Ein semi-quantitativer Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) Assay zur Untersuchung der Rapamycin/mTOR-Interaktion
27. August 2019
In dieser Studie haben wir die Datenanalysefunktionen des DARTS-Experiments verbessert, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwacht enden und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzen. Die Wechselwirkungen können in zwei Kurven dargestellt werden: eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve. Wir haben die mTOR-rapamycin-Interaktion als beispielhaften Fall genutzt.
Die ansprechende Zielstabilität der Arzneimittelaffinität, DARTS, ist eine robuste Methode zum Nachweis neuartiger kleinmolekularer Proteinziele. Es kann verwendet werden, um bekannte kleine Molekül-Protein-Wechselwirkungen zu überprüfen und potenzielle Proteinziele für natürliche Produkte zu finden. In dieser Studie verbessern wir die Datenanalysefähigkeiten des DARTS-Experiments weiter, indem wir die Veränderungen der Proteinstabilität überwachen und die Affinität von Protein-Liganden-Wechselwirkungen schätzen.
Die Protein-Ligand-Wechselwirkungen können gegen zwei Kurven, eine proteolytische Kurve und eine Dosis-Abhängigkeits-Kurve dargestellt werden. Wir haben die mTOR-rapamycin Interaktion als beispielhaftes Argument für die Erstellung unseres Protokolls verwendet. Wachsen Sie 293T-Zellen mit DMEM mit 10% fetalem Rinderserum, Zwei-Millimolar-Glutamin und 1%Antibiotika.
Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Wenn die Kultur 80 bis 90% Zusammenfluss erreicht, waschen Sie die Zellen zweimal mit kalten PBS. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen in eine entsprechende Menge kaltzelllysepuffer zu sammeln und die Lysing-Zellen in ein 1,5-Millimeter-Rohr zu übertragen.
Invertieren, um den Lysepuffer und die Lysing-Zellen gut zu mischen und die Röhre 10 Minuten lang auf Eis zu inkubieren. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 18.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Den Überstand in eine neue 1,5-Milliliter-Röhre geben und auf Eis gekühlt halten.
Führen Sie einen BCA-Test durch, um die Proteinkonzentration von Lysaten anzunähern und die Verdünnung der Pronase auf der Grundlage der Proteinkonzentration zu berechnen. Übertragen Sie das Lysat zunächst in zwei 1,5-Milliliter-Röhren mit jeweils 99 Mikrolitern. Fügen Sie jedem Aliquot von Lysat einen Mikroliter Kleinmolekül-Stammlösung hinzu und inkubieren Sie die beiden Röhren 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur mit Schütteln.
Auf Eis, stellen Sie serielle Verdünnungen der frisch aufgetauten Pronase-Lösung in 1x TNC. Nach der Inkubation mit dem kleinen Molekül, teilen Sie jedes Aliquot in 20 Mikroliter Proben in fünf Röhren. Um die gleiche Verdauungszeit zu gewährleisten, in bestimmten Intervallen von alle 30 Sekunden, fügen Sie zwei Mikroliter der vorbereiteten Pronase-Lösungen zu den Proben entsprechend hinzu.
Fügen Sie für die eine Steuerungsgruppe zwei Mikroliter TNC-Puffer hinzu. Nach fünf bis 20 Minuten die Verdauung der sechs Röhren durch Zugabe von zwei Mikrolitern kalten 20x Protease-Hemmer-Cocktails in 30-Sekunden-Intervallen stoppen. Gut mischen und 10 Minuten auf Eis bebrüten.
Jede Probe mit sechs Mikrolitern 5x SDS-PAGE Ladepuffer verdünnen und die Proben in einem Wasserbad bei 70 Grad Celsius 10 Minuten kochen. Um nun Western Blot auszuführen, laden Sie gleiche Mengen an Protein in die Brunnen eines 8%SDS-PAGE-Gels, zusammen mit einem geeigneten Molekulargewichtsmarker. Führen Sie das Gel 30 Minuten bei 80 Volt aus, stellen Sie dann die Spannung auf 120 Volt ein und fahren Sie ein bis zwei Stunden weiter.
Stellen Sie sicher, dass das kleine Molekül direkt an die potenziellen Zielproteine binden kann. In diesem Protokoll bestätigte die Inkubation mit dem kleinen Molekül den Schutz gegen Proteolyse. Es wurde festgestellt, dass drei Bands durch Inkubation mit Rapamycin über die Fahrzeugkontrolle geschützt wurden.
Western Blotting veranschaulichte das Vorhandensein von mTOR-Protein bei niedrigen Pronase-Protein-Verhältnissen und seine Reduktion und Verlust mit steigenden Verhältnissen. Die Proteolyse von mTOR durch Pronase wurde durch das Vorhandensein von Ramamycin deutlich gehemmt und die Zugabe von Ramamycin erzeugte eine offensichtliche Verschiebung der proteolytischen Kurve. Rapamycin dosisabhängig verbesserte das Niveau von mTOR, was auf die steigende Stabilität von mTOR mit Rapamycin-Behandlung hindeutet.
