Name: Verbesserte Vernetzung der Immunoptierungsmethode (eCLIP) zur effizienten Identifizierung der proteingebundenen RNA in Mäusetestis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Erfahren Sie die verbesserte eCLIP-Methode zur Identifizierung RNA-bindender Proteine im Mäusetestis. Dieses nicht-radioaktive Verfahren ermöglicht effiziente Analysen der post-transkriptionellen Regulation während der Spermatogenese.

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Wir danken Eric L Van Nostrand und Gene W Yeo für die hilfreiche Anleitung mit dem Originalprotokoll. K.Z. wurde unterstützt von National Key R & D Program of China (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) und der National Natural Science Foundation of China (31771653). L.Y. wurde von der National Natural Science Foundation of China (81471502, 31871503) und dem Innovativen und unternehmerischen Programm der Provinz Jiangsu unterstützt.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mit zunehmendem Verständnis der universellen Rolle von RBPs unter biologischen und pathologischen Kontexten wurden die CLIP-Methoden weit verbreitet eingesetzt, um die molekulare Funktion der RBPs 20,32,33zu zeigen. 34,35. Das hier beschriebene Protokoll stellt eine angepasste Anwendung der eCLIP-Methode auf Mäusehausweise dar.
Ein...

Mammalian testis stellt ein hervorragendes Entwicklungsmodell dar, bei dem ein kompliziertes Zelldifferenzierungsprogramm zyklisch läuft, um zahlreiche Spermien zu erzeugen. Ein einzigartiger Wert dieses Modells liegt in der Entstehung der transkriptionalen Inaktivierung in bestimmten Stadien der Spermatogenese, typischerweise wenn die meiotische Geschlechtchromosome-Inaktivierung (MSCI) 1, 2 auftritt und wenn runde Spermien sich unterziehen. Drastische nukleare Verdichtungwährendder Spermiogenese 3. Diese inkonsekutiven transkriptionalen Ereignisse erfordern eine posttranskriptionale Genregulation, bei der RNA-bindende Proteine (RBPs) eine entscheidende Rolle spielen, die Transkriptome prägen und die männliche Fruchtbarkeit erhalten.
Um die echten RNA-Ziele eines einzelnen RBP in vivo zu identifizieren, wurde die vernetzte Immunop-(CLIP) Methode mit 4,5 entwickelt, basierendauf dem regulären RNA-Immunsystem (RIP)6,7 , durch die Einfügung von Schlüsselschritten, einschließlich der ultravioletten (UV) Vernetzung, strenger Wasch-und Gelübertragung, um die Signalspezifik zu verbessern. Die fortschrittliche Anwendung des CLIP in Kombination mit einer Hochdurchsatzsequenzierung hat großes Interesse an der Profi-Protein-RNA-Interaktion auf genomweiten Ebenen8geweckt. Zusätzlich zu genetischen Studien zur RBP-Funktion waren solche biochemischen Methoden, die das direkte Zusammenspiel von endogenem Protein und RNA identifizieren, unverzichtbar, um die RNA-regulatorische Rolle von RBPs genau zu erklären. MOV10L1 ist zum Beispiel eine weitenspezifische RNA-Helicase, die für die männliche Fruchtbarkeit und die Piwi-interagierende RNA (piRNA) Biogenese 9 benötigt wird. Sein paralogue MOV10 ist bekannt als allgegenwärtig ausgedrückte und multifunktionale RNA-HelicasemitRollen in verschiedenen Aspekten der RNA-Biologie 10,11, 12,13 ,14 , 15 , 16 , 17 , 18. Durch den Einsatz der herkömmlichen CLIP-seq, fanden wir, dass MOV10L1 bindet und reguliert primäre PiRNA-Vorläufer, um frühe piRNA-Verarbeitung19,20zu initiieren, und dass MOV10 mRNA 3 ' UTRs und sowie nicht-coding RNA Arten in Hodenkeimzellen (Daten nicht abgebildet).
