Name: Lieferung von Antikörpern in das Murine Gehirn über Konvektionsverstärkte Lieferung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Erfahren Sie die konvektionsverstärkte Lieferung von Antikörpern ins murine Gehirn mittels Stufenkathetersystem. Diese Methode umgeht die Blut-Hirn-Schranke mit minimalem Gewebeschaden und ermöglicht präzise therapeutische Interventionen bei neurologischen Erkrankungen.

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Unterstützt wurde diese Arbeit durch Stipendien der Universität Zürich (FK-15-057), der Novartis Stiftung für medizinisch-biologische Forschung (16C231) und der Schweizer Krebsforschung (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) an Johannes vom Berg und BRIDGE Proof of Concept (20B1-1 _177300) an Linda Schellhammer.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Kantonsveterinäramt unter der Lizenznummer ZH246/15 zugelassen.
1. Vorbereitung der Step Katheter
<ol><li>Herstellung eines geschmolzenen Kieselsäurerohres für den Schritt des Katheters
	<ol>
<li>Schneiden Sie die geschmolzene Kieselsäurekapillare mit einem Innendurchmesser von 0,1 mm und einer Wandstärke von 0,0325 mm Rohren auf eine Länge von 30 mm.</li>
		<li>Untersuchen Sie die Schläuche auf Risse und politisieren Sie die Enden mit einer Mikroschmiede, um sicherzustellen, dass die Rohröffnungen eine glatte Oberfläche haben.</li>
	</ol></li>
	<li>Befestigung des Innenrohres in einer Metallnadel
	<ol>
<li>Montieren Sie eine 27 G Nadel auf einer 10-L-Spritze und legen Sie die Spritze in einen stereotaktischen Roboter.</li>
		<li>Bewegen Sie die Spritze mit dem Roboter über eine harte Oberfläche und berühren Sie sie mit der Nadelspitze. Diese Position sollte in der Software notiert oder gespeichert werden, da sie als Referenzfläche für die Einstellung der Länge des Katheterschritts dient.</li>
		<li>Elevate die Nadel, um die Platzierung der geschmolzenen Kieselsäure Kapillare innerhalb der Nadel zu ermöglichen</li>
		<li>Legen Sie die geschmolzene Kieselsäurekapillare so in die Nadel, dass 20 mm der Kapillare aus der Nadel herausragen.</li>
		<li>Mit einer Pipette gleichmäßig 2 l hochviskosen Cyanoacrylat-Klebstoff über die Kapillare verteilen, beginnend mit der Metallnadel und Veredelung 10 mm über dem unteren Ende der Kapillare, wie in Abbildung 2dargestellt.</li>
		<li>Mit dem stereotaktischen Roboter senken Sie die Nadel, bis die Spitze der Metallnadel 1 mm über der Referenzoberfläche liegt. Auf diese Weise wird die geschmolzene Kieselsäurekapillare in der Metallnadel fixiert und bildet einen 1 mm Schritt von der Spitze der Metallnadel. Entfernen Sie einen Überschuss an Leimformung am Ende der Metallnadel, um eine Abstumpfung des Schritts zu vermeiden.</li>
		<li>Warten Sie 15 min, bis der Kleber aushärtet und die Spritze mit dem Katheter aus dem stereotaktischen Roboter entfernt. Bestätigen Sie, dass bei der Stufe alle überschüssigen Kleber entfernt wurde, indem Sie die Spitze des Katheters unter dem Mikroskop überprüfen.</li>
	</ol></li>
	<li>Testen des Schrittkatheters mit einem Agaroseblock
	<ol>
<li>0,6% Agaroselösung in PBS in einer herkömmlichen Gelschale vorbereiten und warten, bis sie polymerisiert ist. Die Agarose in ca. 20 mm x 20 mm Blöcke schneiden. Bis zur Verwendung die Blöcke in PBS eingetaucht.</li>
		<li>Füllen Sie die Schrittkatheterspritze manuell mit einer 0,4%-Lösung mit gefiltertem Trypanblau von 10 l. L.</li>
		<li>Geben Sie mit Dem stereotaktischen Roboter 1 l bei 0,2 l/min aus, um die Abdichtung des Kathetersschritts während des Fixierungsvorgangs zu bewerten. Trypan blue Lösung sollte nur auf der Spitze des Katheters sichtbar sein. Wischen Sie es mit einem Papiergewebe ab.</li>
