Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen
13. Mai 2019
Dieser molekulare Ansatz zur Bestimmung der bakteriellen Fitness ermöglicht die präzise und genaue Detektion von Mikroorganismen mithilfe einzigartiger genomischer DNA-Barcodes, die über digitale PCR quantifiziert werden. Das Protokoll beschreibt die Berechnung des Wettbewerbsindex für Salmonellenstämme; Die Technologie ist jedoch leicht an Protokolle anpassbar, die eine absolute Quantifizierung jedes genetisch verformbaren Organismus erfordern.
Diese Technik ermöglicht eine genaue und präzise Quantifizierung von Mikroorganismen aus einer gemischten Population von sehr ähnlichen Stämmen mit schnellen und hochdurchsatzmolekularen Techniken. Letztlich, um Vergleiche der Fitness zwischen Stämmen zu ermöglichen. Die Fähigkeit, viele Stämme gleichzeitig in einem einzigen Pool zu bewerten, reduziert die Variabilität von Wohl-zu-Gut oder Organismus-Organismus erheblich, da alle Stämme genau den gleichen Bedingungen ausgesetzt sind.
Die Anpassungsfähigkeit dieser Technik ermöglicht es, es für fast jeden genetisch formbaren Organismus und fast jedes experimentelle Design, das eine genaue Quantifizierung von Mikroben erfordert, zu verwenden. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Entwicklung genetischer Marker auf bakterielle Chromosomen, wie im Textprotokoll beschrieben. Erstellen Sie einen Pool genomischer DNA, der jeden Barcode mit Ausnahme eines Barcodes enthält.
Verwenden Sie diesen Pool als Verdünnungsmittel, um eine Verdünnungsserie mit genomischer DNA durchzuführen, die den einzelnen verbleibenden Barcode enthält. Bereiten Sie Reaktionen für digitale PCR in doppelter Weise gemäß den Empfehlungen des Herstellers für die Verwendung eines digitalen PCR-Supermix für die sondenbasierte Chemie vor. Verwenden Sie die gepoolte genomische DNA als Vorlagen-DNA.
Fügen Sie auch den Master Mix mit 20 X Primer-Sonde hinzu, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie Replizien-Steuerungsreaktionen für digitale PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor. Kontrollreaktionen für jeden Prüfpunktmix müssen aus keine Vorlagensteuerelemente, Negativkontrollen und positiven Steuerelementen bestehen.
Wiederholen Sie diese Schritte, um digitale PCR-Reaktionen für jede genomische DNA-Probe mit Barcodes zu erstellen. Generieren Sie Tröpfchen für jede Reaktionsbedingung mit einem Tröpfchengenerator, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Neu angelegte Tröpfchen in die entsprechende 96-Wellplatte geben.
Verwenden Sie 200 Mikroliter Pipettenspitzen auf einer 5 bis 50 Mikroliter Mehrkanalpipette. Nachdem alle Tröpfchen erzeugt und übertragen wurden, versiegeln Sie die Platte mit einem Folienplattenversiegeler. Verwenden Sie den vom Hersteller empfohlenen Thermocycler, um die Zyklusbedingungen auszuführen.
Während Thermocycling durchgeführt wird, programmieren Sie die Datenanalysesoftware mit den verwendeten Platteneinstellungen, wie Beispielname, Experimentiertyp und Supermix. Enthalten auch Target 1 Name und Target 1 Typ, sowie Ziel 2 Name und Ziel 2 Typ. Nachdem das Thermocycling abgeschlossen ist, übertragen Sie die abgeschlossenen Reaktionen auf den Tröpfchenleser und starten Sie den Lesevorgang gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Wenn alle Brunnen gelesen wurden und die Ausführung abgeschlossen ist, öffnen Sie die QLP-Datendatei mit der Datenanalysesoftware. Wählen Sie alle Brunnen, die die gleiche Primersonde Mastermix verwenden. Untersuchen Sie auf der Registerkarte Tröpfchen die Anzahl der in jedem Brunnen analysierten Tröpfchen, einschließlich positiver und negativer Tröpfchen.
Schließen Sie alle Brunnen aus, der weniger als 10.000 Tröpfchen insgesamt beträgt. Wechseln Sie zur Registerkarte 1D-Amplituden, und untersuchen Sie die Amplituden positiver und negativer Tröpfchen. Stellen Sie sicher, dass sie aus 2 verschiedenen Populationen bestehen.
