Name: Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Proteinquantifizierung in Gehirnregionen mittels Immunhistochemie und Nahinfrarot-Scanning. Diese Methode ermöglicht die Analyse molekularer Signalwege und kognitiver Marker in Rattenhirnschnitten.

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Die Forschung in diesem Bericht wurde durch ein Zielzuschuss der NIGMS (1P20GM103653) an DK finanziert.

Das folgende Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Delaware genehmigt. Männliche Sprague Dawley Ratten etwa 55 – 75 Tage alt wurden für dieses Protokoll verwendet.
1. Gehirnerschütterung und Zahnarztepräparation
<ol><li>Anästhesie-Ratte mit Isoofluran in der Anästhesie-Induktionskammer, bis die Ratte keine Antwort mehr auf die Fußspinne ausweist.</li>
	<li>Opfere Ratten durch schnelle Enthaktung mit einer Guillotine.</li>
	<li>Die Haut auf den Schädel nach vorn nach vorn schneiden und von der Oberseite des Schädels entfernen.</li>
	<li>Verwenden Sie Rinnen, um sorgfältig zu entfernen, den hinteren Teil des Schädels, und dann mit kleinen zerkleinerten Schere abgeschnitten in der Mittellinie des Schädels, drücken nach oben gegen die Spitze des Schädels zu jeder Zeit, um zu vermeiden, dass das Hirngewebe.</li>
	<li>Verwenden Sie Rongeurs, um rechts und links die Hälfte des Schädels wegzuschalen, um das Gehirn zu entlarven.</li>
	<li>Verwenden Sie einen kleinen Spachtel, um unter Gehirn und Schleiernerven zu schaufeln, vorsichtig das Gehirn zu heben und das Gehirn in Isodament zu kühlen auf Trockeneis (mindestens-20 ° C) zu frieren. Danach die Gehirne in einem Gefrierschrank von-80 ° C aufbewahren, bis sie geschnitten werden.</li>
	<li>Scheibenhirne in Weinregionen von Interesse bei 30 – 50 μm in einem Kryostat, der zwischen-9 ° C und-12 ° C gehalten wird. Leicht Scheiben auf Glasscheiben montieren und bis zur Zeit des Immunozytochemie-Sehs in einem Gefrierschrank von-80 ° C aufbewahren. NOTE: In diesem Protokoll waren Hirnregionen von Interesse, die Hippocampus und die Amygdala.</li>
</ol>2. Einheitliche Immunhistochemische Reaktion
NOTE: Bei doppelter Immunhistochemie ist das Protokoll das gleiche wie die einzelne immunhistochemische Reaktion, mit Ausnahme dieser Reaktion haben zwei primäre Antikörper verschiedener Wirte (z.B. Kaninchen und Maus) und zwei sekundäre Antikörper für die entsprechenden Die Vorwahlen sollten von einem einzigen Wirt (z.B. Ziegenantirabbit und Ziegenantimaus) stammen. Die sekundären Antikörper müssen auch aus zwei verschiedenen Spektren stammen, die in hochauflösenden Scannern erhältlich sind. Zum Beispiel ein sekundärer Antikörper mit einem Emissionsspektrum von 680 nm und ein sekundärer Antikörper 800CW (Emissionsspektrum-Peak bei 780 nm).
<ol><li>Entfernen Sie Glasrutschen aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sich 30 Minuten lang auf Raumtemperatur ausgleichen.</li>
	<li>Unter einer Rauchhaube fest das Hirngewebe in 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphat-gepufferten Salinen (PBS) für 1 − 2 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Spülen Sie Dias in 0,1 M Tris gepufferte Saline (TBS) dreimal für jeweils 10 min. Durchdringung der Zellmembranen durch Inkubationsrutschen in einem milden Reinigungsmittel (z.B. 0,01% Reinigungsmittel) für 30 − 60 min.</li>
	<li>Spülen Sie Dias in TBS dreimal für jeweils 15 min.</li>
	<li>Ermitteln Sie primären Antikörper für Proteine von Interesse an PBS in der richtigen Konzentration. Zum Beispiel, um das unmittelbare frühe Gen c-Fos zu erkennen, bereiten Sie ein Kaninchen primären Anti-c-Fos-Antikörper in einer Konzentration von 1:500.</li>
	<li>Pipette primäre Antikörper-Lösung direkt auf das Hirngewebe (ca. 200 μL pro 3 Zoll x 1 Zoll Dia).</li>
	<li>Verwenden Sie Coverslips, um das Hirngewebe auf Glasdias in der primären Antikörper-Verdünnung für 1 − 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht (~ 17 h) bei 4 ° C zu inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Versionslippen und waschen Sie Dias in TBS, das eine geringe Menge Waschmittel (z.B. 0,01% Waschmittel, "TBS-T") viermal für je 15 min.</li>
	<li>Verwenden Sie Coverslips, um Hirnabschnitte in einem sekundären Antikörper bei Raumtemperatur für 2 Stunden zu inkubieren. NOTE: Der sekundäre Antikörper muss zur richtigen Verdünnung und in einem Abdünnungsmittel mit TBS, Waschmittel und 1,5% Wirtsserum sein. So würde beispielsweise ein Ziegensekundenkörper in einer Verdünnung von 1:2000 1,5% Ziegenserum und 0,05% Reinigungsmittel enthalten.</li>
	<li>Spülen Sie Dias in TBS-T viermal für je 20 min und dann in TBS viermal für 20 min.</li>
	<li>Trockene Rutschen bei Raumtemperatur in der Dunkelheit über Nacht. Wenn die Rutschen trocken sind, sind sie bereit für die Bildgebung.</li>
</ol>3. Bildgebung
<ol><li>Legen Sie Dias auf die Nahinfrarot-Scanschnittstelle mit dem nach unten gerichteten Gewebe. Entweder eine Glasscheibe oder mehrere Dias gleichzeitig mit einem Auswahlwerkzeug abbilden.</li>
	<li>Bild-Dias mit der höchsten Qualitätseinstellung mit einem Offset von 0 nm und einer Auflösung von 21 μm. Das Scannen dauert in der Regel 13 − 19 h, je nach verwendetem Scangerät.</li>
	<li>Importieren Sie Bilder in die Bildanalyse-Software (z.B. ImageStudio), um sie für die semi-quantitative Proteinanalyse zu sehen und zu markieren.</li>
</ol>4. Protein-Expressionsanalyse
<ol><li>Öffnen Sie die Bildanalyse-Software und wählen Sie den Arbeitsbereich , in den das Bild gescannt wurde.</li>
	<li>Öffnen Sie das gescannte Bild in der Bildanalyse-Software, um den Scan zu sehen, und passen Sie an, welche Wellenlängen angezeigt werden, sowie den Kontrast, die Helligkeit und die Vergrößerung, ohne das Rohbild oder die Gesamtquantifizierung zu verändern.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Schlüsselregionen für die Quantifizierung und wählen Sie die Registerkarte Analyse am oberen Rand der Seite, dann wählen Sie Ziehung Rechteck (oder Zeichnen Ellipse/Zeichnen Sie Freehand), um ein Rechteck über den Bereich, der quantifiziert werden wird zu zeichnen. </li>
	<li>Um die Größe des Rechtecks zu sehen, wählen Sie Formen am unteren linken Rand des Bildschirms, dann wählen Sie die Säulen unten rechts. Fügen Sie die Höhen- und Breitenspalten hinzu, um die Formgröße zu ermitteln. NOTE: Wichtig ist, beim Vergleich der Quantifizierung die Formgröße zu kontrollieren. Es wird empfohlen, identische Formen zu verwenden, die innerhalb des gewünschten Quantifizierungsortes platziert sind, um eine genaue Probenahme der Emissionen für diese Region zu erhalten.</li>
	<li>Dann die Form benennen und wiederholen. Sobald alle Regionen gesampelt sind, können die Daten, die aus dem Spalten-Tab verfügbar sind, aggregiert und analysiert werden.</li>
</ol>