		<li>Legen Sie den Agarose-Block in den stereotaktischen Roboter und kalibrieren Sie den Roboter, so dass die Spitze des Katheters auf die Oberfläche des Agarose-Blocks verwiesen wird.</li>
		<li>Programmieren Sie die Injektionsparameter für CED.<ol>
<li>Verwenden Sie für das Injektionsvolumen von 5 l die folgenden Schritte: 1 l bei 0,2 l/min, dann 2 l bei 0,5 l/min und 2 l bei 0,8 l/min. Passen Sie das endgültige Injektionsvolumen entsprechend dem spezifischen Versuchsplan an, indem Sie die Dauer der einzelnen Schritte proportional ändern.</li>
			<li>Um die Lösung in das murine Caudate Putamen (Striatum) zu injizieren, führen Sie eine solche Injektion in einer Position von 1 mm frontal und 1,5–2 mm seitlich aus Bregma in der Tiefe von 3,5 mm durch.</li>
			<li>Nach der Injektion den Katheter 2 min an Ort und Stelle lassen und dann bei 1 mm/min zurückziehen, um eine ordnungsgemäße Dispersion der Flüssigkeit im Gehirn und die Abdichtung des Injektionstraktes während der Katheterentfernung zu gewährleisten. HINWEIS: Je nach verwendeter stereotaktischer Roboter können alle Parameter in einem einzigen Skript programmiert werden. Ein Beispielskript ist als <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59675/CED_5_ul_striatum.txt" target="_blank">Ergänzendes Material</a>verfügbar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Starten Sie das CED-Verfahren und injizieren Sie 5 l Trypan-Blau-Lösung in den Agarose-Block.</li>
		<li>Bewerten Sie die Form der Wolke aus Trypanblau in der Agarose und mögliche Leckagen entlang des Kathetertraktes. Trypan blue sollte ein Ellipsoid oder eine runde Wolke mit der Mitte um die Katheterspitze und einem Durchmesser von mindestens 1 mm bilden. Kein größerer Rücklauf über die Spitze der Metallnadel sollte sichtbar sein.</li>
		<li>Legen Sie einen neuen Agarose-Block und starten Sie eine zweite Injektion von 1 l bei 0,2 l/min, um die Verstopfung des Katheters mit der Agarose zu beurteilen. Trypan blue sollte unmittelbar nach Beginn der Injektion wieder eine Wolke von der Spitze des Katheters bilden.</li>
		<li>Beurteilen Sie, ob das übrig gebliebene Volumen in der Spritze 3 l entspricht. Jegliche Abweichungen können auf ein Auslaufen von Flüssigkeit durch die Kathetermontage oder spritzenkolbende Richtung hinzeigen.</li>
		<li>Wenn alle Testinjektionen erfolgreich sind, ist der Katheter gut versiegelt, gerade und es wird keine Trypan-Blau-Lösung von anderenStellen als der Katheterspitze beobachtet, den Katheter mit deionisiertem H2 O (dH2O) waschen, bis keine Spuren von Trypanblau sichtbar sind und dann zehnmal wie folgt waschen: 70% Ethanol und 100% Ethanol, gefolgt von der erneuten Spülung mit 70% Ethanol und sauberem entionisiertem Wasser.</li>
		<li>Den Katheter unter trockenen Bedingungen aufbewahren.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Konvektionsverstärkte Lieferung von Antikörperlösung in das Murine Gehirn
HINWEIS: Je nach örtlichen Tierschutzvorschriften können für dieses Verfahren verschiedene Arten von Anästhetika, Analgetika und Antibiotika eingesetzt werden. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Injektionsanästhesie. Inhalationsanästhetika wie Isofluran können auch verwendet werden, indem eine Nasenmaske auf dem stereotaktischen Rahmen montiert wird. Darüber hinaus empfehlen wir, antibiotikazum Thema Infektionsprophylaxe ins Trinkwasser einzutragen.
<ol><li>Chirurgische Einrichtung
	<ol>
