Name: Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Lernen Sie die Präparation von Maus-Retina-Cryo-Schnitten für die Immunhistochemie. Diese Methode umfasst okuläre Dissektion, Fixierung in Paraformaldehyd und Kryo-Schneiden für hochwertige immunhistochemische Analysen retinaler Zellstrukturen.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel des NIH (RO1-GMO97327) und der University Research Foundation (UPenn) unterstützt. Wir danken insbesondere Svetlana Savina für ihre Hilfe bei der Entwicklung des Immunhistochemie-Protokolls, Gordon Ruthel (University of Pennsylvania) und dem Penn Vet Imaging Core für die Unterstützung bei der Mikroskopie und Leslie King, Ph.D. für die kritische Lektüre dieses Manuskripts. .

Alle hier beschriebenen Methoden wurden in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt, der vom Institut für Labortierressourcen zur Verfügung gestellt wurde, und wurden von der Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pennsylvania.
Alle Werkzeuge und Geräte für die Methoden sind in Abbildung 1 dargestellt und in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
1 . Mausaugenenukleation, Augenbechersezieren und Einbetten
<ol><li>Euthanisieren Sie Mäuse mitKohlendioxid (CO2 ), gefolgt von enthaupteten (postnatale Mäuse P0 - P11) oder zervikale Dislokation (Erwachsene >P11 Mäuse). Bei P0-P14-Mäusen sind die Augen von Haut bedeckt. Stellen Sie sicher, dass die Haut vor den nachfolgenden Schritten entfernt wird.</li>
	<li>Markieren Sie den zeitlichen Teil des Auges (Abbildung 2A), indem Sie die Hornhaut leicht mit einem Schwanzkauterisierer verbrennen. Vermeiden Sie es, ein Loch in der Hornhaut zu verbrennen, indem Sie die Hornhaut sehr leicht und für nicht mehr als eine Sekunde mit dem Kauterizer berühren.</li>
	<li>Entführen Sie sofort Mausaugen mit gebogenen Dumont #5/45 Zangen. 15 min in einem 1,5 ml Kryoröhrenrohr mit 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Salin (PBS) auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Nach 15 min in 4% PFA das fixierte Auge mit den gekrümmten Zangen Dumont #5/45 auf eine modifizierte 35 mm Sezierschale (siehe Materialtabelle und Abbildung 1C) mit PBS gefüllt und unter sezierendes Mikroskop platzieren.</li>
	<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Brennzeichen, senkrecht zu und knapp über dem Limbus (Grenze der Hornhaut) mit dem Mikromesser.</li>
	<li>Setzen Sie die gekrümmte Schere in den Schnitt ein und führen Sie einen Umfangsschnitt der Hornhaut nach dem Limbus durch (Abbildung 2B).</li>
	<li>Entfernen Sie die Hornhaut und extrahieren Sie die Linse mit einem dünnen Dumont #5 Zange , (Abbildung 2B) und heben Sie es zart weg von der hinteren Teil des Auges. Der Glaskörper, das klare Gel, das den Raum zwischen der Linse und der Netzhaut füllt, wird mit der Linse herauskommen (Abbildung 2B) und die Netzhaut wird als weiße Oberfläche sichtbar sein, die die Innenseite der hinteren Augentasse bedeckt. Stellen Sie sicher, dass keine sichtbaren Schäden an der Netzhaut, wie Löcher oder Risse (Abbildung 2C) vorhanden sind.</li>
	<li>Waschen Sie die Augenbecher zweimal in 1 ml PBS für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Kryoschützen Sie die Augenbecher, indem Sie sie in einer Lösung von 15% Saccharose in PBS über Nacht bei 4 °C ausgrenzen, bis die Augentasse sinkt</li>
	<li>Übertragen Sie die Augenbecher auf 30% Saccharose in PBS für 2-3 h, bis die Augentasse sinkt.</li>
	<li>Die Augenmuscheln in OCT in 10 x 10 mm Kryomolden einbetten (Abbildung 3A). Mit einem Sezieren Mikroskop, orientieren Sie das Auge in der Kryomold entlang seiner dorsal-ventralen Achse (Abbildung 2D, Abbildung 3A) durch Drehen des Auges, bis die Brandmarke auf der Oberseite ist, der Sehnerv ist auf der linken Seite und der ausgeschnittene Teil der Form zeigt sich nach rechts ( Abbildung 2D). Achten Sie darauf, Blasen in der Nähe des Gewebes zu vermeiden. HINWEIS: Um den Augenbecher zu manipulieren, verwenden Sie eine Titansonde aus einem Titandraht, der an einer Pipettenspitze befestigt ist.</li>