Dennoch ist CLIP ursprünglich ein mühsames, radioaktives Verfahren, gefolgt von der Sequenzierung der Bibliotheksvorbereitung mit einem bemerkenswerten Verlust von CLIP-Tags. In der herkömmlichen CLIP wird eine cDNA-Bibliothek mit Adaptern vorbereitet, die an beiden RNA-Extremitäten ligiert sind. Nach der Proteinverdauung bleiben vernetzte kurze Polypeptide an RNA-Fragmenten befestigt. Diese Vernetzungsmarke blockiert die Reverse Transkriptase (RTase) während der cDNA-Synthese teilweise, was zu verkürzten cDNAs führt, die etwa 80%der cDNA-Bibliothek21,22ausmachen. So werden nur cDNA-Fragmente sequenziert, die aus RTase resultieren, die die Vernetzungsstelle umgehen (Durchlesen). In jüngster Zeit wurden verschiedene CLIP-Ansätze wie PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP und uvCLAP eingesetzt, um Querlink-Standorte von RBPs in lebenden Zellen zu identifizieren. PAR-CLIP beinhaltet die Anwendung von 365 nm UV-Strahlung und photoaktivierbaren Nukleotid-Analogen und ist daher ausschließlich für die In-kulturierende lebende Zellen, und die Einbindung von Nukleosid-Analogen in neu synthetisierte Transkripte ist anfällig für die Produktion von Bias Dort, wo die RNA physischmit dem Protein 23,24interagiert. In iCLIP wird nur ein einziger Adapter an die 3 ' Extremität der vernetzten RNA-Fragmente gekoppelt. Nach der umgekehrten Transkription (RT) werden sowohl verkürzte als auch durchlässige cDNAs durch intramolekulare Zirkularisierung und Re-Linearisierung erreicht, gefolgt von einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die 25,26verstärkt. Die Effizienz der intramolekularen Kreislaufisierung ist jedoch relativ gering. Obwohl ältere CLIP-Protokolle eine Kennzeichnung der vernetzten RNA mit einem Radioisotop benötigen, setzt die ultraviolette Vernetzung und Affinitätsreinigung (uvCLAP) bei einem Prozess der strengen Tandemaffinitätsreinigung nicht auf Radioaktivität 27. Dennoch beschränkt sich uvCLAP auf kultivierte Zellen, die mit dem Expressionsvektor, der das 3x FLAG-HBH-Tag zur Tandemaffinitätsreinigung trägt, transferiert werden müssen.
In eCLIP wurden Adapter zuerst an der 3 ' Extremität der RNA, gefolgt von RT, und als nächstes an der 3 ' Extremität von cDNAs in einem intermolekularen Modus. Damit ist eCLIP in der Lage, alle abgeschnittenen und durchlasen cDNA28zu erfassen. Außerdem beschränkt sie sich weder auf die radioaktive Kennzeichnung, noch auf die Verwendung von Zelllinien nach ihrem Prinzip, während die Auflösung von Nukleotiden beibehalten wird.
Hier finden Sie eine schrittweise Beschreibung eines eCLIP-Protokolls, das für den Mäusehausamser angepasst ist. Kurz gesagt, dieses eCLIP-Protokoll beginnt mit der UV-Vernetzung von Hodenröhrungen, gefolgt von einer teilweisen RNase-Verdauung und Immuntherapie mit einem proteinspezifischen Antikörper. Als nächstes wird die proteingebundene RNA dephosphoryliert, und der Adapter wird bis zu seinem 3 ' Ende ligiert. Nach der Protein-Gel-Elektrophorese und der Gel-zu-Membran-Übertragung wird die RNA durch das Schneiden der Membranfläche eines erwarteten Größenbereiches isoliert. Nach RT wird der DNA-Adapter an das 3 ' Ende der cDNA ligiert, gefolgt von PCR-Verstärkung. Das Screening von Subklonen vor der Hochdurchsatz-Sequenzierung wird als Qualitätskontrolle der Bibliothek genommen. Dieses Protokoll ist effizient bei der Identifizierung der wichtigsten Arten von proteingebundenen RNA von RBPs, beispielhaft für die beiden Protden-Ausdruck RNA-Helikasen MOV10L1 und MOV10.