<li>Bereiten Sie Anästhetika und Antidiatlösungen vor. Mäuse können mit einer Dreikomponenten-Anästhesie, die Fentanyl (0,05 mg/kg), Midazolam (5 mg/kg) und Medetomidin (0,5 mg/kg) enthält, mit sterilem dH2 O verdünnt, sicher anästhesiert werden. Wir führen ein zweistufiges Weckverfahren mit zwei Gegenmittellösungen durch, eine mit Flumazenil (0,5 mg/kg) und Buprenorphin (0,1 mg/kg) in steriler dH2O (erste Gegenmittellösung). Die zweite enthält Atipamezol (2,5 mg/kg)in sterilem dH2 O (zweite Antidothlösung).</li>
		<li>Bereiten Sie eine Analgesielösung vor, die Carprofen (5,667mg/kg) enthält, die mit sterilem dH2 O verdünnt ist.</li>
		<li>Reinigen Sie den stereotaktischen Rahmen, das Heizkissen und die Elemente des stereotaktischen Roboters. Beachten Sie, dass nicht alle Teile des Roboters ohne Beschädigungsgefahr gereinigt werden können. Details zur Reinigung und Vorbereitung auf den Einsatz finden Sie im Handbuch des Roboters.</li>
		<li>Montieren Sie die Spritze mit dem Schrittkatheter und spülen Sie sie mehrmals mit dH2O, 70% Ethanol und 100% Ethanol, gefolgt von der erneuten Spülung mit 70% Ethanol und dH2O. Spülen Sie schließlich die Spritze mit PBS oder anderen Puffern, die zur Herstellung der Lösung für die intrakranielle Injektion verwendet werden, z. B. künstliche Zerebrospinalflüssigkeit. Der Kolben der Spritze sollte sich während des gesamten Eingriffs reibungslos und frei bewegen.</li>
		<li>Kalibrieren Sie die stereotaktische Robotersoftware mit dem stereotaktischen Rahmen.</li>
		<li>Testen Sie die stereotaktische Robotersoftware, indem Sie sicherstellen, dass sich die Roboterarme frei bewegen und die Einspritzpumpe richtig angeschlossen ist und den CED-Vorgang ohne Störungen durchführen kann. Dazu gehören das Testen der Roboterbewegung, die Ramminjektion, die Überprüfung des 2 min Warteschritts und die Geschwindigkeit des Katheterrückzugs. Alle Parameter sollten dem in Punkt 1.3.5 beschriebenen vorprogrammierten CED-Verfahren entsprechen.</li>
		<li>Legen Sie den Bohrer in den Bohrer ein. Es wird empfohlen, die Bohrer vor der Verwendung zu sterilisieren.</li>
		<li>Bereiten Sie Antikörperlösungen mit PBS oder anderen Pufferlösungen wie aCSF vor. 1 bis 20 g Antikörper in 5 l können in einem einzigen CED-Verfahren injiziert werden. Andere Mengen und Proteinmengen sollten vor der Durchführung des Experiments getestet werden. Beachten Sie, dass die Verwendung von Lösungen mit hoher Viskosität zu Katheterverstopfungen führen kann.</li>
		<li>Laden Sie die Spritze manuell mit dem verdünnten Antikörper.</li>
	</ol></li>
	<li>Antikörperinjektion per CED in Striatum
	<ol>
<li>Wiegen Sie die Maus und injizieren Sie die Dreikomponenten-Anästhesielösung entsprechend dem Körpergewicht in das Peritoneum. Beachten Sie die Injektionszeit. Übertragen Sie die Maus in einen separaten Käfig, der mit einem Heizkissen beheizt wird.</li>
		<li>Beobachten Sie die Maus, um zu bestimmen, wann die Sedierung beginnt. Sobald sich die Maus nicht mehr bewegt, tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen auf, um die Hornhaut während der Operation vor dem Austrocknen zu schützen. Die volle Sedierung beginnt in der Regel 10–15 min ab der Injektion der Dreikomponenten-Anästhesielösung.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Schmerzreaktionen mit dem Pinch-Reflex-Test, um eine vollständige Anästhesie des Tieres zu gewährleisten.</li>
		<li>Rasieren Sie den Kopf mit einem Haarschneider.</li>
		<li>Desinfizieren Sie die Haut mit Wattestäbchen, die in Jodlösung getränkt sind. Schrubben Sie die Haut dreimal in kreisförmiger Bewegung.</li>
