Name: In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Erfahren Sie die funktionelle Analyse krankheitsassoziierter Missense-Varianten in vivo mit Drosophila melanogaster. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht schnelle Proteinfunktionsstudien und unterstützt die Diagnose seltener Erkrankungen.

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Wir danken Jose Salazar, Julia Wang und Dr. Karen Schulze für die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir würdigen Drs. Ning Liu und Xi Luo für die funktionale Charakterisierung der hier diskutierten TBX2-Varianten. Das Screening Center für nicht diagnostizierte Krankheiten wurde vom Common Fund (U54 NS093793) des National Institutes of Health (NIH) unterstützt. H. T. C. wurde weiter unterstützt durch die NIH[CNCDP-K12 und NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), Burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), Child Neurology Society and Child Neurology Foundation ( PERF Elterman Grant) und den NIH Director es Early Independence Award (DP5 OD026426). M. F. W. wurde von der Simons Foundation (SFARI Award: 368479) unterstützt. S. Y. wurde weiter unterstützt durch das NIH (R01 DC014932), die Simons Foundation (SFARI Award: 368479), die Alzheimer es Association (New Investigator Research Grant: 15-364099), Den Naman Family Fund for Basic Research und Caroline Wiess Law Fund for Research in Molekulare Medizin. Die konfokale Mikroskopie am BCM wird teilweise durch den NIH-Zuschuss U54HD083092 an das Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (IDDRC) Neurovisualization Core unterstützt.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Experimentelle Studien mit Drosophila melanogaster bieten ein robustes Assay-System, um die Folgen von krankheitsassoziierten menschlichen Varianten zu bewerten. Dies ist aufgrund der großen Menge an Wissen und vielfältigen genetischen Werkzeugen, die von vielen Forschern im Fliegenfeld im letzten Jahrhundert89erzeugt wurden. Wie jedes andere experimentelle System ist es jedoch wichtig, die Vorbehalte und Grenzen anzuerkennen, die es gibt.
Vorbehalte im...