	<li>Um Netzhautgewebe zu einfrieren, tauchen Sie den Kryomold mindestens 5 min in ein Metallbecher mit Isopentan ein und legen Sie das Becherglas in flüssigen Stickstoff oder Trockeneis/100% Ethanolbad (bis zu 1/3 der Höhe des Metallbechers). HINWEIS: Der Kryomold sollte in Isopentan emittan e,Isopentane bis zur Hälfte seiner Höhe eingetaucht werden, muss aber nicht vollständig untergetaucht werden.</li>
	<li>Entfernen Sie den gefrorenen Block und wickeln Sie ihn in Aluminiumfolie.</li>
	<li>Bei -80 °C lagern.</li>
	<li>Markieren Sie den eingefrorenen Block mit einem Stift oder Sharpie, um die Ausrichtung des Blocks aufzuzeichnen (Abbildung 3B).</li>
</ol>2 . Schnitt mit einem Kryostat
<ol><li>Nach der Einstellung der Kryostattemperatur (zwischen -20 und -25 °C) lassen Sie die Formen, die die eingebetteten Augenbecher enthalten, 1 h auf die Kryostattemperatur ausgrenzen.</li>
	<li>Installieren Sie den Block mit dorso-ventraler Ausrichtung (Abbildung 3C) und schneiden Sie 10 m dicke serielle Abschnitte. Platzieren Sie die Netzhautabschnitte vorsichtig auf kommentierten und nummerierten Mikroskopdias.</li>
	<li>Lagern Sie Dias in Diaboxen bei -20 °C oder -80 °C, bis IHC-Verfahren durchgeführt werden.</li>
</ol>3 . Fluoreszenz-Immunostainierung mit dem Slide Rack
HINWEIS: Das Slide Rack-System (z. B. Sequenza) hält die Glasmikroskop-Dias mit einer Abdeckplatte, wodurch ein Kapillarspalt von 100 L zwischen dem Schlitten und der Platte entsteht.
<ol><li>Die Kryo-Sektionen bei Raumtemperatur (RT) für 2 h bis 4 h auftauen, damit sie trocknen und an Mikroskopschlitten befestigen können. HINWEIS: Es ist auch möglich, sie bei 30-37 °C für 30 min bis 1 h zu trocknen.</li>
	<li>Legen Sie Dias in Slide Rack und waschen Sie die Netzhautabschnitte zweimal in 100-200 L PBS für 2 min.</li>
	<li>Permeabilisieren Sie die Netzhautabschnitte, indem Sie sie in 0,25% Triton-X / 0,05% NaN3in PBS für 5 min bei RT inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie den Folien eine Blockierlösung mit 100 L hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie den Dias 100 L primärer Antikörper hinzu, der in einer Blockierenden Lösung verdünnt wird.</li>
	<li>Retinalabschnitte über Nacht bei 4 °C inkubieren. HINWEIS: Während dieser Zeit decken Sie das Slide Rack ab, um eine Austrocknung der Abschnitte zu vermeiden.</li>
	<li>Waschen Sie die Netzhautabschnitte 3 Mal, jeweils für 15 min, mit 200 L PBS. HINWEIS: Die Zugabe von 0,001- 0,002% Triton-X100 zu PBS (PBS-T) ermöglicht eine strengere Wäsche, kann aber einige Membranen und zelluläre Strukturen stören.</li>
	<li>Inkubieren Sie Netzhautabschnitte in fluoreszierend-markierten sekundären Antikörpern für 1 h bei RT. Von nun an vor Licht schützen.</li>
	<li>Waschen Sie die Netzhautabschnitte 3 mal, jeweils für 15 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Netzhautabschnitte bei RT für 5 min mit einem Kernmarker wie Hoechst 33342 oder DAPI-Lösung.</li>
	<li>Waschen Sie die Netzhautabschnitte 1 Mal für 15 min.</li>
	<li>Legen Sie einen Deckelaufschlag auf ein Papiertuch auf die Laborbank.</li>
	<li>Fügen Sie 2 Tropfen anti-fading Montagemedien in die Mitte des Coverslip.</li>
	<li>Drehen Sie die Rutsche um, um den Retina-Kryo-Abschnitt nach unten zu haben.</li>
	<li>Montieren Sie den Deckelrutsch vorsichtig langsam, in einem Winkel von 45°, kippen Sie den Schlitten auf das Montagemedium. HINWEIS: Vermeiden Sie das Bilden von Blasen, wenn Sie die Folie an Ort und Stelle senken.</li>
	<li>Tragen Sie mit einem schweren Buch oder Katalog (siehe unten) gleichmäßigen Druck auf die Slide-Coverslip-Kombination, um überschüssige Montagemedien zu vermeiden. HINWEIS: Um die Konsistenz bei der Probenvorbereitung zu gewährleisten, verwenden Sie immer dasselbe Objekt (d. h. dasselbe Buch oder denselben Katalog), um während der Schiebemontage gleichmäßigen Druck auf den Deckelzuschlag auszuüben.</li>
	<li>Flach halten und bei RT im Dunkeln über Nacht aushärten lassen. Dias bei 4 °C auf unbestimmte Zeit flach lagern.</li>
	<li>Bild über Weitfeld- oder konfokale Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 4).</li>
</ol>