		<li>Mit einem Skalpell, machen Sie einen 10 mm Hautschnitt entlang der Schädel-Mittellinie Veredelung auf der Augenhöhe.</li>
		<li>Fixieren Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen mit der Nasenklemme und den Ohrbügeln. Stellen Sie sicher, dass die Schädeloberfläche horizontal und fest gesichert ist. Neben der korrekten anatomischen Navigation ist dies auch entscheidend, um eine Neigung des Schädels während des Bohrens und des CED-Verfahrens zu vermeiden.</li>
		<li>Legen Sie die Spritze in den stereotaktischen Roboter.</li>
		<li>Synchronisieren Sie den Bohrer mit der Spitze des Katheters auf einem Referenzpunkt. Es ist entscheidend, dass die Beziehung zwischen der Position des Bohrers und der Spritze in der Software genau bestimmt wird, so dass die Injektion im gewünschten anatomischen Bereich des Gehirns durchgeführt werden kann.</li>
		<li>Ziehen Sie die Haut mit Zangen zurück und lokalisieren Sie Bregma auf der Schädeloberfläche.</li>
		<li>Referenzbregma in der Software mit der Spitze des Bohrers.</li>
		<li>Bewegen Sie den Bohrer in eine Position 1 mm frontal und 2 mm seitlich von bregma und bohren Sie ein Gratloch. Achten Sie darauf, die Dura mater nicht zu beschädigen.</li>
		<li>Bewegen Sie die Spritze über das Gratloch.</li>
		<li>Geben Sie 0,5–1 l aus der Spritze, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen im Katheter verbleiben.</li>
		<li>Starten Sie das unter Punkt 1.3.5 beschriebene CED-Programm. Beobachten Sie die Schädeloberfläche auf Spuren von flüssigem Rückfluss vom Injektionspunkt. Überwachen Sie die Atemfrequenz des Tieres.</li>
		<li>Sobald das CED-Programm beendet ist und der Katheter aus dem Gehirn entnommen wird, starten Sie die Einspritzpumpe bei 0,2 l/min, um während des CED nach Katheterverstopfung zu suchen. Wenn keine Verstopfung aufgetreten ist, sollten Sie sofort ein Tröpfchen der Injektionsmischung aus der Katheterspitze sehen.</li>
		<li>Vor der Wiederverwendung oder Lagerung des Katheters den Katheterschritt visuell auf Anzeichen von Beschädigung oder Verschleiß unter dem Mikroskop untersuchen und wie in Schritt 1.3.10 reinigen.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufwachverfahren
	<ol>
<li>Entfernen Sie die Maus vorsichtig aus dem stereotaktischen Rahmen.</li>
		<li>Waschen Sie die Operationsstelle mit steriler Salinelösung.</li>
		<li>Füllen Sie das Gratloch mit Zangen mit Knochenwachs.</li>
		<li>Schließen Sie die Haut mit dünnen Zangen und tragen Sie chirurgischen Kleber mit einer 10-L-Pipette über den Schnitt auf. Warten Sie 15–30 s, bis der Kleber polymerisiert ist.</li>
		<li>Analgesielösung durch subkutane Injektion auftragen. Beachten Sie die Zeit der Injektion.</li>
		<li>Wenden Sie die erste Antidiatlösung an. Beachten Sie die Zeit der Injektion.</li>
		<li>Übertragen Sie die Maus in einen separaten Käfig mit einem Heizkissen und überwachen Sie das Tier auf erschreckte Reflexe.</li>
		<li>Wenn die Maus 15 min nach Verabreichung der ersten Antidotenlösung nicht das volle Bewusstsein erlangt hat, wenden Sie die zweite Antithlösung durch subkutane Injektion an.</li>
		<li>Überwachen Sie Tiere während der Erholungsphase.</li>
		<li>Überprüfen Sie 1-2 h später sowie am nächsten Tag auf postoperative Komplikationen. Falls erforderlich, wenden Sie die Analgesie erneut an.</li>
		<li>Zur Infektionsprophylaxe Sulfadoxin (Endkonzentration 0,08% w/v) und Trimethoprim (Endkonzentration 0,016% w/v) zu Trinkwasser hinzufügen, zu dem die Tiere 1 Woche nach der Operation ad libitum Zugang haben.</li>
	</ol></li>
</ol>

