysten vor der Vitrifikation zu verhindern. Es gibt zwei weitere Blastozysten-Biopsie-Ansätze, die sowohl die Öffnung von Zona pellucida als auch das Warten auf eine spontane Erzung der Trophektodermzellen mit sich bringen.

Diese Ansätze sind einfacher, erfordern jedoch mehr Manipulationen und sind zeitaufwändiger. Die Wirksamkeit dieses Workflows ermöglicht die Implementierung molekularer Technologien in IVF, um zu versuchen, die Blastozyste mit der höchsten Implantationschance vor dem Embryotransfer auszuwählen. Denken Sie daran, keine Vorrichtung oder Lösung zu verwenden, die für die Embryonen giftig sein könnte, und DNA-Kontamination durch die Verwendung von DNA-freien Materialien zu verhindern.