<ol><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labelled+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Labelled antigens and antibodies.</a> Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).</li>
<li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+antigen+in+tissue+cells%3B+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).</li>
<li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Artefacts in histopathology.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li>
<li>Hartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+sections+from+Bouin-fixed+material+in+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology.</a> Stain Technology. 20, 113(1945).</li>
<li>Benerini Gatta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+alternative+fixatives+to+formalin+in+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology.</a> European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+cryoultramicrotomy+to+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry.</a> Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).</li>
<li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+properties+of+rhodopsin+and+rod+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular properties of rhodopsin and rod function.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).</li>
<li>Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reexamination+of+Dopaminergic+Amacrine+Cells+in+the+Rabbit+Retina%3A+Confocal+Analysis+with+Double-+and+Triple-labeling+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry.</a> Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).</li>
<li>Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+Glutamate+Uptake+and+Metabolism+in+Retinal+Glial+%28Muller%29+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).</li>
<li>Nakhai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+essential+for+the+differentiation+of+GABAergic+and+glycinergic+amacrine+cells+and+horizontal+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina.</a> Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li>
</ol>

Keine Angaben.

Maus Netzhaut-Sektion ist ein empfindlicher Prozess aufgrund der geringen Größe und Form der Mausaugen und die Fragilität der Netzhautgewebe. Auch wenn die Durchführung von qualitativ hochwertigen Sezierungen eine Frage der Praxis ist, ist es eine Notwendigkeit, mit einem detaillierten Protokoll effiziente Methoden und Tipps zu erhalten, um Netzhautabschnitte und IHC zu erhalten. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Protokollen gibt es einige Tipps, die konsistente hochwertige Netzhautabschnitte ermöglichen, die für repr...