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Johannes vom Berg wird als Erfinder der Patentanmeldung (PCT/EP2012/070088) der Universität Zürich erwähnt. Michal Beffinger, Linda Schellhammer und Johannes vom Berg werden als Erfinder einer Patentanmeldung (EP19166231) der Universität Zürich genannt. Die Autoren haben keine zusätzlichen finanziellen Interessen.

Konvektionsverstärkte Abgabe, oder druckvermittelte Medikamenteninfusion in das Gehirn, wurde erstmals Infusion entost3vorgeschlagen. Dieser Ansatz verspricht Perfusion von großen Gehirnvolumen hinter der Blut-Hirn-Schranke in einer kontrollierten Weise2. Bisher wurden jedoch nur wenige klinische Studien mit diesem Ansatz durchgeführt, teilweise weil CED in einem klinischen Setup sich als technisch anspruchsvoll24,25</sup...

Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) bildet eine halbdurchlässige Grenze, die das zentrale Nervensystem (ZNS) von der Durchblutung trennt. Das Erreichen des ZNS mit Therapeutika ist jedoch im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten notwendig, wie Hirntumoren, Alzheimer -Krankheit (AD) oder Parkinson (PD) unter anderem1. Dies wird wichtig bei der Entwicklung neuer Therapien, vor allem, wenn das getestete Medikament eine schlechte BBB-Permeabilität aufweist oder seine systemische Exposition zu gefährlicher Toxizität führen kann1,2. Einige der klinisch verwendeten Antikörper zeigen beide Eigenschaften. Eine Lösung für dieses Problem wäre die Bereitstellung der Therapeutika direkt hinter der BBB.
Konvektionsverstärkte Abgabe (CED) ist eine neurochirurgische Technik, die eine effektive Perfusion großer Gehirnvolumina ermöglicht. Dies wird durch die chirurgische Installation eines oder mehreren Katheter im Zielbereich erreicht. Während der Wirkstoffanwendung bildet sich bei der Öffnung des Katheters ein Druckgradient, der zur treibenden Kraft der Infusatendispersion im Gewebe3,4wird. Es ist also die Dauer der Infusion und nicht die Diffusionskoeffizienten, die den Durchfusionsbereich2,4,5bestimmen. Dies ermöglicht eine gleichmäßige Abgabe des Infusatübereinens über ein viel größeres Gehirnvolumen im Vergleich zu herkömmlichen, diffusionsbasierten intracerebralen Injektionsmethoden2,6. Gleichzeitig hat diese Abgabemodalität ein geringeres Risiko von Gewebeschäden2. Dementsprechend kann CED eine sichere und wirksame Verabreichung konventioneller Chemotherapeutika zur Behandlung von ZNS-Tumoren sowie die Abgabe von immunmodulatorischen Wirkstoffen oder agonistischen und antagonistischen Antikörpern bei einer Vielzahl anderer ZNS-Erkrankungen ermöglichen2 ,7,8,9. CED wird derzeit in Therapien der Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, sowie high-Grade-Gliom2,7,8,10,11getestet.
Katheter-Design und das Injektionsschema gehören zu den wichtigsten Faktoren, die das Ergebnis von CED 10,12,13,14,15,16beeinflussen. Darüber hinaus erfordert es spezifische physikalisch-chemische Eigenschaften des Infusaten, einschließlich der moderaten Größe der Partikel, eine anionische Ladung und geringe Gewebeaffinität 10,17. Jeder dieser Parameter muss potenziell an die histologischen Merkmale der Hirnregion angepasst werden, umanvisiertzu werden 2,10,17.
Hier beschreiben wir die Methodik zur Durchführung von CED einer Antikörperlösung in das Caudate Putamen (Striatum) von Mäusen. Darüber hinaus umfasst das Protokoll die Vorbereitung von Schrittkathetern in einem Laboraufbau, deren Prüfung in vitro und die Durchführung des CED.
Es gibt mehrere Katheter-Designs in der Literatur, die sich durch die Form der Kanüle, die verwendeten Materialien und die Anzahl der Katheteröffnungen12,15,18,19,20 unterscheiden ,21,22. Wir verwenden einen Stufenkatheter aus einer geschmolzenen Kieselsäurekapillare, die 1 mm aus einer stumpfen Metallnadel herausragt. Dieses Katheter-Design kann leicht in einem Forschungslabor hergestellt werden und liefert reproduzierbar gute CED-Ergebnisse, wenn es in vitro mit Agarose-Blöcken mit physikalischen Parametern getestet wird, die dem Gehirnparenchym in vivo23ähneln.
Darüber hinaus implementieren wir ein Ramping-Regime für die Bereitstellung von 5 L Infusate in vivo. In einem solchen Protokoll wird die Injektionsrate von 0,2 l/min auf maximal 0,8 l/min erhöht, wodurch die Wahrscheinlichkeit eines infusaten Refluxs entlang des Katheters sowie das Risiko einer Gewebeschädigung16minimiert wird. Mit diesem Protokoll haben wir im Laufe von 11 min 30 s erfolgreich Mäuse mit bis zu 20 g Antikörpern in 5 l PBS verabreicht.
Das Protokoll kann leicht für andere Infusionsvolumina oder für die Injektion verschiedener anderer Substanzen, z.B. Chemotherapeutika, Zytokine, Viruspartikel oder Liposomen2,10,14,18, ,22. Bei verwendung von Infusate mit drastisch unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften im Vergleich zu einer Phosphatgepufferten Saline (PBS) oder einer künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) Lösung von Antikörpern werden zusätzliche Validierungsschritte empfohlen. Für Kathetermontage, Validierung und CED beschreiben wir alle Schritte mit einem stereotaktischen Roboter mit einer Bohr- und Einspritzeinheit, die auf einem normalen stereotaktischen Rahmen montiert ist. Dieses Verfahren kann auch mit einem manuellen stereotaktischen Rahmen durchgeführt werden, der mit einer programmierbaren Mikroinfusionspumpe verbunden ist, die die beschriebenen Glasmikrospritzen antreiben kann.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; L Spritze</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>27 G Nadel mit stumpfem Ende</td><td>Hamilton</td><td>7762-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Janssen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Knochenwachs</td><td>Braun</td><td>1029754</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Indivior Schweiz AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dentalbohrer, Stahl, Größe ISO 009</td><td>Hager & Meisinger</td><td>1RF009</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Reuss-Chemie AG</td><td>179-VL03K-/1</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Helvepharm AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran, 2000 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>Flumazenil</td><td>Labatec Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hohe Viskosität Cyanacrylatkleber</td><td>Migros</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jodlösung</td><td>Mundipharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidin</td><td>Orion Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Roche Pharma AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Bausch + Lomb</td><td>Vitamin A Blache</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonaler Ziegen-Anti-Ratten-IgG-Antikörper (H+L) gekoppelt mit Alexa Fluor 647</td><td>Jackson Immuno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpelle</td><td>Braun</td><td>BB518</td><td></td></tr><tr><td>Silica-Schlauch Innendurchmesser 0,1 mm, Wandstärke 0,0325 mm</td><td>Postnova</td><td>Z-FSS-100165</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Rahmen für Mäuse</td><td>Stoelting</td><td>51615</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktischer Roboter</td><td>Neurostar</td><td>Bohr- und Injektionsroboter</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Topischer Gewebekleber</td><td>Zoetis</td><td>GLUture</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blau</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Wasser</td><td>Bichsel</td><td>1000004</td><td></td></tr></tbody></table>

