Räumliche und zeitweilige Kontrolle der Murine Melanom-Initiation aus Mutant Melanocyte Stammzellen

Melanom ist weltweit weit verbreitet, mit zunehmender Inzidenz. Diese Protokolle ermöglichen es, die frühen Stadien der Melanominitiierung sorgfältig zu kontrollieren, was das Studium seiner Entwicklung erleichtert. Durch die Kontrolle der Zeit und des Ortes der Melanozyten-Stammzellaktivierung haben wir die Fähigkeit, die Veränderungen innerhalb der Stammzellpopulation und ihre neue Stammmelanom-Initiierung zu erkennen.

Demonstrieren daterieren das Verfahren dahihm Kim und Luye An, Absolventen des Labors. Zwei bis drei Tage vor Beginn des Eingriffs verwenden Sie einen elektrischen Trimmer, um die dorsale Haut von jeder anästhesierten sieben Wochen alten Maus zu rasieren. Verwenden Sie am Tag des Experiments einen Wattestäbchen, um eine dünne Schicht Enthaarungscreme auf die exponierte Haut aufzutragen.

Sobald die Creme gleichmäßig aufgetragen wurde, verwenden Sie saubere Wattestäbchen, um die Creme zu entfernen, gefolgt von sanftem Wischen mit einem feuchten Tuch, um Restcreme zu entfernen. Dann kehren Sie jede Maus in ihren Hauskäfig mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung zurück. Für die UV-B-Bestrahlung die Rückenhaut mit UV-B-Schutzmaterial bedecken, so dass nur der gewünschte Bereich freigelegt wird, und die UV-Kammer mit einem UV-beständigen Deckel bedecken.

Schalten Sie dann die UV-B-Lampe ein, um die Maus für den entsprechenden Versuchszeitraum zu bestrahlen, bevor Sie die Maus in einen leeren Käfig mit Überwachung bis zur vollständigen Wiederherstellung zurückbringen. Um die Hautproben zu isolieren, verwenden Sie einen elektrischen Trimmer, um haare aus dem dorsalen Hautbereich der eingeschläferten bestrahlten Mäuse zu entfernen, und bürsten Sie die exponierte Haut leicht mit einem fusselfreien Gewebe, um den Bereich zu räumen. Machen Sie einen kleinen Schnitt mit scharfer Schere knapp über der Basis des Schwanzes und legen Sie große, stumpfe Schere in den Schnitt ein, um das subdermale Bindegewebe zu trennen.

Mit einer scharfen Schere vorsichtig am Rand des von Interesse interessierten Hautbereichs schneiden, um die Gewebeprobe zu isolieren und das ausgeschnittene Hautgewebe auf ein sauberes Papiertuch zu legen. Dann verwenden Sie stumpfe Zange, um die Haut so zu dehnen, dass sie am Handtuch haftet und straff ist. Wenn alle Proben geerntet sind, legen Sie eine Hautprobe und papiertuchträger in ein Stück gefaltetes Filterpapier unmittelbar neben der Falte, wobei darauf zu achten ist, dass die Probe glatt und nicht gefaltet oder zerknittert ist.

Schließen Sie die Seiten des Filterpapiers mit Heftklammern, und schneiden Sie das Papier. Dann tauchen Sie die Proben drei bis fünf Stunden bei Raumtemperatur vollständig in 10% neutral gepuffertes Formalin ein, bevor Sie das Gewebe mit zwei fünfminütigen Wärten in entionisiertem Wasser waschen. Nach dem zweiten Waschen, entfernen Sie vorsichtig restliches Material aus dem Hautgewebe, und trimmen Sie die Ränder der Proben, so dass sie nicht gezackt werden.

Als nächstes machen Sie drei sagittale Schnitte in jeder Probe, so dass die Breite der Streifen nicht mehr als fünf Millimeter beträgt, und machen Querschnitte, so dass die Proben nicht mehr als 20 Millimeter breit sind. Positionieren Sie eine Kryoform mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Medium in einer Hochformatausrichtung, und legen Sie vier bis fünf Hautstücke auf das OCT. Wenn alle Teile an Ort und Stelle sind, verwenden Sie zwei Paare von feinen Zangen, um die lange Kante jedes Stück hautauf den Boden der Kryoform zu bringen, so dass die Proben innerhalb des OCT vertikal und senkrecht zur Basis der Form sind.

Dann füllen Sie die Form mit zusätzlichem OCT auf die zweite Lippe und legen Sie die Form auf eine flache Oberfläche eines Stücks Trockeneis, mit Zangen, um alle Hautteile einzustellen, die während der Übertragung verschoben haben können, wenn der Block beginnt, nach Bedarf zu gefrieren. Wenn Mäuse sieben Wochen nach der Geburt sind, ist ihre dorsale Haut in Telogen. Während Telogen, Haarfollikel und Melanozyten Stammzellen sind bekannt, in einem ruhigen Ruhezustand zu sein, und die Haut sollte kein signifikantes Haarwachstum nach der Rasur zeigen.

Chemische Enthaarung kann jedoch haarfollikel Stammzellaktivierung induzieren, was zu einem signifikanten Haarwachstum innerhalb der Region des Interesses. Da die chemische Enthaarung die Aktivierung sowohl von Haarfollikel als auch von Melanozytenstammzellen signifikant induzieren kann, können Melanom-anfällige Melanozyten-Stammzellen in einem aktiven Zustand Tumore bilden und mikroskopische Melanominitierung kann innerhalb von zwei Wochen nach der chemischen Enthaarung beobachtet werden. UV-B-Bestrahlung kann auch Tumorinitiierung von stillen, tumoranfälligen Melanozytenstammzellen induzieren.

Wichtig ist, dass UV-B die direkte Translokation von Melanozyten-Stammzellen aus ihrer follikulären Stammzellnische in die interfollikuläre Epidermis induziert. Darüber hinaus kann UV-B eine melanozyte Stammzell-Ursprung bei der Bildung von kutanem Melanom in der gesamten interfollikulären Epidermis induzieren. Ähnlich wie bei der dorsalen Haut kann die UV-B-induzierte Melanominitiierung insbesondere in anderen Hautbereichen, wie z. B. der Ohrenhaut, beobachtet werden.

Im Vergleich zur Kontroll-Ohrhaut, die mit UV-resistentem Tuch bedeckt ist, zeigt die UV-B-infektionsfreie Ohrenhaut eine höhere Pigmentierung aufgrund einer höheren Belastung durch Melanominitierung. Verschiedene Dosen von UV-B können unterschiedliche Auswirkungen auf die Maushaut und Melanozytenaktivität haben. Daher ist es wichtig, die Bestrahlungsdosis vor Beginn des Experiments zu bestimmen und zu optimieren.