<table><tbody><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus MOV10&nbsp; Antikörper</td><td>Proteintech, China</td><td>10370-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus MOV10L1 Antikörper</td><td>Zheng et al.20109</td><td>polyklonale Antiseren UP2175</td><td>zur Verfügung gestellt von P. Jeremy Wang Lab, University of Pennsylvania</td></tr><tr><td>HRP Goat Anti-Rabbit IgG&nbsp;</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen IgG</td><td>Beyotime, China</td><td>A7016</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>Digitaler Sonifikator</td><td>BRANSON, USA</td><td>BBV12081048A</td><td>450 Watt; 50/60 Hz</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen, USA</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Mini Blot Modul</td><td>Invitrogen, USA</td><td>B1000</td><td></td></tr><tr><td>Mini Gel Tank</td><td>Invitrogen, USA</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Schüttel-Inkubator</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td>Thermomixer comfort&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Grinder, Dounce</td><td>PYREX,</td> USA <td>1234F35</td><td>only&nbsp; der "lose" Stößel wird in diesem Protokoll verwendet</td></tr><tr><td>TProfessional standard 96 Gradient</td><td>Biometra, Germany</td><td>Serien-Nr.: 2604323</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver&nbsp;</td><td>Kristall, USA</td><td>Serien-Nr.: 3406051</td><td></td></tr><tr><td>UV-Licht-Vernetzer</td><td>UVP, USA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-treated Culture Dish</td><td>Corning, USA</td><td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Röhrchen</td><td>Corning, USA</td><td>430791</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Mikroröhrchen Röhrchen</td><td>AXYGEN , USA</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><starke>Reagenzien&nbsp; </stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>saurer Phenol-/Chloroform-/Isoamylalkohol&nbsp;</td><td>Solarbio, China</td><td>P1011</td><td>25:24:01</td></tr><tr><td>AffinityScript Enzym</td><td>Agilent, USA</td><td>600107</td><td></td></tr><tr><td>Antioxidans</td><td>Invitrogen, USA</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha kompetente Bakterien</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>18265017</td><td>diese wirtschaftlichen Zellen liefern >1 x 106 Transformanten/&micro; g Kontroll-DNA pro 50 & Mikro; L-Reaktion.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Leiter</td><td>Invitrogen, USA</td><td>10416014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>ECL-Reagenz</td><td>Vazyme, China</td><td>E411-04</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EDTA Invitrogen, USA</td><td>AM9260G EDTA-freier</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Roche, USA</td><td>04693132001</td><td>frische</td></tr><tr><td>Exo-SAP-IT</td><td>Affymetrix, USA</td><td>78201</td><td>PCR-Produktreinigungsreagenz hinzufügen&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP Enzym</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>EF0652</td><td></td></tr><tr><td>LDS Probenpuffer</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose&nbsp;</td><td>lonza, Schweiz</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>MiniElute gel Extraktion</td><td>QIAGEN, Deutschland</td><td>28604</td><td>Säule bei 4 μ lagern; Puffer QG=gel auflösender Puffer; Puffer PE= Waschpuffer (für Schritt 14)</td></tr><tr><td>MyONE Silankügelchen</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>37002D</td><td>Nukleinsäuren Extraktion magnetische Beads</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, USA</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Protein Gele</td><td>Invitrogen, USA</td><td>NP0336BOX 4%</td><td>&ndash; 12%, 1,5 mm, 15-Well-NuPAGE</td></tr><tr><td>MOPS SDS Puffer-Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>NP0050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phase-Locked-Gel (PLG) schwere Tube&nbsp; &nbsp;</td><td>TIANGEN, China</td><td>WM5-2302831</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Angewandte Biosysteme, USA</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB, Neuengland &</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 PCR-Mastermix&nbsp;</td><td>NEB, Neuengland&nbsp;</td><td>M0492L</td><td></td></tr><tr><td>RLT-Puffer</td><td>QIAGEN, Deutschland</td><td>79216</td><td>Lysepuffer für die RNA-Aufreinigung&nbsp;</td></tr><tr><td>RNA reinigen & Konzentrator-5 Säulen&nbsp;</td><td>ZYMO RESEARCH, USA</td><td>R1016</td><td>RNA-Aufreinigungs- und Konzentrationssäulen</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Promega, USA</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNase</td><td>Promega, USA</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Probenreduktionsmittel</td><td>Invitrogen, USA</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>SDS Lösung</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15553027</td><td>10%</td></tr> <tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>30970</td><td>schützen vor leichtes</td></tr><tr><td>T4 PNK-Enzym</td><td>NEB, Neuengland</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4-RNA-Ligase 1 mit hohem Konz. NEB</td><td>, Neuengland</td><td>M0437M</td><td></td></tr><tr><td>TA/Blunt-Zero Cloning Mix</td><td>Vazyme, China</td><td>C601-01</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI Buffer</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A600198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Röntgenfilme</td><td>Caresteam, Kanada</td><td>6535876</td><td></td></tr></tbody></table>

verbesserte vernetzung der immunoptierungsmethode (eclip) zur effizienten identifizierung der proteingebundenen rna in mäusetestis