Verwenden Sie innerhalb der Software die Schwellenwertfunktion, um einen Cutoff zwischen positiven und negativen Tröpfchen für jede sonde zu machen, die verwendet wurde. Sobald entsprechende Schwellenwerte auf alle Brunnen angewendet wurden, berechnet die Software die Anzahl der DNA-Kopien in jeder Reaktion. Exportieren Sie Daten in eine Kalkulationstabelle, um weitere Analysen zu erleichtern.
Berechnen Sie anhand dieser Werte die anfängliche Kopiernummer jedes eindeutigen genomischen Barcodes in der Stichprobe. Bestimmen Sie die mittlere falsch positive Rate von den negativen Kontrollreaktionen und subtrahieren Sie diesen Wert von den Werten, die in experimentellen Reaktionen erhalten wurden. Multiplizieren Sie die Werte nach Bedarf, basierend auf den Verdünnungen, die beim Einrichten der einzelnen Experimente durchgeführt wurden.
Bestimmen Sie nun die relative Eignung eines Organismus, indem Sie den Wettbewerbsindex berechnen oder den Wettbewerbsindex aus der digitalen PCR-basierten Quantifizierung des Barcode-Stamms streichen. Führen Sie diesen Schritt für jeden Barcode-Stamm zu allen Zeitpunkten aus. Genomische DNA, die den AA-Barcode enthielt, wurde im Hintergrund aller anderen barcoded genomischen DNA verdünnt.
Kanal 1 stellt die FAM-Sonde für den AA-Barcode dar, während Kanal 2 die HEX-Sonde für den AO-Barcode darstellt. Die Ergebnisse jeder Sonde werden sowohl als einzelne Tröpfchenfluoreszenzamplitude als auch als Histogramm dargestellt, das die Häufigkeit der fluoreszierenden Intensität aller Tröpfchen in den ausgewählten Brunnen darstellt. Für jede Bedingung sollten positive und negative Tröpfchen 2 unterschiedliche Populationen bilden.
Die Populationen sollten mithilfe des Schwellenwert-Features getrennt werden, um positive und negative Tröpfchen zu definieren. Die Schwellenwerte variieren je nach den verwendeten Prüfpunkten, aber alle Bohrungen, die dieselbe Sondenmischung verwenden, sollten identische Schwellenwerte aufweisen. Im Fall von AA, das verdünnt wurde, scheint das Histogramm nur die einzelne Population darzustellen, da positive Tröpfchen durch negative Tröpfchen erheblich übersteigen.
Allerdings sind zwei verschiedene Populationen immer noch sichtbar, indem sie die Fluoreszenzamplitude von Tröpfchen in den linken Panels untersuchen. Als die AA-Barcode-Genom-DNA verdünnt wurde, gab es einen Rückgang der positiven Tröpfchen, während die Anzahl der positiven AO-Tröpfchen konstant bleibt. Sobald entsprechende Schwellenwerte auf alle Brunnen angewendet wurden, berechnet die Software die Anzahl der DNA-Kopien in jeder Reaktion.
Wenn Sie routinemäßig PCR als Teil Ihrer Forschung durchführen, können Sie diese Technik durchführen, um die Fitness Ihres Modellorganismus zu beurteilen. Dieses Verfahren würde normalerweise verwendet werden, um die Endergebnisse von vorgelagerten Experimenten zu bestimmen. Sein wahrer Nutzen ist es, Leichtigkeit und Vielseitigkeit für alle Experimente zu fördern, die auf bakterielle Quantifizierung angewiesen sind.
Wir verwenden diese Technik, um Salmonellen-Fitness in einem murinen Modell der Infektion zu bewerten. Darüber hinaus wird diese Technik für den Einsatz mit anderen pathogenen Mikroorganismen in unserem Labor angepasst.
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Übersicht
Dieser molekulare Ansatz ermöglicht eine genaue Quantifizierung von Mikroorganismen aus gemischten Populationen ähnlicher Stämme unter Verwendung von genomischen DNA-Barcodes. Das Protokoll erleichtert Vergleiche der Fitness zwischen Stämmen und ist für verschiedene genetisch formbare Organismen anpassbar.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Molekularbiologie
- Gentechnik
Hintergrund
- Die Quantifizierung von Mikroorganismen ist entscheidend für das Verständnis der Wettbewerbsfähigkeit.