Immunohistochemistry (IHC) ist eine leistungsfähige Technik zur Lokalisierung spezifischer Proteine und zellulärer Strukturen in Geweben in situ1,2,3. Ungeeignete Fixierungsmethoden und suboptimale Schnitte komplexer Gewebe können die Gewebestruktur stören, eine hohe Hintergrundfärbung erzeugen oder Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen verringern, was zu Färbeartefakten und daraus resultierender Fehlinterpretation von IHC-Daten4. Da die Netzhaut des Wirbeltiers ein komplexes und hochorganisiertes neuronales Organ ist, das aus Schichten miteinander verbundener Photorezeptoren, Interneuroner und Ganglienzellen besteht, ist es sehr zerbrechlich und kann leicht während der Zerlegung und Schnitte gestört werden. Ein detailliertes, standardisiertes und validiertes Protokoll von der Mausaugensektion und -orientierung bis zur Immunfärbung wird dazu beitragen, IHC-Artefakte deutlich zu reduzieren, wodurch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse erhöht und genauere Vergleichsdaten möglich sind. analyse.
Es gibt viele Protokolle für die Gewebevorbereitung für IHC, jedoch sind nicht alle für Netzhautgewebe geeignet. Starke Fixative wie 10% Formalin oder Bouin-Lösung bewahren die Netzhautstruktur während der Zerlegung und Schnittung5. Leider führen starke Fixative oft zur verstärkten Hintergrundfluoreszenz und Epitopmaskierung aufgrund der chemischen Modifikation von Epitopen6. Auf der anderen Seite können mildere Fixative, wie 4% Paraformaldehyd (PFA), einige dieser Artefakte lindern, erfordern aber eine sorgfältige Zerlegung und Schnitte, um die optimale Netzhautstruktur zu erhalten. PFA dringt schnell in Gewebe ein, aber Kreuz-Links-Proteine sehr langsam, wodurch das Risiko der Epitopmaskierung reduziert wird. Da die PFA-Inkubation in kurzer Zeit eine relativ milde Fixierung ist, benötigen Gewebe oft schnelles Einfrieren, um Antigene zu erhalten. Es ist wichtig, die Bildung von Eiskristallen beim Einfrieren des Gewebes zu vermeiden, da sie die Integrität von Zellen und Geweben verzerren und schädigen7.
Hier beschreiben wir detaillierte und standardisierte Protokolle für Sezieren, Fixierung und Kryoschutz von Maus-Okularbechern, die konsistente und zuverlässige IHC-Daten liefern.