lieferung von antikörpern in das murine gehirn über konvektionsverstärkte lieferung

Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery

Konvektionsverstärkte Abgabe (CED) ist eine neurochirurgische Technik, die eine effektive Perfusion großer Gehirnvolumina mit einem Kathetersystem ermöglicht. Ein solcher Ansatz bietet eine sichere Abgabemethode, die die Blut-Hirn-Schranke (BBB) passiert, wodurch eine Behandlung mit Therapeutika mit schlechter BBB-Permeabilität oder solchen, bei denen eine systemische Exposition nicht erwünscht ist, z. B. aufgrund von Toxizität, ermöglicht wird. CED erfordert eine Optimierung des Katheterdesigns, des Injektionsprotokolls und der Eigenschaften des Infusaten. Mit diesem Protokoll beschreiben wir, wie CED einer Lösung durchgeführt wird, die bis zu 20 g eines Antikörpers in das Caudate-Putamen von Mäusen enthält. Es beschreibt die Vorbereitung von Stepkathetern, deren Testung in vitro und die Durchführung des CED bei Mäusen mit einem Hochlauf-Injektionsprogramm. Das Protokoll kann leicht auf andere Infusionsvolumina eingestellt werden und kann zur Injektion verschiedener Tracer oder pharmakologisch aktiver oder inaktiver Substanzen, einschließlich Chemotherapeutika, Zytokinen, Viruspartikeln und Liposomen, verwendet werden.