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

Die Spermatogenese definiert einen sehr geordneten Prozess der männlichen Keimzelldifferenzierung bei Säugetieren. In den meisten Hoden werden Transkriptionen und Übersetzungen entkoppelt, was die Bedeutung der nachträglichen Regulierung der von RBPs orchestrierten Genexpression unterstreicht. Um die mechanistische Rolle eines RBP zu erklären, kann die Vernetzung der Immunop-(CLIP)-Methodik verwendet werden, um die endogenen direkten RNA-Ziele zu erfassen und die tatsächlichen Interaktionsorte zu definieren. Das erweiterte CLIP (eCLIP) ist ein neu entwickeltes Verfahren, das gegenüber den herkömmlichen CLIPs mehrere Vorteile bietet. Allerdings ist die Nutzung von eCLIP bisher auf Zelllinien beschränkt, was erweiterte Anwendungen fordert. Hier haben wir eCLIP eingesetzt, um MOV10 und MOV10L1, zwei bekannte RNA-bindende Helicases, in Mäusehden zu studieren. Wie zu erwarten, stellen wir fest, dass MOV10 überwiegend an 3 ' nicht übersetzte Regionen (UTRs) von mRNA und MOV10L1 selektiv an Piwi-interagierende RNA (piRNA) Vorläuferprotokolle bindet. Unsere eCLIP-Methode ermöglicht die schnelle Bestimmung von großen RNA-Arten, die durch verschiedene RBPs durch kleine Sequenzierung von Subklonen und damit die Verfügbarkeit von qualifizierten Bibliotheken gebunden sind, als Garantie für die Durchführung einer tiefen Sequenzierung. Diese Studie schafft eine anwendbare Grundlage für eCLIP in Säugetierhauszeugen.

Das eCLIP-Verfahren und die Ergebnisse sind in Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung3, Abbildung4 dargestellt. Die Mäuse wurden mit Kohlendioxid euthaniert und im Unterbauch wurde mit einer chirurgischen Schere (Abbildung 2A,B...

Hier stellen wir ein eCLIP-Protokoll vor, um die wichtigsten RNA-Ziele von RBP-Kandidaten in Hoden zu ermitteln.

Verbesserte Vernetzung der Immunoptierungsmethode (eCLIP) zur effizienten Identifizierung der proteingebundenen RNA in Mäusetestis