<ol><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+Neural+Science%22">Principles of Neural Science</a>. , McGraw Hill. New York. (2013).</li>
<li>Byrne, J. H., Roberts, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aByrne%2C+JH+%22From+Molecules+to+Networks%3A+An+Introduction+to+Cellular+and+Molecular+Neuroscience%22">From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience</a>. , Academic Press/Elsevier. (2009).</li>
<li>Salami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2%2F3+binding+potential+modulates+neural+signatures+of+working+memory+in+a+load-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion.</a> Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+amygdaloid+corticotropin-releasing+hormone+%28CRH%29+mediate+anxiety-like+behaviors%3F+Dissociation+of+anxiogenic+effects+and+CRH+release%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).</li>
<li>English, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+mouse+hippocampus+profiled+by+LC-MS%2FMS+for+label-free+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation.</a> Data in Brief. 7, 341-343 (2016).</li>
<li>David, M. A., Tayebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein+aggregates+in+brain+and+cerebrospinal+fluid+derived+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients.</a> Frontiers in Neurology. 5, 251(2014).</li>
<li>Oliver, C., Jamur, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li>
<li>Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescent+cells+in+rat+brain+can+be+convincing+impostors+in+green+fluorescent+reporter+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-Jun+to+identify+fear+extinction+learning-specific+patterns+of+neural+activity+that+are+affected+by+single+prolonged+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Researach%22%5BJournal%5D)">Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress.</a> Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+via+which+single+prolonged+stress+exposure+leads+to+fear+extinction+retention+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits.</a> Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).</li>
<li>Eagle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+prolonged+stress+enhances+hippocampal+glucocorticoid+receptor+and+phosphorylated+protein+kinase+B+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels.</a> Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die in diesem Artikel vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die nahezu infrarote Immunozytochemie in Kombination mit hochauflösendem Scannen genutzt werden kann, um semiquantitative Maßnahmen der Proteinexpression im Hirngewebe zu erhalten. Es kann auch verwendet werden, um zwei Proteine gleichzeitig in der gleichen Hirnregion zu kennzeichnen. Wir haben zuvor die Infrarot-Immunhistochemie verwendet, um die sofortige frühe Genexpression in mehreren Hirnregionen9,10zu</s...