- Traditionelle Methoden können Variabilität zwischen Stämmen einführen.
- Digitale PCR bietet eine Hochdurchsatzlösung für genaue Messungen.
- Genomische DNA-Barcodierung ermöglicht eine eindeutige Identifizierung von Stämmen.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur präzisen Quantifizierung der bakteriellen Fitness zu entwickeln.
- Die Variabilität in experimentellen Bedingungen zwischen Stämmen zu reduzieren.
- Ein flexibles Protokoll bereitzustellen, das für verschiedene experimentelle Designs anwendbar ist.
Verwendete Methoden
- Engineering genetischer Marker auf bakteriellen Chromosomen.
- Erstellen eines Pools genomischer DNA mit einzigartigen Barcodes.
- Verwendung digitaler PCR zur Quantifizierung von Mikroorganismen.
- Bewertung der Wettbewerbsindizes zwischen verschiedenen Salmonella-Stämmen.
Hauptergebnisse
- Eine genaue Quantifizierung von Mikroorganismen wurde erreicht.
- Eine reduzierte Variabilität wurde in Fitnessvergleichen beobachtet.
- Die Methode erwies sich als anpassbar für verschiedene genetisch formbare Organismen.
- Hochdurchsatzfähigkeiten wurden demonstriert.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik verbessert die Genauigkeit der mikrobiellen Quantifizierung.
- Sie ermöglicht aussagekräftige Vergleiche der Fitness zwischen Stämmen.
- Das Protokoll ist vielseitig für verschiedene experimentelle Bedürfnisse.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This digital PCR-based competitive index method addresses a key bottleneck in bacterial fitness assessment by enabling high-throughput, simultaneous quantification of multiple strains in a single competitive assay. By reducing well-to-well variability and eliminating dependence on phenotypic markers, the approach enhances predictive confidence in target validation and lead identification workflows. Its adaptability across genetically malleable organisms supports translational continuity from discovery through preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying fitness differences between wild-type and mutant strains under identical conditions.
- Operational Value: Reduces experimental variability by pooling strains, minimizing well-to-well and organism-to-organism differences.
- Predictive Value: Provides sensitive detection of both high- and low-fitness variants, supporting accurate strain prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, barcode-specific readouts that enable precise comparison of microbial abundance across conditions.
- Operational Value: Uses digital PCR to deliver absolute quantification with high sensitivity and precision across a wide dynamic range.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated barcoded strain pools for reproducible, high-throughput fitness screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports extrapolation from in vitro competition to in vivo models, as demonstrated in murine Salmonella infection studies.
- Mechanistic De-risking: Allows fitness assessment in complex biological contexts, reducing uncertainty in virulence and pathogenesis studies.
- Scalability: Easily adaptable to other pathogens and experimental designs requiring absolute microbial quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling fitness assessment after strain engineering and before lead optimization, particularly in antimicrobial and virulence target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring competitive fitness of isogenic strains in controlled environments.
- Screening: Enables multiplexed fitness profiling of strain libraries through barcode-based quantification.
- Analytics: Generates absolute DNA copy number outputs that feed into competitive index calculations for fitness ranking.
- Translational Research: Connects in vitro fitness data to in vivo pathogenesis models, as shown in murine infection applications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genomic barcoding platform applicable across multiple bacterial targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in fitness measurements by reducing technical noise and marker limitations.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput through standardized digital PCR workflows and pooled strain formats.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by delivering reliable fitness data with fewer replicates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on quantitative fitness profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic engineering to chromosomally integrate unique DNA barcodes without affecting fitness.
- Dependent on access to digital PCR instrumentation and compatible supermix for probe-based detection.
- Necessitates standardized thresholding and droplet analysis protocols across wells and experiments.
- Requires careful dilution series design and false positive rate subtraction from control reactions.
- Adaptation to new organisms depends on chromosomal modification efficiency and barcode insertion site neutrality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Validate the Sensitivity and Specificity of Each Primer-probe Set for Each Genomic Barcode Using Digital PCR
3:09
Analyze Digital PCR Data and Calculate Absolute Copy Numbers
4:52
Results: Representative Digital PCR Results of Diluted AA-barcoded gDNA
6:28
Conclusion