Patienten mit seltenen Krankheiten unterziehen sich oft einer anstrengenden Reise, die als "diagnostische Odyssee" bezeichnet wird, um eine genaue Diagnose zu erhalten1. Es wird angenommen, dass die meisten seltenen Krankheiten einen starken genetischen Ursprung haben, was genetische/genomische Analysen zu kritischen Elementen der klinischen Aufarbeitung macht. Neben der Sequenzierung von Kandidatengenpanels und der Variationsvariation von Kopierzahlen auf Basis von chromosomalen Mikroarrays sind Die Technologien für die Ganz-Exom-Sequenzierung (WES) und die Vollgenomsequenzierung (WGS) in den letztenzehnJahren zu immer wertvolleren Werkzeugen geworden. 3. Derzeit liegt die diagnostische Rate zur Identifizierung einer bekannten pathogenen Variante in WES und WGS bei 25 % (höher in pädiatrischen Fällen)4,5. In den meisten Fällen, die nach dem klinischen WES/WGS nicht diagnostiziert werden, ist ein häufiges Problem, dass es viele Kandidatengene und Varianten gibt. Die Sequenzierung der nächsten Generation identifiziert häufig neuartige oder ultraseltene Varianten in vielen Genen, und es ist eine Herausforderung, zu interpretieren, ob diese Varianten zu Krankheitsphänotypen beitragen. Obwohl beispielsweise die meisten Unsinn- oder Frameshift-Mutationen in Genen als Funktionsverlust -allele (LOF) aufgrund des unsinnig vermittelten Zerfalls des codierten Transkripts angesehen werden, entweichen abgeschnittene Mutationen, die in den letzten Exons gefunden wurden, diesem Prozess und können als gutartige oder Funktionsverstärkung (GOF) Allele6.
Darüber hinaus ist die Vorhersage der Auswirkungen eines Missense-Alleels eine gewaltige Aufgabe, da es zu einer Reihe verschiedener genetischer Szenarien führen kann, wie Sie erstmals von Herman Muller in den 1930er Jahren beschrieben wurden (d. h. amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph oder isomorph)7 . Zahlreiche Silico-Programme und -Methoden wurden entwickelt, um die Pathogenität von Missense-Varianten auf der Grundlage der evolutionären Konservierung, der Art der Aminosäureänderung, der Position innerhalb eines funktionellen Bereichs, der Allelhäufigkeit in der allgemeinen Bevölkerung vorherzusagen, und andere Parameter8. Diese Programme sind jedoch keine umfassende Lösung, um das komplizierte Problem der Varianteninterpretation zu lösen. Interessanterweise hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass fünf breit angelegte Varianten-Pathogenitätsvorhersagealgorithmen (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) sich auf Pathogenität von 80% der Zeit einigen 80% der Zeit8 . Bemerkenswert ist, dass selbst wenn alle Algorithmen zustimmen, sie eine falsche Vorhersage der Pathogenität bis zu 11% der Zeit zurückgeben. Dies führt nicht nur zu fehlerhaften klinischen Interpretation, sondern kann auch Forscher davon abhalten, neue Varianten zu verfolgen, indem sie sie fälschlicherweise als gutartig auflisten. Eine Möglichkeit, die aktuelle Beschränkung der Silico-Modellierung zu ergänzen, besteht darin, experimentelle Daten bereitzustellen, die die Wirkung der Variantenfunktion in vitro, ex vivo (z. B. kultivierte Zellen, Organoide) oder in vivo demonstrieren.
In vivo funktionelle Studien zu varianten seltenen Krankheiten in MO haben einzigartige Stärken13 und wurden von vielen Forschungsinitiativen für seltene Krankheiten auf der ganzen Welt übernommen, einschließlich des Undiagnosed Diseases Network (UDN) in den Vereinigten Staaten und Rare Krankheiten Modelle & Mechanismen (RDMM) Netzwerke in Kanada, Japan, Europa und Australien14. Zusätzlich zu diesen koordinierten Bemühungen, MO-Forscher in den Arbeitsablauf von Diagnosen seltener Krankheiten und mechanistischen Studien auf nationaler Ebene zu integrieren, haben eine Reihe individueller kollaborativer Studien zwischen klinischen und MO-Forschern zu der Entdeckung geführt. und Charakterisierung vieler neuer menschenkranker Gene und Varianten82,83,84.
Im UDN erhält ein zentralisiertes Model Organisms Screening Center (MOSC) Einreichungen von Kandidatengenen und Varianten mit einer Beschreibung des Zustands des Patienten und beurteilt, ob die Variante mit Informatikwerkzeugen und in vivo pathogen sein dürfte. Experimente. In Phase I (2015-2018) des UDN bestand das MOSC aus einem Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] und Zebrafish Core (University of Oregon), das gemeinsam an der Beurteilung von Fällen arbeitete. Mit Hilfe der Informatikanalyse und einer Reihe verschiedener experimenteller Strategien in Drosophila und Zebrafischen hat das MOSC bisher zur Diagnose von 132 Patienten beigetragen, die Identifizierung von 31 neuen Syndromen55, Entdeckung mehrerer neuer Krankheitsgene (z.B. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) und phänotypische Ausdehnung bekannter Krankheiten Gene (z. B. CACNA1A21, ACOX122).