Dieses Protokoll ermöglicht die Vorbereitung von Schrittkathetern (Abbildung 1) für den Einsatz im CED-Verfahren in einer Laborumgebung. Um die Katheter auf Leckagen, Reflux entlang des Nadeltraktes und Verstopfung zu kontrollieren, empfehlen wir die Durchführung von Injektionen eines Farbstoffs, z.B. Trypan-Blaulösung, in einen Agaroseblock. Abbildung 3 zeigt eine Wolke aus Trypanblau, die sich nach der Injektion von 1 l bei 0,5 l/Minute mit einem CED-Katheter ...

Konvektionsverstärkte Abgabe (CED) ist eine Methode, die eine effektive Abgabe von Therapeutika in das Gehirn durch direkte Perfusion großer Gewebevolumina ermöglicht. Das Verfahren erfordert den Einsatz von Kathetern und ein optimiertes Injektionsverfahren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik für CED eines Antikörpers in ein Maushirn.

Lieferung von Antikörpern in das Murine Gehirn über Konvektionsverstärkte Lieferung

Convection-enhanced delivery (CED) is a neurosurgical technique enabling effective perfusion of large brain volumes using a catheter system. Such an ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Konvektions-verstärkte Abgabe bei kleinen Nagetieren mit einem Step-Katheter-System für die einstellbare gleichmäßige Perfusion von Zielhirnregionen durchzuführen. Der Vorteil der konvektionsverstärkten Abgabe ist, dass sie die Abgabe von Substanzen in den Bereich von Interesse ermöglicht, die die Blut-Hirn-Schranke mit wenig Gewebeschäden oder Reflux umgehen. Diese Technik ist in erster Linie nützlich für die Lieferung von therapeutischen Substanzen wie Antikörper in das Gehirn.Und kann daher verwendet werden, um viele neurologische Erkrankungen zu zielen. Demonstriert wird das Verfahren von Michal Beffinger, einem Post-Doc aus meinem Labor. Beginnen Sie mit dem Schneiden eines Stücks geschmolzener Kieselsäurekapillarrohre mit einem Innendurchmesser von 0,1 Millimetern und einer Wandstärke von 0,325 Millimetern auf eine Länge von 30 Millimetern.Nach der Untersuchung der Schläuche auf Risse verwenden Sie eine Mikroschmiede, um die Enden zu polieren, um sicherzustellen, dass die Rohröffnungen eine glatte Oberfläche haben. Als nächstes montieren Sie eine 27-Spur-Nadel auf eine 10-Mikro-Liter-Spritze und legen Sie die Spritze in einen stereot

delivery-antibodies-into-murine-brain-via-convection-enhanced

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Gründliche präklinische Testung von Medikamenten, die in das zentrale Nervensystem wirken oft mit der Beurteilung und den Vergleich von Medikament Bioverteilung in Verbindung mit bestimmten Arten der Verabreichung. Hier sind drei gängige Methoden der systemischen Verabreichung (intravenös, intraperitoneal, und mündlich) sowie eine Methode für die lokale Zustellung (Konvektion-Enhanced Delivery) bei Mäusen nachgewiesen.

Systemischen und lokalen Drug Delivery zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralen Nervensystems in Nagermodellen

Dieser Artikel zeigt zwei sehr unterschiedliche Methoden der Injektion: 1) in das Gehirn (intracerebroventrikuläre) und 2) systemischen (intravenösen), um die therapeutischen Wirkstoffe in das zentrale Nervensystem von neugeborenen Mäusen einzuführen.

Abgabe therapeutischer Wirkstoffe durch intracerebroventrikuläre (ICV) und intravenöse (IV) Injektion in Mäuse

Die Wirkstoffverkapselung erhöht die Spezifität der Tumorzellen und reduziert die Neurotoxizität.

Konvektionsverstärkte Abgabe von Polyethylenglykol-beschichteten geladenen Liposomen in einen Hirntumor bei Ratten

Quelle: Zamboni, M., et al., Induktion der Modifikation von leptomeningealen Zellen durch intrazisternale Injektion. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Verabreichung eines Induktor-Medikaments in die Cisterna magna einer anästhesierten Maus. Die Injektion induziert selektiv die Expression von Fluoreszenzmarkern in Oberflächenzellen des Gehirns, die über die Zerebrospinalflüssigkeit zugänglich sind, was durch Fluoreszenzbildgebung bestätigt wurde.