<table><tbody><tr><td>6qt. Edelstahlbecher (185 x 218mm)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-48</td><td>Für flüssigen Stickstoff (Abbildung 1E)</td></tr><tr><td>Aluminiumfolie&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kauterisierer&nbsp;</td><td>Bovie</td><td>#AA01</td><td>Zur Markierung der Augenausrichtung (Abbildung 1A)</td></tr><tr><td>Gebogene Pinzette, Dumont #5/45 Pinzette, 45 Grad gebogen&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>#72703-D</td><td>Für die Enukleation und Pflege von Mausaugen (Abbildung 1A)</td></tr><tr><td>Gebogene Schere, Vannas Federschere - 2,5 mm Schneide</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge&nbsp;</td><td>#15002-08</td><td>Zum umlaufenden Schneiden der Hornhaut (Abbildung 1B)</td></tr><tr><td>Mit Zahnwachs beschichtete 35mm Dissektionsschale</td><td></td><td></td><td>Für die Dissektion der Augenmuschel (Abbildung 1C)</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop&nbsp;</td><td>Leica, Houston, USA&nbsp;</td><td>MZ12.5 Hochleistungs-Stereomikroskop-Mikromesser</td><td></td></tr><tr><td>- Kunststoffgriff&nbsp;</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge&nbsp;</td><td>#10315-12</td><td>Um einen kleinen Schnitt an der Brandstelle zu machen (Abbildung 1A)</td></tr><tr><td>Rosa Zahnwachs&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopische Wissenschaften&nbsp;</td><td>#72660</td><td>Zum Beschichten von Sezierschüsseln</td></tr><tr><td>Slide Rack und Abdeckplatte</td><td>Ted Pella</td><td>#36107</td><td>Für retinale IHC (Abbildung 1G)</td></tr><tr><td>Edelstahl Becherglas (89 x 114mm)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>#MA-40</td><td>Für Isopentanbad (Abbildung 1E)</td></tr><tr><td>Styroporbox</td><td></td><td></td><td>Für isolierte Kühlbox</td></tr><tr><td>Dünne Pinzette Dumont #5&nbsp; &nbsp;</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge&nbsp;</td><td>#11254-20</td><td>Um die Hornhaut zu entfernen und die Linse zu extrahieren (Abbildung 1B)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Kryomold&nbsp; (10 mm x 10 mm x 5 mm)</td><td>Elektronenmiskroskopie Wissenschaften&nbsp;</td><td>#62534-10</td><td>Schimmel für OCT Einbettung</td></tr><tr><td>Puffer und Reagenzien<</td><td>>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>><Kommentare</td></tr><tr><td>Blockierungslösung</td><td></td><td></td><td>2% Normales Pferdeserum, 1,5% kalte Fischhaut Gelatine (bei 40-50% in H2O, Katze #G7765), 5% Rinderserumalbumin (Katze #AK1391-0100) in Permeabilisierungspuffer.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Gelvatol (Antifading-Eindeckmedien)</td><td></td><td></td>Unter <td>dem Abzug 0,337 g DABCO (Sigma Kat. #D2522-25G) in 10 ml Fluoromount G (Fisher Kat. #OB100-01) auflösen. Mit 12N HCl (~ 5 Tropfen) auf pH 8-8,5 einstellen. In einer bernsteinfarbenen Tropfflasche bei 4° aufbewahren; C&nbsp; (8).&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 1000x Stock</td><td>Thermo Scientific</td><td>#62249</td><td>1 mg/ml in PBS (1000x). Aliquotieren und dunkel lagern, bei 4°; C für bis zu 1 Jahr oder bei -20°; C für Langzeitlagerung. Frisch zubereiten&nbsp; bei 1 μg/mL (1x) &nbsp;</td></tr><tr><td>Isopentan, 99%&nbsp;</td><td>GFS Chemicals</td><td>#2961</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff-Paraformaldehyd</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(PFA) in PBS</td><td>Elektronenmikroskopie&nbsp;</td><td>#15710</td><td>Frisch zubereitet 4% PFA aus 16% PFA-Lagerbestand. Lagern Sie die restlichen 16 % PFA bei 4 Grad; C im Dunkeln.&nbsp;</td></tr><tr><td>Permeabilisierungslösung</td><td></td><td></td><td>PBS + 0,25 % Triton-X (AMRESCO cat #0694-1L) + 0,05 % NaN3. Frisch zubereiten.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Bioworld&nbsp;</td><td>#41620015-20</td><td>0,02 g/L KCl, 0,02 g/L KH2PO4, 0,8 g/L NaCl, 0,216 g/l Na2HPO4 , pH 7,4. Hergestellt aus 10x Lager&nbsp;</td></tr><tr><td>Lösungen für Saccharose</td><td>Fisher Scientific &nbsp;</td><td>#S-5-500</td><td>Die entsprechende Menge Saccharose wird in 37° aufgelöst. C PBS (dauert ~15 Minuten, um sich aufzulösen). Kann einige Tage bei 4°C gelagert werden.</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT-Verbindung&nbsp;</td><td>Sakura</td><td>&nbsp;#4583</td><td></td></tr><tr><td>Antikörper</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>anti-Calbindin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8666</td><td>Zur Markierung von Horinzotalzellen&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-GAD65</td><td>Chemicon</td><td>AB5082</td><td>Zur Markierung von GABAergen amakrinen Zellen</td></tr><tr><td>anti-GS</td><td>BD Transduktion</td><td>610517</td><td>Zur Markierung von M&uuml; ller Zellen</td></tr><tr><td>Anti-Rhodopsin</td><td>Millipore</td><td>MAB5316</td><td>Zur Markierung von Stäbchen</td></tr></tbody></table>