Zusätzlich zu den Projekten innerhalb des UDN haben MOSC Drosophila Core-Forscher in Zusammenarbeit mit den Centers for Mendelian Genomics und anderen Initiativen (z.B. ANKLE223, TM2D3) zu neuen Entdeckungen von Krankheitsgenen beigetragen. 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) mit dem gleichen Satz von Informatik und Genetik Strategien, die für die UDN entwickelt wurden. Angesichts der Bedeutung von MO-Studien zur Diagnose seltener Krankheiten wurde das MOSC um einen C. elegans Core und einen zweiten Zebrafischkern (beide an der Washington University in St. Louis) für Phase II (2018-2022) des UDN erweitert.
Dieses Manuskript beschreibt ein in vivo funktionelles Studienprotokoll, das aktiv im UDN MOSC Drosophila Core verwendet wird, um festzustellen, ob Missense-Varianten funktionelle Folgen für das Protein von Interesse haben, indem transgene Fliegen, die menschliche Proteine. Das Ziel dieses Protokolls ist es, MO-Forschern zu helfen, mit klinischen Forschungsgruppen zusammenzuarbeiten, um experimentelle Beweise dafür zu liefern, dass eine Kandidatenvariante in einem Gen von Interesse funktionelle Folgen hat, wodurch die klinische Diagnose erleichtert wird. Dieses Protokoll ist am nützlichsten in einem Szenario, in dem ein Drosophila-Forscher von einem klinischen Forscher angesprochen wird, der einen Patienten mit einer seltenen Krankheit mit einer bestimmten Kandidatenvariante in einem Gen von Interesse hat.
Dieses Protokoll kann in drei Elemente unterteilt werden: (1) Sammeln von Informationen, um die Wahrscheinlichkeit zu beurteilen, dass die Variante des Interesses für den Patientenphänotyp verantwortlich ist, und die Durchführbarkeit einer funktionellen Studie in Drosophila, (2) bestehende genetische Instrumente und die Etablierung neuer Instrumente und (3) die Durchführung funktioneller Studien in vivo. Das dritte Element kann weiter in zwei Unterelemente unterteilt werden, je nach der Bewertung der Funktion einer Interessenvariante (Rettungsexperiment oder überexpressionbasierte Strategien). Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll an viele Szenarien außerhalb der Forschung an seltenen monogenen Krankheiten angepasst und optimiert werden kann (z. B. häufige Krankheiten, Gen-Umwelt-Wechselwirkungen und pharmakologische/genetische Screens zur Identifizierung therapeutischer Ziele). Die Fähigkeit, die Funktionalität und Pathogenität von Varianten zu bestimmen, wird nicht nur dem Patienten von Interesse durch eine genaue molekulare Diagnose nützen, sondern auch breitere Auswirkungen auf die translationale und wissenschaftliche Grundlagenforschung haben.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Stämme für die Transgenese von UAS-humanen cDNAs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injektionsstämme für die Transgenese (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24871</td><td>Spezifisches Reagenz: VK33 (3. Chromosom) Injektionsleitung</td></tr><tr><td>Injektionsstämme für die Transgenese (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24872</td><td>Spezifisches Reagenz: VK37 (2. Chromosom) Injektionslinie</td></tr><tr><td>Plasmid DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Klonierungsvektor</td><td>Thermo Fisher</td><td>#12536-017</td><td>Spezifisches Reagenz: pDONR221</td></tr><tr><td>Drosophila Transgenese-Vektor</td><td>Geschenk von Drs. Johannes Bischof und Dr. Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)</td><td></td><td>Spezifisches Reagenz: pGW-HA.attB</td></tr><tr><td>Molekularbiologische Kits und Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A2790</td><td>Spezifisches Reagenz: Agarose (molekularbiologische Qualität)</td></tr><tr><td>Chemisch kompetente Zellen (E. coli)</td><td>Thermo Fisher</td><td>#18265017</td><td>Spezifisches Reagenz: DH5&alpha;</td></tr><tr><td>DNA-Gel-Extraktionskit</td><td>Thermo Fisher</td><td>#K210012</td><td>Spezifisches Reagenz: PureLink Gel-Extraktionskit</td></tr><tr><td>DNA-Isolations- und Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>#27104</td><td>Spezifisches Reagenz: QIAprep Spin Miniprep Kit</td></tr><tr><td>High Fidelity Polymerase</td><td>NEB</td><td>#M0491</td><td>Spezifisches Reagenz: Q5 Polymerase-Kit</td></tr><tr><td>Rekombinase-vermitteltes Klonierungssystem</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11789020</td><td>Spezifisches Reagenz: Gateway BP Clonase Kit</td></tr><tr><td>Rekombinase vermitteltes Klonierungssystem</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11791100</td><td>Spezifisches Reagenz: Gateway LR Clonase II Enzym Kit</td></tr><tr><td>Site Directed Mutagenese</td><td>Kit Agilent</td><td>#200523</td><td>Spezifisches Reagenz: Quick Change II Mutagenese Kit</td></tr><tr><td>Elektroretinogramm Rig zugehörige Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ERG Analyse</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Spezifisches Reagenz: Axon pCLAMP 10 Datensoftwarepaket</td></tr><tr><td>ERG Datenerfassung</td><td>LabX</td><td>#R150358</td><td>Spezifisches Reagenz: ISO-DAM Isolierter biologischer Verstärker</td></tr><tr><td>ERG-Stimulator</td><td>Astro-Med</td><td>#S48</td><td>Spezifisches Reagenz: Rechteckpulsstimulator</td></tr></tbody></table>