Die Studie der Neurowissenschaften betrifft eine Untersuchung, wie Zellen im Gehirnbestimmte Funktionen 1vermitteln. Diese können zellulärer Natur sein, wie zum Beispiel, wie Gliazellen Immunität im zentralen Nervensystem gewähren oder Experimente beinhalten, die erklären sollen, wie die Aktivität von Neuronen im dorsalen Hippocampus zu einer räumlichen Navigation führt. Im weitesten Sinne wird die zelluläre Funktion durch die Proteine bestimmt, die in einer Zelle ausgedrückt werden, und dieAktivität dieser Proteine 2. Daher ist die Messung des Ausdrucks und/oder Aktivität von Proteinen in Gehirnzellen entscheidend für die Untersuchung der Neurowissenschaften.
Eine Reihe von Techniken stehen zur Verfügung, um Proteinausdruck im Gehirn zu messen. Dazu gehören in vivo-Methoden wie Positronen-Emissionstopografie für Rezeptordichten 3 und Mikrodialyse für kleine Peptide4. Häufiger werden Ex-vivo-Methoden verwendet, um Proteinfunktion und-ausdruck zu untersuchen. Dazu gehören Massenspektrometrie-Techniken 5, Western Blot und enzym-verknüpfte immunsorbierende Assay(ELISA) 6, und Immunozytochemie7. Die Immunozytochemie ist im Bereich der Neurowissenschaften weit verbreitet. Bei dieser Technik wird ein primärer Antikörper verwendet, um ein Protein (oder Antigen) von Interesse zu erkennen (z.B. c-Fos) und einen konjugierten sekundären Antikörper, um den Protein-primären Antikörper-Komplex zu erkennen (Abbildung1). Um den Nachweis des protein-primären Antikörper-Sekundarkkomplexes zu ermöglichen, haben sekundäre Antikörper oxidierende Substanzen wie Meerrettiche Peroxidase (HRP), die ihnen konjugiert werden. Dies ermöglicht die Bildung von Niederschlägen in Zellen, die mit Lichtmikroskopie7erkannt werden können. Sekundäre Antikörper können auch Chemikalien haben, die fluoreszieren, um sie zu konjugieren (z.B. Fluorophore). Bei der Stimulierung stoßen diese Chemikalien Licht aus, mit dem Protein-primäre Antikörper-sekundäre Antikörper-Komplexe 7 erkannt werden können. Schließlich sind primäre Antikörper manchmal mit Reduktionsmitteln und Fluoreszenzchemikalien versehen, die direkt die Notwendigkeit von sekundären Antikörpern7 beeinträchtigen (Abbildung1).
Interessanterweise erlauben viele immunozytochemische Methoden die Visualisierung von Proteinen in Gehirnzellen, nicht aber die Fähigkeit, die Proteinmenge in einer bestimmten Zell-oder Hirnregion zu quantifizieren. Der Einsatz von Lichtmikroskopie zur Erkennung von Niederschlägen aus Reduktionsreaktionen ermöglicht die Visualisierung von Neuronen und Glia, aber diese Methode kann nicht verwendet werden, um Proteinexpression in Zellen oder in einer bestimmten Hirnregion zu quantifizieren. Theoretisch kann dafür die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, denn das Licht, das aus dem fluoreszierenden sekundären Antikörper emittiert wird, ist ein Maß für den proteinprimären Antikörper-Sekundenkomplex. Die Autofluoreszenz im Hirngewebe kann es jedoch schwierig machen, mit der Fluoreszenzmikroskopie die Proteinexpression im Hirngewebe 8zuquantifizieren. Daher wird Licht, das aus fluoreszierenden Bildern von Hirngewebe emittiert wird, nur selten zur Quantifizierung des Proteinausdrucks im Gehirn verwendet.
Viele dieser Probleme können mit Hilfe der Infrarot-Immunozytochemie in Verbindung mit hochauflösenden Scannenvon 9,10angegangenwerden. In diesem Artikel beschreiben wir, wie die Immunozytochemie in Verbindung mit Fluorophoren in den nahezu infrarotfarbenen Emissionsspektren mit hochauflösenden Scannen (z.B. 10 – 21 μm) kombiniert werden kann, um scharfe Bilder zu erhalten, die eine Halbquantifizierung des Proteins in unterschiedlichen Hirnregionen.