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

RNA-bindende Proteine sind für die zelluläre Physiologie unerlässlich. Wichtig ist, dass die RBP in der Spermatogenese stark exprimiert sind und in allen Stadien der Keimzellen als wesentliche posttranskriptionelle Regulatoren gut dokumentiert wurden. Die Identifizierung verbindlicher Ziele ist entscheidend, um die mechanistische Rolle von RBP aufzuklären.Dieses Protokoll stellt eine angepasste Anwendung der eCLIP-Methode zur Erfassung endogenes direkter RNA-Ziele dar und schafft eine anwendbare Grundlage für eCLIP in Säugetier-Hoden. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie nicht radioaktiv, weniger zeitintensiv und ein stärkeres Signal-Rausch-Verhältnis bietet, da der größengerechte Eingang als geeigneter Hintergrund für authentische Ziele dient. Schließlich sind wir der Meinung, dass die kleine Sequenzierung von Subklonen nützlich ist, um einer tiefen Sequenzierung zu folgen.Der Beweis für das Verfahren wird Xu Qiushi sein, mein Kollege. Um dieses Verfahren zu beginnen, ernten Sie etwa 100 Milligramm Hoden von Mäusen des entsprechenden Alters für jedes Immunpräzipitationsexperiment. Legen Sie das Gewebe in eiskalteS PBS.Entfernen Sie mit einer feingekippten Pinzette vorsichtig die Tunika albuginea. Fügen Sie drei Milliliter eiskaltes PBS zu einem Gewebeschleifer hinzu und verwenden Sie einen lockeren Glasschädling, um das Gewebe durch milde mechanische Kraft zu trituratieren. Als nächstes übertragen Sie die Gewebesuspension auf eine Zellkulturschale und fügen Sie eiskalte PBS bis zu sechs Milliliter hinzu.Schütteln Sie die Platte schnell, so dass Flüssigkeit den Boden der Schale gleichmäßig bedeckt. Vernetzen Sie die Suspension auf Eis dreimal mit 400 Millijoule pro Zentimeter quadratisch bei 254 Nanometern. Achten Sie darauf, die Suspension zwischen jeder Bestrahlung zu mischen.Dann sammeln Sie die Suspension in einem 15-Milliliter konischen Rohr, und Zentrifuge bei 1, 200 mal g und bei vier Grad für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS wieder auf. Danach die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen.Zentrifugieren Sie bei 1 000 mal g und bei vier Grad Celsius für zwei Minuten, und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie zunächst 125 Mikroliter Protein A magnetische Perlen pro Probe zu einem frischen Zentrifugenrohr hinzu. Legen Sie das Rohr auf den Magneten, um die Perlen von der Lösung zu trennen.Nach 10 Sekunden den Überstand entfernen und die Perlen zweimal mit einem Milliliter eiskalten Lysepuffer waschen. Setzen Sie die Perlen in 100 Mikroliter kalter Lysepuffer mit 10 Mikrogramm eCLIP-Antikörper aus. Drehen Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 45 Minuten.Dann die Perlen zweimal mit einem Milliliter eiskalten Lysepuffer waschen. Zunächst sollten die Gewebepellets in einem Milliliter Kaltlysepuffer mit 22 Mikrolitern 50x EDTA-freier Proteininhibitor-Cocktail und 11 Mikroliter RNase-Inhibitor wieder ausgesetzt werden. Halten Sie die Proben auf Eis für 15 Minuten lysing.Sonicatieren Sie jedes Beispiel wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes fügen Sie vier Mikroliter DNase zu jedem Rohr hinzu und mischen Sie sie gut. Bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren, während sie bei 1 200 Rpm schütteln.Danach 10 Mikroliter verdünnte RNase hinzufügen und gut mischen. Bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren, während sie bei 1 200 Rpm schütteln. Dann Zentrifuge bei 15.000 mal g und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten, um das Lysat zu löschen.Sammeln Sie den Überstand sorgfältig und speichern Sie Eingabebeispiele für RWB- und RRI-Proben. Zuerst einen Milliliter des Lysats zu den vorbereiteten Perlen hinzufügen und die Proben bei vier Grad Celsius entweder zwei Stunden oder über Nacht drehen. Danach sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer und entsorgen Sie den Überstand.Waschen Sie die Perlen zweimal mit 900 Mikroliter Hochsalzpuffer, und waschen Sie die Perlen dann zweimal mit 900 Mikroliter Waschpuffer. Dann waschen