Gezielte Verabreichung von Medikamenten in einem Mausmodell über Cisterna Magna Injektion

Dieses Video zeigt eine konvektionsverstärkte Verabreichungstechnik (CED) für die Verabreichung von Antikörpern in das Gehirn von Mäusen. Der Schädel einer anästhesierten Maus wird freigelegt, und im Zielbereich wird ein Bohrloch für die Antikörperabgabe erzeugt. Ein Stufenkatheter mit Antikörpern wird an der Zielstelle eingeführt, und über eine Infusionspumpe wird ein Druckgradient erzeugt, um Antikörper mit einer kontrollierten Geschwindigkeit zu verabreichen.

Konvektionsverstärkte Verabreichung von Antikörpern in ein Mäusegehirn

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur ultraschallgestützten Antikörperverabreichung in einem Mausmodell. Retroorbital injizierte Mikrobläschen oszillieren unter Ultraschall und erzeugen eine vorübergehende Störung der Blut-Hirn-Schranke, wodurch markierte Antikörper in das Gehirn gelangen können.

Eine ultraschallgestützte Verabreichung von Antikörpern in einem Mausmodell

Quelle: Leda, A. R., et al. Mikrochirurgische Infusionstechnik der Maus zur gezielten Verabreichung von Substanzen in das ZNS über die Arteria carotis interna. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt ein mikrochirurgisches Verfahren, das die gezielte Infusion einer Testsubstanz in das Gehirn über die Arteria carotis interna (ICA) ermöglichen soll. Das Verfahren beinhaltet präzises Nähen und Gefäßmanipulationen, um den Blutfluss vorübergehend einzuschränken und eine kontrollierte Entbindung zu...

Gezielte Abgabe von Substanzen an das Gehirn der Maus über Infusion in die Arteria carotis interna

Ein Maus-Modell der menschlichen endoskopische Schädelbasis Wiederaufbau entwickelt worden, das eine halbdurchlässige Schnittstelle zwischen Gehirn und Nase mit Nasenschleimhauttransplantate schafft. Dieses Verfahren ermöglicht es den Forschern, die Lieferung an das zentrale Nervensystem von hohem Molekulargewicht Therapeutika, die sonst durch die Blut-Hirn-Schranke ausgeschlossen sind, wenn sie systemisch verabreicht zu studieren.

Heterotope Mucosal-Transplantationsverfahren für Direkt Drug Delivery zum Gehirn bei Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine mikrochirurgische Infusionstechnik für Mäuse, die effektiv Substanzen direkt über die Arteria carotis interna in das Gehirn abgibt.

Maus Mikroinfusionstechnik für Zielsubstanz Lieferung in das ZNS über Die Arteria carotis interna

Hier stellen wir ein Protokoll mit einem Maus-Positionierungsgerät vor, das die angemessene Platzierung von Mäusen für die intranasale Verabreichung einer hirngezielten Peptid-SiRNA-Formulierung ermöglicht, die eine effektive Gen-Silencing im zentralen Nervensystem ermöglicht.

Ein Positionierungsgerät für die Platzierung von Mäusen während der intranasalen siRNA-Lieferung an das Zentrale Nervensystem

Hier wird ein Protokoll zur vorübergehenden Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) entweder fokal oder in einem Mausgehirn vorgestellt, um fluoreszenzmarkierte Antikörper zu liefern und Mikroglia zu aktivieren. Ebenfalls vorgestellt wird eine Methode zum Nachweis der Abgabe von Antikörpern und der Aktivierung von Mikroglia durch die Histologie.

Abgabe von Antikörpern in das Gehirn mittels fokussiertem Scanning-Ultraschall

Erfahren Sie die konvektionsverstärkte Lieferung von Antikörpern ins murine Gehirn mittels Stufenkathetersystem. Diese Methode umgeht die Blut-Hirn-Schranke mit minimalem Gewebeschaden und ermöglicht präzise therapeutische Interventionen bei neurologischen Erkrankungen.

Lieferung von Antikörpern in das Murine Gehirn über Konvektionsverstärkte Lieferung

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