<table><tbody><tr><td>Brain Extraction</td> Anesthesia <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Induction Chamber</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-0530SM</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Guillotine</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-1920</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td>zur Entfernung der Rückseite des Schädels</td></tr><tr><td>Zarte Präparierschere</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-951-5</td><td>wird verwendet, um entlang der Mittellinie des Schädels nach oben zu schneiden</td></tr><tr><td>Mikrospatel</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-5</td><td>wird verwendet, um das Gehirn herauszuschöpfen</td></tr><tr><td>Glasmikroskop-Objektträger</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-549-6</td><td></td></tr><tr><td>Immunhistochemische Reaktion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Wird als mildes Reinigungsmittel zur Permeabilisierung von Zellen nach Fixierung in Paraformaldehyd verwendet, wird auch als mildes Reinigungsmittel in Kombination mit Wirtsserum und Sekundärantikörpern verwendet;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td>Wird als kleine Menge Reinigungsmittel verwendet, die TBS zugesetzt wird, um TBS-T herzustellen, nachdem Objektträger mit dem primären Antikörper</td></tr><tr><td>Licor Odyssey Scanner</td><td>Licor Biotechnology Inc.</td> abgedeckt wurden.<td></td><td></td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>Licor Biotechnologie Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einsatz von infrarot-fluoreszenz und hochauflösendem scannen zur messung des protein-expression im rodentrains

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neurowissenschaften ist die Studie, wie Zellen im Gehirn verschiedene Funktionen vermitteln. Die Messung der Proteinexpression in Neuronen und Glia ist für die Erforschung der Neurowissenschaft von entscheidender Bedeutung, da die zelluläre Funktion durch die Zusammensetzung und Aktivität zellulärer Proteine bestimmt wird. In diesem Artikel beschreiben wir, wie die Immunozytochemie mit dem Infrarot-hochauflösenden Scannen kombiniert werden kann, um eine halbquantitative Messung der Proteinexpression in unterschiedlichen Hirnregionen zu ermöglichen. Diese Technik kann für den Einzel-oder Doppelproteinausdruck in der gleichen Hirnregion verwendet werden. Die Messung von Proteinen auf diese Weise kann verwendet werden, um eine relative Veränderung des Proteinausdrucks mit einer experimentellen Manipulation, molekularer Signatur von Lernen und Gedächtnis, Aktivität in molekularen Wegen und neuronale Aktivität in mehreren Hirnregionen zu erreichen. Mit den richtigen Proteinen und statistischen Analysen kann auch die funktionelle Konnektivität zwischen Hirnregionen ermittelt werden. Angesichts der Leichtigkeit der Einführung der Immunozytochemie in einem Labor, die Verwendung von Immunozytochemie mit nahezu infraroten hochauflösenden Scannen kann die Fähigkeit der Neurowissenschaftler, neurobiologische Prozesse auf einer Systemebene zu untersuchen zu erweitern.