in vivo funktionelle studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen varianten mit drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie haben Vollgenom- und Ganzexom-Datensätze sowohl für die klinische Diagnose als auch für die Spitzenforschung der Humangenetik zugänglicher gemacht. Obwohl eine Reihe von Silico-Algorithmen entwickelt wurden, um die Pathogenität der in diesen Datensätzen identifizierten Varianten vorherzusagen, sind funktionelle Studien entscheidend, um zu bestimmen, wie spezifische genomische Varianten die Proteinfunktion beeinflussen, insbesondere für Missense Varianten. Im Undiagnosed Diseases Network (UDN) und anderen Forschungskonsortien für seltene Krankheiten werden Modellorganismen (MO) einschließlich Drosophila, C. elegans,Zebrafische und Mäuse aktiv verwendet, um die Funktion von vermeintlichen menschlichen Krankheiten zu bewerten. Varianten. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur funktionellen Bewertung seltener menschlicher Varianten, die im Model Organisms Screening Center Drosophila Core des UDN verwendet werden. Der Workflow beginnt mit dem Sammeln von menschlichen und MO-Informationen aus mehreren öffentlichen Datenbanken, wobei die MARRVEL-Webressource verwendet wird, um zu beurteilen, ob die Variante wahrscheinlich zum Zustand eines Patienten beiträgt, sowie effektive Experimente auf der Grundlage verfügbarer Wissen und Ressourcen. Als nächstes werden genetische Werkzeuge (z.B. T2A-GAL4 und UAS-Human cDNA-Linien) generiert, um die Funktionen von Varianten von Interesse an Drosophilazu bewerten. Bei der Entwicklung dieser Reagenzien können zweigleisige funktionelle Assays auf Basis von Rettungs- und Überexpressionsexperimenten durchgeführt werden, um die Variantenfunktion zu bewerten. Im Rettungszweig werden die endogenen Fliegengene "humanisiert", indem das orthologe Drosophila-Gen durch Referenz- oder Varianten-Humantransgene ersetzt wird. Im Überexpressionszweig werden die Referenz und die Variante menschlicher Proteine exogen in einer Vielzahl von Geweben angetrieben. In beiden Fällen kann jeder verschreibbare Phänotyp (z. B. Letalität, Augenmorphologie, Elektrophysiologie) unabhängig von der Krankheit des Interesses als Auslese verwendet werden. Die beobachteten Unterschiede zwischen Referenz- und Variantenallelen deuten auf einen variantenspezifischen Effekt und damit auf eine wahrscheinliche Pathogenität hin. Dieses Protokoll ermöglicht schnelle, in vivo Bewertungen von vermeintlichen menschlichen krankheitserregenden Varianten von Genen mit bekannten und unbekannten Funktionen.