Die Quantifizierung der Zielproteinbandintensitäten deutete darauf hin, dass mTOR das Zielprotein von Ramamycin ist. Um den besten stufenweisen Effekt zu erzielen, muss dieses Experiment möglicherweise mehrmals wiederholt werden, um einen geeigneten Bereich von Pronase über Proteinverhältnissen zu erhalten.
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Überblick
Diese Studie verbessert die Datenanalysefähigkeiten des DARTS-Experiments durch die Überwachung von Proteinstabilitätsänderungen und die Schätzung von Protein-Ligand-Interaktionsaffinitäten. Die mTOR-Rapamycin-Interaktion dient als beispielhafter Fall für diese Analyse.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biochemie
- Pharmakologie
Hintergrund
- DARTS ist eine Methode zur Erkennung von kleinen Proteinzielen.
- Es verifiziert bekannte Wechselwirkungen von kleinen Molekülen mit Proteinen.
- DARTS kann potenzielle Proteinziele für Naturstoffe identifizieren.
- Protein-Ligand-Interaktionen können durch spezifische Kurven visualisiert werden.
Zweck der Studie
- Zur Verbesserung der Datenanalyse in DARTS-Experimenten.
- Zur Überwachung von Veränderungen in der Proteinstabilität.
- Zur Schätzung der Affinitäten von Protein-Ligand-Interaktionen.
Verwendete Methoden
- Überwachung von Proteinstabilitätsänderungen.
- Schätzung von Protein-Ligand-Interaktionsaffinitäten.
- Darstellung von Interaktionen auf proteolytischen und dosisabhängigen Kurven.
- Verwendung von mTOR-Rapamycin als Fallstudie.
Hauptergebnisse
- Verbesserte Analyse der Proteinstabilität in DARTS.
- Erfolgreiche Schätzung von Protein-Ligand-Interaktionsaffinitäten.
- Visualisierung von Interaktionen durch spezifische Kurven.
- Demonstration der Methode unter Verwendung von mTOR-Rapamycin.
Schlussfolgerungen
- Die Studie verbessert die DARTS-Methodik für eine bessere Analyse.
- Proteinstabilität und Interaktionsaffinitäten können effektiv überwacht werden.
- Die Ergebnisse können bei der Identifizierung neuer Proteinziele helfen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
The enhanced DARTS assay provides a label-free, native-state approach to validate small-molecule target engagement, supporting early-stage target de-risking. By quantifying binding affinity through proteolytic and dose-dependent curves, it enables mechanistic confidence in hit-to-lead progression. This method aids in prioritizing compounds with validated target interactions, reducing attrition due to false positives in downstream screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms direct target engagement of small molecules like rapamycin with mTOR in native lysates.
- Operational Value: Uses unmodified compounds, avoiding artifacts from tags or labels that may alter binding.
- Predictive Value: Enables affinity estimation to triage hits based on target residence and stability shifts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative proteolytic and dose-response curves for hit confirmation.
- Reproducibility: Standardized workflow with defined pronase titration and inhibitor quench points.
- Scalability: Compatible with multi-well formats for testing compound libraries against purified or cellular targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Validated target engagement in cellular lysates supports extrapolation to intact systems.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes specific binding from nonspecific proteolysis inhibition via dose-dependent stabilization.
- Preclinical Alignment: Confirmed mTOR-rapamycin interaction provides a benchmark for pathway-targeted compound evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between primary hit confirmation and lead optimization, offering biophysical validation before cellular functional assays.
- Discovery Biology: Tests target hypothesis by measuring ligand-induced stability shifts in native protein pools.
- Screening: Confirms target engagement of hits from biochemical or phenotypic screens using endogenous protein.
- Analytics: Provides affinity estimates from dose-dependence curves and stability changes from proteolytic profiles.
- Translational Research: Uses cellular lysates to maintain native protein complexes and post-translational states.
- Enterprise Reuse: Platform adaptable to diverse targets and ligands without reagent redesign.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Direct measurement of target stabilization enables objective assessment of ligand efficacy.
- Operational Value: Simple workflow using standard lysis, protease digestion, and Western blot infrastructure.
- Strategic Value: Reduces false advancement by confirming target binding early in the discovery cascade.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions based on quantitative target engagement metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Western blotting and quantitative band analysis.
- Dependent on access to pronase and protease inhibitor cocktails for controlled digestion.
- Needs standardization across labs for consistent pronase:protein ratios and incubation times.
- Adaptation to membrane or complex targets may require optimization of lysis conditions.
- Practical limitation: Semi-quantitative nature requires replicate runs for reliable affinity estimation.