Vor dem Einsatz hochauflösender Scannern für Immunhistochemie sollte man überprüfen, ob das Protokoll funktioniert. Dies kann mit einem Validierungs-Test erreicht werden, bei dem Hirnabschnitte aus dem gleichen Tier mit primären und sekundären Antikörpern, sekundären Antikörpern allein oder weder primären noch sekundären Antikörpern inkubiert werden. Die Ergebnisse für einen solchen Validierungs-Test sind in Abbildung2 dargestellt. In dieser Reaktion erkannte...

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das nahezu infrarote Farbstoffe in Verbindung mit Immunhistochemie und hochauflösendem Scannen verwendet, um Proteine in Hirnregionen zu untersuchen.

Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es die Quantifizierung von zwei Proteinen in derselben Hirnregion ermöglicht. Dies ermöglicht es dem Experimentator, die Aktivität in molekularen Signalwegen in Hirnregionen zu betrachten, indem er Pan- und Phosphoproteine ansieht. Es kann auch verwendet werden, um Proteine zu assay, die Marker für verschiedene kognitive Phänomene sind.Wir verwenden eine relativ einfache Technik, wie die Immunhistochemie, um Fragen zu beantworten, die in der Regel mehr beteiligte Techniken erfordern. Einschließlich der Untersuchung der Aktivität molekularer Signalwege, Untersuchung des AMPA/NMDA-Verhältnisses. Mit einem Kryostat zwischen minus 9 Grad Celsius und minus 12 Grad Celsius, Schneiden Sie zuvor isoliert und gefrorene Ratten Gehirn in Regionen von Interesse bei 30-50 Mikrometer.Scheiben direkt auf Glasrutschen montieren und bei minus 80 Grad Celsius bis zur Immunzytochemie lagern. Entfernen Sie die Glasgletten aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie 30 Minuten lang auf Raumtemperatur ausdemieren. Arbeiten unter einer Dunstabzugshaube, legen Sie die Dias in 4%Paraformaldehyd in 0,1 molaren PBS für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur für Gewebefixierung.Dann spülen Sie die Dias in 0,1 Molaren TBS dreimal für jeweils 10 Minuten. Um Zellmembranen zu permeabilisieren, inkubieren Sie die Dias 30-60 Minuten lang in einem milden Reinigungsmittel. Und spülen Sie wieder in TBS dreimal für jeweils 15 Minuten.Verdünnung des primärantikörpers für Protein von Interesse an PBS in der richtigen Konzentration, wie im Manuskript beschrieben. Pipette primäre Antikörperlösung direkt auf das Gehirngewebe. Legen Sie Deckelrutschen auf die Dias und inkubieren Sie das Gehirngewebe in primäre Antikörperverdünnung für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur.Nach der Inkubation entfernen Sie die Deckelscheine und waschen Sie die Dias in TBS, dem eine kleine Menge Reinigungsmittel zugesetzt wird, viermal für jeweils 15 Minuten. Sekundärantikörper in einem Verdünnungsmittel, das TBS, Waschmittel und 1,5 % des Wirtsserums enthält, verdünnen. Sekundären Antikörper zu den Dias hinzufügen, mit Deckelscheine abdecken und bei Raumtemperatur zwei Stunden lang inkubieren.Nach der Inkubation spülen Sie die Dias in TBS-T viermal für jeweils 20 Minuten und dann viermal für jeweils 20 Minuten in TBS. Trocknen Sie die Dias bei Raumtemperatur im Dunkeln, über Nacht. Platzieren Sie Dias auf der Nahinfrarot-Scan-Schnittstelle mit dem Nachuntengewebe.Bildn ermehrere Folien gleichzeitig mit dem Auswahlwerkzeug. Stellen Sie die Dias mit der höchsten Qualitätseinstellung mit einer Auflösung von 21 Mikrometern ab. Importieren Sie Bilder in einem Offset von null Nanometern in Bildanalysesoftware, um sie für die semiquantitative Proteinanalyse anzuzeigen und zu markieren.Wählen Sie nach dem Öffnen der Bildanalysesoftware