Funktionelle Studie von de novo Missense Variant in EBF3 Verbunden mit neuroentwicklungsbedingten Phänotypen Bei einem 7-jährigen Mann mit neuroentwicklungsbedingten Phänotypen wie Hypotonie, Ataxie, globaler Entwicklungsverzögerung und ausdrucksstarker Sprachstörung, Ärzte und Humangenetiker am National Institutes of Health Undiagnosed Diseases Project (UDP) identifizierte eine de novo missense Variante (p.R163Q) in EBF3 (Early B-Cell Factor 3)15, ei...

Ziel dieses Protokolls ist es, das Design und die Leistung von In-vivo-Experimenten in Drosophila melanogaster zu skizzieren, um die funktionellen Folgen seltener Genvarianten im Zusammenhang mit menschlichen Krankheiten zu bewerten.

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns festzustellen, ob Fehlsinnvarianten in menschlichen Genen, die mit Krankheiten in Verbindung stehen, die Proteinfunktion beeinflussen. Dies ist selbst mit modernsten Algorithmen rechnerisch schwer zu erreichen. Diese Technik ermöglicht eine schnelle Analyse von Missense-Varianten in menschlichen Proteinen mit einem In-vivo-System Drosophila melanogaster, das schneller und kostengünstiger als Wirbeltiermodellorganismen ist.Der Nachweis, dass eine bestimmte Variante die Proteinfunktion direkt beeinflusst, trägt direkt zur Diagnose seltener Krankheiten bei und dient als Ausgangspunkt für die Analyse von Krankheitsmechanismen und potenziellen Therapien. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, wenn Varianten untersucht werden, die mit seltenen Krankheiten in Verbindung stehen, aber es kann auf häufigere Krankheiten wie Autismus und Krebs angewendet werden. Die Identifizierung reproduzierbarer Phänotypen in Fliegen, die die Proteinfunktion widerspiegeln, kann eine Herausforderung sein.Die Phänotypen können von Gen zu Gen variieren und subtil sein. Funktionelle Studien von Varianten in menschlichen Proteinen mit Drosophila können auf der Grundlage von Rettungsexperimenten oder Überexpressionsstudien durchgeführt werden. Vor Beginn des Verfahrens, sammeln Sie Informationen über das menschliche Gen von Interesse und seinen Modellorganismus Orthologs.Um die Variantenfunktion durch Überexprimierung von Referenz- und Varianten-Humanproteinen im visuellen Flugsystem zu testen, erzeugen Sie transgene Fliegen, die referenz- oder variantenweise menschliche cDNAs unter der Kontrolle der Vorstrom-Aktivierungssequenz oder des UAS-Systems Gal4 ausdrücken. Um eine bestimmte Gal4-Linie auszuwählen, um die menschlichen Proteine in einem bestimmten Fliegengewebe auszudrücken, kreuzen Sie drei bis fünf jungfräuliche Weibchen aus der Gal4-Linie mit drei bis fünf Männchen aus jeder der transgenen Linien der UAS human cDNA in einzelnen Durchstechflaschen oder in Duplikaten. Übertragen Sie die Kreuze alle zwei bis drei Tage, um so viele Tiere wie möglich von einem einzigen Kreuz zu erhalten, und untersuchen Sie das geschlossene Tier unter einem Seziermikroskop, um Unterschiede zwischen der Referenz- und den Variantenstämmen zu identifizieren.Wenn ein sichtbarer Defekt vorliegt, stellen Sie die Fliegen ab, um die Phänotypen zu dokumentieren. Um Fliegen zu erzeugen, um funktionelle Defekte im visuellen System zu testen, kreuzen Jungfrauenweibchen von der Rhodopsin-1-Gal4-Linie zu Männchen mit Referenz- oder Varianten-UAS-Human-cDNA-Transgenes, um die menschlichen Proteine auszudrücken, die an den Photorezeptoren R1 bis R6 in der Fliegennetzhaut von Interesse sind. Sobald die Fliegen zu schließen beginnen, sammeln Sie die Nachkommen in frische Fläschchen und geben Sie die Fläschchen zu einem Inkubator eingestellt auf die entsprechende experimentelle Temperatur für weitere drei Tage, damit das visuelle System reifen.Am Ende der Inkubation, immobilisieren Sie die Fliegen mit einer geeigneten Anästhesie-Methode und kleben Sie sanft eine Seite jeder Fliege auf ein Glasmikroskop-Dia. Nach dem Aufstellen eines Elektroretinogramm-Rigs eine 1,2-Millimeter-Glaskapillare in einen Nadelzieher geben und das Kapillarrohr brechen, um zwei scharfe hohle konische Elektroden mit weniger als 0,5 MillimeterDurchmessern zu erhalten. Füllen Sie die Kapillaren mit 100 Millimolaren-Salzlösung, um Luftblasen zu vermeiden und schieben Sie die Glaskapillaren über die Silberdrahtelektroden.Klemmen Sie die Kapillaren an Ort und Stelle und akklimatisieren Sie die Fliegen, um Dunkelheit für mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur zu vervollständigen. Legen Sie am Ende der Behausung die Folie mit den Fliegen auf das Aufnahmegerät und bewegen Sie die Mikromanipulatoren, die die Referenz- und Aufzeichnungselektroden in der Nähe der Flugweite des Interesses tragen. Beobachten Sie die Spitze der Elektrode, legen Sie vorsichtig die Referenzelektrode in den Thorax der Fliege, die die Nagelhaut durchdringt, und legen Sie die Aufnahmeelektrode auf die Oberfläche des Auges.Achten Sie bei erfolgreichen Elektroretinogrammaufnahmen darauf, die Aufnahmeelektrode entsprechend mit Druck zu belasten, so dass sie ein kleines Grübchen verursacht, ohne in das Auge einzudringen. Wenn die Elektroden platziert sind, schalten Sie das Primärlicht für drei Minuten aus, um die Fliegen in die dunkle Umgebung zu akklimatisieren. Am Ende der Wiederakklimatisierungsphase öffnen und schließen Sie den Verschluss einmal pro Sekunde für 20 Sekunden, indem Sie die Elektroretinogramme von mindestens 15 Fliegen pro Dia pro Genotyp pro Zustand mit den gleichen Elektroden aufzeichnen.Wenn die Aufnahmen von der Referenz und Variantenfliegen vollständig sind, vergleichen Sie die Elektroretinogramm-Aufnahmen aus der Referenz, Variante und Steuerung, um Unterschiede zu bewerten. Anschließend evaluieren Sie die Elektroretinogrammdaten auf Veränderungen bei Transienten, Depolarisation, Off-Transienten und Repolarisation. In diesem repräsentativen Experiment wurden überexpressionbasierte Studien für TBX2 durchgeführt, da die menschliche Referenz TBX2 nicht in der Lage war, das orthologe Fliegengen funktionell zu ersetzen, was rettungsbasierte Strategien unmöglich machte.Wenn Referenz humanes TBX2 im sich entwickelnden Auge und Inteilen des Gehirns mit augenlosem Gal4 überexprimiert wurde, führt die Überexpression zu einer ungefähr 85%tödlichen Und signifikanten Verringerung der Augengröße. Im Gegensatz dazu ist die Variante Transgen weniger potent bei der Entstehung von Letalität und induziert einen kleinen Augen-Phänotyp mit dem gleichen Treiber unter identischen experimentellen Bedingungen, was darauf hindeutet, dass die Variante die Proteinfunktion beeinflusst. Darüber hinaus verursacht die Überexpression eine signifikante Veränderung der Elektroretinogrammspur, wenn ein Referenz-Human-TBX2 in den Photorezeptoren mit Rhodopsin Gal4 überexprimiert wird.Dieser Phänotyp ist milder, wenn das Variantenprotein exprimiert wird, was einen weiteren Beweis dafür liefert, dass die Variante des Interesses die Proteinfunktion in vivo beeinflusst. Es ist wichtig zu beachten, dass jedes Gen einzigartig ist, so dass es kein einziges Experiment gibt, das die Auswirkungen aller krankheitsassoziierten Varianten bewerten kann. Neben der Arbeit mit humanen cDNAs kann man auch feststellen, ob die Variante funktionelle Folgen hat, indem analoge Varianten in evolutionär konservierte Rückstände des orthologen Fliegengens eingeführt werden.Mit dieser Methode haben wir in Zusammenarbeit mit dem Undiagnosed Disease Network und anderen Gruppen zu einer Reihe von Genentdeckungsstudien für menschliche Krankheiten beigetragen.