Sie die Perlen einmal mit 500 Mikroliter 1x Dephosphorylierungpuffer. Entsorgen Sie zunächst den Überstand, und verwenden Sie feine Pipettenspitzen, um Restflüssigkeit zu entfernen.Fügen Sie 25 Mikroliter Drei-Prime-Ligation Master-Mix zu jeder Probe, und sorgfältig Pipette zu mischen. Fügen Sie 2,5 Mikroliter RNA-Adapter X1A und 2,5 Mikroliter RNA-Adapter X1B zu jeder Probe hinzu. Mischen Sie sorgfältig durch Pipettieren oder Flicken.Inkubieren Sie bei 25 Grad Celsius für 75 Minuten, stellen Sie sicher, dass die Röhre alle 10 Minuten zu mischen. Waschen Sie die Perlen einmal mit 500 Mikroliter kaltwaschen den Puffer. Als nächstes die Perlen einmal mit 500 Mikroliter kaltem Hochsalzpuffer und dann mit 500 Mikroliter kalter Waschpuffer waschen.Wiederholen Sie diese beiden Wassnochsungen. Magnetisch trennen Sie die Perlen, und verwenden Sie feine Pipettenspitzen, um Restflüssigkeit zu entfernen. Setzen Sie die Perlen in 100 Mikroliter Kaltwaschpuffer aus und bewegen Sie 20 Mikroliter als RWB-Proben in neue Röhren.Fügen Sie 7,5 Mikroliter 4x LDS-Probenpuffer und drei Mikroliter 10x Probenreduktionsmittel zu den verbleibenden Proben hinzu. Bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren, während sie bei 1 200 Rpm schütteln. Danach die Proben auf Eis für eine Minute abkühlen und bei 1 000 mal g und bei vier Grad Celsius für eine Minute zentrieren.Legen Sie bei RWB-Gel Die Röhrchen auf einen Magneten und trennen Sie Protein eluate von den Perlen. 15 Mikroliter Probe in jeden Brunnen laden. Als nächstes fügen Sie 500 Mikroliter Antioxidans zu 500 Millilitern des 1x SDS-Laufpuffers hinzu.Führen Sie das Gel bei 200 Volt, 1x SDS-Laufpuffer für 50 Minuten oder bis die Farbstofffront an der Unterseite ist. Übertragen Sie die Protein-RNA-Komplexe vom Gel auf eine Nitrocellulosemembran bei 10 Volt für 70 Minuten im 1x Transferpuffer mit 10% Methanol. Blockieren Sie die RWB-Membran in 5%Milch in TBST bei Raumtemperatur für eine Stunde.Spülen Sie die Membran in TBST und inkubieren Sie mit Primärantikörpern in TBST über Nacht bei vier Grad Celsius. Danach zweimal mit TBST waschen, wobei jede Wäsche fünf Minuten dauert. Mit Sekundärantikörper in TBST bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubieren.Dann waschen Sie die Membran dreimal mit TBST. Als Nächstes mischen Sie gleiche Volumina von ECL-Puffer A und Puffer B.Add diese Mischung auf die Membran, und inkubieren für eine Minute. Bedecken Sie die Membran mit Plastikfolie und setzen Sie sie zwei bis drei Minuten lang einem Röntgenfilm bei Raumtemperatur aus.In dieser Studie wird MOV10 eCLIP bei Hoden von erwachsenen Wildtypmäusen mit RNase I, die das vernetzte Lysat behandeln, das Zielprotein, das etwa 114 Kilodalton beträgt, erfolgreich angereichert. Die qPCR-Ergebnisse von cDNA verdünnt ein bis zehn aus verschiedenen Proben zeigt, dass nicht vernetzte Proben zeigen verringerte RNA-Recovery. Es wird beobachtet, dass die Ct-Werte der nicht vernetzten Gruppe im Allgemeinen fünfmal so hoch sind wie die UV-vernetzungen Gruppe.Repräsentative Ergebnisse zur PCR-Verstärkung und Größenauswahl mittels Agarose-Gel-Elektrophorese sind hier dargestellt. Das Primer-Dimer-Produkt erscheint bei etwa 140 Basenpaaren. Die UCSC Genome Browser-Ansicht von zwei repräsentativen Subklonsequenzen zeigt, dass sich MOV10-gebundene eCLIP-Tags innerhalb der Drei-Prime-UTR des Gens Fto befinden.Die ungefähre Rate der DREI-Prime-UTR-Ziele macht 75% aus und entspricht der Mehrheit der MOV10-Ziele in HEK293-Zellen und in Hoden. Im Gegensatz dazu befinden sich MOV10L1-gebundene eCLIP-Tags innerhalb eines piRNA-Clusters, was auf die Ziele von MOV10L1-Targets piRNA-Vorstufen hinweist. Die ungefähre Rate der piRNA-Vorläuferziele macht 42% aus, was einen Trend aus früheren Studien widerspiegelt.MOV10L1 eCLIP mit einer 40-Einheiten-pro-Milliliter RNase I Verdauung ergibt relativ mehr Sequenzen mit weniger als 20 Basenpaaren. Dieses hier beschriebene Protokoll stellt eine Verwendung der eCLIP-Methode in der Reproduktion dar, ein Bereich, in dem das RNA-RBP-Interaktionswissen eher unzureichend ist.