vorbereitung von maus-retinal-cryo-sektionen für die immunhistochemie

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Die Vorbereitung hochwertiger Mausaugenabschnitte für die Immunhistochemie (IHC) ist entscheidend für die Beurteilung der Netzhautstruktur und -funktion und für die Bestimmung der Mechanismen, die Netzhauterkrankungen zugrunde liegen. Die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität während der gesamten Gewebepräparation ist für die Gewinnung reproduzierbarer retinaler IHC-Daten von entscheidender Bedeutung, kann aber aufgrund der Fragilität und Komplexität der retinalen Zytoarchitektur eine Herausforderung darstellen. Starke Fixative wie 10% Formalin oder Bouins Lösung bewahren die Netzhautstruktur optimal, sie behindern oft die IHC-Analyse, indem sie die Hintergrundfluoreszenz und/oder die abnehmenden Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen verbessern, ein Prozess, der als Epitopmaskierung bekannt ist. Milderfixative hingegen, wie 4% Paraformaldehyd, reduziert Die Hintergrundfluoreszenz und Epitopmaskierung, sorgfältige Seziertechniken müssen verwendet werden, um die Netzhautstruktur zu erhalten. In diesem Artikel stellen wir eine umfassende Methode zur Vorbereitung von Maus-Okularbechern für IHC vor, die ausreicht, um die meisten Antikörper-Epitop-Wechselwirkungen ohne Verlust der strukturellen Integrität der Netzhaut zu erhalten. Wir schließen repräsentative IHC mit Antikörpern gegen verschiedene Netzhautzelltypmarker ein, um die Gewebeerhaltung und -orientierung unter optimalen und suboptimalen Bedingungen zu veranschaulichen. Unser Ziel ist es, IHC-Studien der Netzhaut zu optimieren, indem wir ein komplettes Protokoll von der okularen hinteren Bechersektion bis zum IHC bereitstellen.

Um zu veranschaulichen, wie diese Protokolle eine optimale Netzhautkonservierung für IHC gewährleisten, untersuchten wir Netzhautabschnitte von P28 WT-Mäusen (C57BL/6N) mit Antikörpern gegen Rhodopsin (ein Photorezeptormarker)8, Glutaminsäure-Decarboxylase 65 (Gad65, eine Marker)9, Glutamin-Synthetase (GS, ein Müller-Zellmarker)10und Calbindin (ein horizontaler Zellmarker)11 (<strong class="xfi...

Dieser Bericht beschreibt umfassende Methoden zur Vorbereitung von gefrorenen Mausnetzteilen für die Immunhistochemie (IHC). Die beschriebenen Methoden umfassen die Zerlegung des okularen posterioren Bechers, die Paraformaldehydfixierung, die Einbettung in die Medien der optimalen Schnitttemperatur (OCT) und die Gewebeorientierung, die Schnitt- und Immunfärbung.

Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Maus Netzhaut-Sektion ist ein wirklich empfindlicher Prozess aufgrund der Größe und Form der Augen und die Fragilität der Netzhaut abschnitt. Imperative zu üben, mit einem detaillierten Protokoll, das effiziente Methode und Tipps bieten ist der Schlüssel zu qualitativ hochwertigen Netzhaut-Sektion und Abschnitt. Wir geben Tipps und Ratschläge, um Forschern zu helfen, häufige Fallstricke zu vermeiden und einige hochwertige Netzhautabschnitte zu erhalten, die für die Immunhistochemie geeignet sind.Markieren Sie den zeitlichen Teil des Auges einer eingeschläferten Maus mit einem Schwanzkauterizer, indem Sie die Hornhaut sehr leicht und für nicht mehr als eine Sekunde berühren, um die Hornhaut leicht zu verbrennen und ein Loch zu vermeiden. Unmittelbar danach verwendet gekrümmte Dumont 545 Zangen, um Mausaugen zu enukleatisieren. Die Augen in ein 1,5-Milliliter-Kryotube mit einem Milliliter 4%PFA und PBS legen und 15 Minuten auf Eis brüten.Dann übertragen Sie die fixierten Augen mit den gekrümmten Dumont 545 Zangen auf eine modifizierte 35-Millimeter-Sektionsschale, die mit PBS gefüllt ist, und unter das Sezieren des Mikroskops stellen. Verwenden Sie ein Mikromesser, um einen kleinen Schnitt an der Brandmarke senkrecht und knapp über der Limbusgrenze der Hornhaut zu machen. Fügen Sie eine gekrümmte Schere in den Schnitt ein und führen Sie einen Umfangsschnitt der Hornhaut nach dem Limbus durch.Dann, mit dünnen Dumont 5 Zangen, entfernen Sie die Hornhaut, extrahieren Sie die Linse, und heben Sie es zart weg von der hinteren Teil des Auges. Der Glaskörper wird mit der Linse herauskommen und die Netzhaut wird als weiße Oberfläche sichtbar sein, die die Innenseite der hinteren Augentasse bedeckt. Waschen Sie die isolierten Augenbecher zweimal in einem Milliliter PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Um die Augenbecher kryo-schützen, gleicht sie in 15% Saccharose und PBS über Nacht bei vier Grad Celsius aus, bis sie sinken. Dann die Augenbecher für zwei bis drei Stunden auf 30% Saccharose und PBS übertragen, bis sie sinken. Legen Sie die Augenbecher in OCT in 10 mal 10 Millimeter Kryo-Formen zum Einbetten.Richten Sie das Auge in der Kryoform unter einem Sezierendes Mikroskop entlang seiner dorsalen ventralen Achse aus, indem Sie das Auge so lange drehen, bis sich die Brandmarke oben befindet. Der Sehnerv ist einer links und der ausgeschnittene Teil der Form nach rechts. Um das Netzhautgewebe einzufrieren, tauchen Sie die Kryoform für mindestens fünf Minuten in einen Metallbecher mit Isopentan ein und legen Sie das Becherglas dann bis zu einem Drittel der Höhe des Becherglases in flüssigen Stickstoff.Entfernen Sie den gefrorenen Block, wickeln Sie ihn in Aluminiumfolie und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius. Verwenden Sie einen Stift oder Sharpie, um den eingefrorenen Block zu markieren, um seine Ausrichtung aufzuzeichnen. Nach der Einstellung der Kryostattemperatur zwischen minus 20 und minus 25 Grad Celsius, legen Sie die Formen mit den eingebetteten Augenbechern innen und lassen Sie sie auf die Kryostattemperatur für eine Stunde ausgrenzen.Installieren Sie den Block im Kryostat mit der dorsalen ventralen Ausrichtung und beginnen Sie, 10 Mikrometer dicke serielle Abschnitte zu schneiden. Stellen Sie die Netzhautabschnitte vorsichtig auf kommentierte und nummerierte Mikroskopdias und lagern Sie dann in Diaboxen bei minus 20 Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius, bis sie zum Immunstainieren bereit sind. Immunhistochemie mit Antikörpern gegen Rhodopsin, einen Photorezeptormarker, Glutaminsäure-Decarboxylase 65 und Amacrine-Zellmarker, Glutamin-Synthetase und Muller-Zellmarker und Calbindin, ein horizontaler Zellmarker, wurde an Netzhautabschnitten durchgeführt.Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Protokoll hohe Qualität und gut erhaltene Netzhautabschnitte liefert, im Gegensatz zu schlechter Qualität Netzhautabschnitte aus einem anderen Protokoll erhalten. Rhodopsin reiche innere und äußere Segmente bleiben vertikal und intakt mit wenig bis gar keine Trennung vom Überlegen des retinalen pigmentierten Epithels. Interneuronen, wie Gad65-positive Amacrinzellen, bleiben innerhalb der inneren Kernschicht und der inneren Plexiformschicht richtig geschichtet.Außerdem bleiben Muller-Zellen gut erhalten mit Soma, der in zytoplasmatischen Prozessen, die sich von der Ganglienzellschicht bis zur äußeren Kernschicht erstrecken, richtig ausgerichtet ist. Darüber hinaus sind gut definierte horizontale Zellen an der inneren Kernschicht und dem äußeren Plexiformschichtrahmen nachweisbar. Es ist wichtig, den Topperbereich der Augen zu markieren und die Orientierung während der Einbettung zu behalten.Bereiten Sie Paraformaldehyd unter der Haube immer mit der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung vor.

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Wir beschreiben ein Protokoll für transcardiac Perfusion von Mäusen, die Entfernung und Schnitte des Gehirns sowie Immunperoxidasefärbung, Harz eingebettet, und ultradünne Schnitte des Gehirns Abschnitten. Nach Abschluss dieser Verfahren ist die immungefärbt Material bereit zur Untersuchung mit der Transmissionselektronenmikroskopie.