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Research

Forschung

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Genetics

Genetik

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

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Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

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In Vivo Modellierung des Morbid Human Genome mit Danio rerio

Wir präsentieren einen strategischen Plan und ein Protokoll zur Identifizierung nicht-kodierender genetischer Varianten, die die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors (TF) beeinflussen. Es wird ein detailliertes experimentelles Protokoll für die elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assay (EMSA) und den DNA-Affinitäts-Präzipitations-Assay (DAPA) der Genotyp-abhängigen TF-DNA-Bindung bereitgestellt.

Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um effizient auf viele Datenbanken für menschliche und Modellorganismen zuzugreifen und diese zu analysieren. Dieses Protokoll veranschaulicht die Verwendung von MARRVEL zur Analyse von Krankheitsverursachenden Varianten, die bei Sequenzierungsbemühungen der nächsten Generation identifiziert wurden.

Navigieren in MARRVEL, einem webbasierten Tool, das Informationen zur Humangenomik und Modellgenetik integriert

Wir präsentieren ein Protokoll mit einem vorwärts genetischen Ansatz, um Mutanten zu überprüfen, die Neurodegeneration in Drosophila melanogasterzeigen. Es beinhaltet einen Klettertest, histologische Analysen, Genkartierung und DNA-Sequenzierung, um letztendlich neue Gene im Zusammenhang mit dem Prozess des Neuroprotektions zu identifizieren.

In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster

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Dieses Protokoll beschreibt, wie die Expression einer großen Reihe von Genen auf der klonalen Ebene zu bewerten. Einzellige RT-qPCR produziert höchst zuverlässige Ergebnisse mit einer starken Empfindlichkeit für Hunderte von Proben und Gene.

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