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Biology

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Die räumliche Anordnung der RNA-bindenden Proteinen auf eine Abschrift ist eine wichtige Determinante der post-transkriptionellen Regulation. Deshalb entwickelten wir individuelle-Nukleotid-Auflösung UV-Vernetzung und Immunpräzipitation (iClip), die eine präzise genomweite Kartierung der Bindungsstellen eines RNA-bindenden Proteins erlaubt.

iClip - Transkriptom-weiten Mapping von Protein-RNA Wechselwirkungen mit Individual Nucleotide Resolution

Eine Schritt für Schritt-Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von RNA assoziiert Komplexe durch RIP-Chip.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

Dieses Video zeigt die eCLIP-Methode (Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation) zur Identifizierung von RNA-bindenden Proteinen in Maushoden. eCLIP ermöglicht die präzise Identifizierung von Bindungsstellen, an denen RNA-bindende Proteine (RBPs) mit ihren Ziel-RNAs interagieren.

Eine verbesserte Crosslinking-Immunpräzipitationsmethode zur effizienten Identifizierung von proteingebundener RNA in Maushoden

Dieses Manuskript beschreibt einen Ansatz zur Isolierung ausgewählter verwandter RNPs, die in eukaryotischen Zellen gebildet werden, durch eine spezifische Oligonukleotid-gerichtete Anreicherung. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Ansatzes, indem wir ein verwandtes RNP isolieren, das an die retrovirale 5'-untranslatierte Region gebunden ist, die aus DHX9/RNA-Helikase A besteht.

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Wir beschreiben ein Protokoll zur RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen in lebenden Zellen mit UV-vermittelten Photocrosslinking und Massenspektrometrie.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Ein Tandem RNA Isolierung (Reise) für die Verwertung von endogen gebildeten mRNA-Protein-komplexe Vorgehensweise wird. Speziell, RNA-Protein-komplexe sind vernetzt in VivoPolyadenylated RNAs sind isoliert aus Extrakten mit oligo(dT) Perlen und besonderen mRNAs werden mit modifizierten RNA antisense Oligonukleotide erfasst. Proteine gebunden, mRNAs werden vom Immunoblot Analyse erkannt.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung endogener RNA-Bindungsstellen oder "Footprints" von RNA:Protein(RNP)-Komplexen aus Säugetierzellen vor. Dieser Ansatz umfasst zwei Immunpräzipitationen von RNP-Untereinheiten und wird daher als RNA-Immunpräzipitation im Tandem (RIPiT) bezeichnet.

Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

Hier stellen wir ein modifiziertes CLIP-seq-Protokoll namens FbioCLIP-seq mit FLAG-Biotin-Tandemreinigung vor, um die RNA-Ziele von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) in Säugetierzellen zu bestimmen.

Transkriptom-weite Profilierung von Protein-RNA-Wechselwirkungen durch Vernetzung und Immunpräzipitation durch FLAG-Biotin-Tandemreinigung

Hier beschreiben wir die Immunpräzipitation von Ribosomen und zugehöriger RNA aus ausgewählten Populationen erwachsener männlicher Mauskeimzellen mit dem RiboTag-System. Strategische Züchtung und sorgfältige Immunpräzipitation führen zu sauberen, reproduzierbaren Ergebnissen, die über das Keimzelltranslatom informieren und Einblicke in die Mechanismen mutierter Phänotypen geben.

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

In dieser Arbeit stellen wir eine optimierte in vitro Methode vor, um Proteininteraktoren spezifischer RNA-Sequenzen aufzudecken, zu quantifizieren und zu validieren, wobei Gesamtproteinextrakt aus menschlichen Zellen, Streptavidin-Kügelchen, die mit biotinylierter RNA beschichtet sind, und Massenspektrometrie-Analysen verwendet werden.

Eine optimierte quantitative Pull-Down-Analyse von RNA-bindenden Proteinen unter Verwendung kurzer biotinylierter RNA

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur Identifizierung direkter lncRNA-Protein-Interaktionen.

Eine UV-basierte ChIRP-Methode zur verifizierbaren Identifikation von Proteinen, die direkt mit LncRNA interagieren: Von kultivierten Zellen bis zum Maus-Hoden

Erfahren Sie die verbesserte eCLIP-Methode zur Identifizierung RNA-bindender Proteine im Mäusetestis. Dieses nicht-radioaktive Verfahren ermöglicht effiziente Analysen der post-transkriptionellen Regulation während der Spermatogenese.

Verbesserte Vernetzung der Immunoptierungsmethode (eCLIP) zur effizienten Identifizierung der proteingebundenen RNA in Mäusetestis (Video) | JoVE Journal

Verbesserte Vernetzung der Immunoptierungsmethode (eCLIP) zur effizienten Identifizierung der proteingebundenen RNA in Mäusetestis

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