Vorbereitung von Gehirngewebe der Maus für Immunelektronenmikroskopie

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine...

Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Das hier beschriebene Protokoll dient zur strukturellen Bewertung eines Wholemount-Netzhautpräparats. Dazu gehören Beschreibungen der Gewebedissektion, der Montage auf einem hydrophilisierten Membraneinsatz aus Polytetrafluorethylen (PTFE), der Bolusbeladung mit fluoreszierenden Markern und ein Vergleich der Fixierung mit Carbodiimid und Paraformaldehyd für die immunhistochemische Analyse zellulärer und synaptischer Komponenten.

Optimiertes Protokoll für die retinale Wholemount-Vorbereitung für Bildgebung und Immunhistochemie

Wir führen drei verschiedene Gewebe Vorbereitung Techniken für immunhistochemische Visualisierung der Ratte retinalen mikrovaskuläre perizyten, d. h. Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone Isolierung des vaskulären-Netzes.

Netzhaut Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem Vorbereitungen für immunhistochemische Visualisierung von Mikrovaskulären Perizyten

Das Ziel dieses Berichts ist es, das Protokoll für robuste immunhistochemischen Nachweis von epigenetischen Markierungen beschreiben, 5-Methylcytosine (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) bei der Entwicklung und postmitotischen Maus Netzhaut.

Immunhistochemische Nachweis von 5 Methylcytosine und 5-Hydroxymethylcytosine bei der Entwicklung und der postmitotischen Maus Retina

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anpassung der CLARITY-Methode des Hirngewebes für ganzklächige Netzhäute vor, um die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und hochauflösenden Bildgebung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen zu verbessern.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

Mausmodelle können nützliche Werkzeuge sein, um die Biologie des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass Mäuse eine Reihe von RPE-Pathologien entwickeln können. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Phänotypisierungsprotokoll zur Aufklärung und Quantifizierung von RPE-Pathologien in Mäusen mittels Licht-, Transmissionselektronen- und konfokaler Mikroskopie.

Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte der Immunelektronenmikroskopie vor der Einbettung, wobei der Schwerpunkt auf der Erforschung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung in der Netzhaut liegt.

Untersuchung von retinalen Schaltkreisen und molekularer Lokalisierung durch Voreinbettung der Immunelektronenmikroskopie

Die Perizyten in retinalen Gefäßen wurden durch Immunfluoreszenzfärbung mit Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptoren β nach retroorbitaler Injektion von fluoreszierendem Tomatenlektin untersucht. Die markierte Netzhaut wurde weiter mit der Gewebereinigungsmethode behandelt und als Ganzes montiert, um die dreidimensionalen Ansichten der Perizyten, die das retinale Gefäßsystem umgeben, unter einem konfokalen Mikroskop zu visualisieren.

3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung 

Es wird ein Protokoll zur Vorbereitung von Kryoschnitten der Maus-Netzhaut und zur Durchführung von Immunfärbungen an Photorezeptoren beschrieben. Dieser Artikel ermöglicht es Forschern, konsistente Schnellschnitte der Netzhaut von Mäusen mit gut erhaltener Morphologie und qualitativ hochwertigen Immunfärbeergebnissen zu erstellen.

Kryosektion und Immunfärbung der Netzhaut der Maus

Die Netzhaut weist eine komplexe räumliche Organisation über ihre laminare Struktur auf. Moderne räumliche Transkriptomik- und Sequenzierungstechniken erfordern Gewebeschnitte mit einer Dicke von &lt; 20 μm, was ihre Anwendbarkeit in der Netzhautforschung einschränkt. Diese frisch gefrorene Kryosektionsmethode erzeugt dünne Gesichtsabschnitte der Netzhaut von Mäusen unter Beibehaltung planarer räumlicher Beziehungen und ermöglicht so eine umfassende molekulare Kartierung über Laminae hinweg.

En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

Lernen Sie die Präparation von Maus-Retina-Cryo-Schnitten für die Immunhistochemie. Diese Methode umfasst okuläre Dissektion, Fixierung in Paraformaldehyd und Kryo-Schneiden für hochwertige immunhistochemische Analysen retinaler Zellstrukturen.

Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

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