den Arbeitsbereich aus, in den das Bild gescannt wurde. Öffnen Sie dann das gescannte Bild in der Bildanalysesoftware, um die angezeigten Scan- und Längenwellenlängen, Kontraste, Helligkeit und Vergrößerung anzuzeigen, ohne das Rohbild oder die gesamte quantifizierte Emission zu verändern. Nachdem Sie die Schlüsselbereiche für die Quantifizierung identifiziert haben, wählen Sie die Registerkarte Analyse am oberen Rand der Seite aus, und wählen Sie dann Rechteck zeichnen aus, um ein Rechteck über den zu quantifizierenden Bereich zu zeichnen.Um die Rechteckgröße anzuzeigen, wählen Sie Shapes unten links auf dem Bildschirm aus. Wählen Sie dann Spalten unten rechts aus. Fügen Sie dann Spalten in Höhe und Breite hinzu, um die Formgröße zu identifizieren.Benennen Sie schließlich die Form, und wiederholen Sie sie. Sobald alle Regionen abgetastet wurden, fahren Sie mit dem Kombinieren und Analysieren der daten aus der Registerkarte Spalten fort. Um zu überprüfen, ob dieses Protokoll funktioniert, wurden Hirnabschnitte mit primären und sekundären Antikörpern, sekundärem Antikörper allein oder weder primärem noch sekundärem Antikörper inkubiert.Die sofortige frühe frühe Gen-c-jun-Expression wurde im dorsalen Hippocampus und Amygdala nur nachgewiesen, wenn sowohl primäre als auch sekundäre Antikörper auf das Gehirngewebe angewendet wurden. GluR1-Untereinheit des AMPA-Rezeptors und die NR2A-Untereinheit des NMDA-Rezeptors wurden im Stuhlproteinnachweis in Amygdala-Kernen assayed. Dies ermöglichte die Untersuchung des Verhältnisses der AMPA-NMDA-Rezeptoren in Subkernen der Amygdala, die eine neurobiologische Signatur des Lernens und Gedächtnisses ist.Mittlere und normalisierte Messungen der Proteinexpression wurden aus hochauflösenden Scans im ventralen Hippocampus gewonnen. Mit Hilfe der Bildanalyse-Software wird ein Rechteck in den Bereich des Interesses gelegt und die mittlere Intensität des Lichts aus der Form wurde als Maß für die Fluorophorexpression verwendet, die ein Maß für die Proteinexpression ist. Um die normalisierte Kurve zu erhalten, wurde eine Form über einen Bereich gelegt, der ein hohes Signal ausdrückt, und ein niedriges Signal im Bereich unter der Kurve wurde als Maß für die Proteinexpression verwendet.Der größte Kampf mit diesem Verfahren ist es, einen Antikörper zu finden und sicherzustellen, dass es funktioniert. Die Anwendung ist einfach. Mein Rat wäre, zuerst ein regelmäßiges immunhistochemisches Verfahren zu versuchen, dann versuchen Sie diese Technik.Führen Sie immer zuerst einen Validierungstest durch. Das Wichtigste, was Sie sich merken sollten, ist, Ihre Antikörperverdünnung zu überprüfen und sicherzustellen, dass sie richtig angewendet wird. Ohne diese Schritte schlägt das Verfahren fehl.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Bild fluoreszenzmarkierten Zellen in semi-dicken Hirnschnitten. Durch die Fixierung, Schneiden und optisch Clearing Hirngewebe beschreiben wir, wie Standard-epifluoreszenten oder konfokale Bildgebung verwendet werden, um einzelne Zellen und neuronalen Netzwerken im intakten Nervengewebe zu visualisieren.

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

Dieses Video zeigt die Immunfluoreszenzfärbung eines Maushirnschnitts, um die Verteilung eines spezifischen präsynaptischen Proteins zu quantifizieren. Der Prozess umfasst das Blockieren unspezifischer Stellen, das Aufbringen von Primärantikörpern für das Zielprotein und einen Referenzmarker, gefolgt von der Markierung von Sekundärantikörpern und der nuklearen Gegenfärbung. Der Referenzmarker gewährleistet eine genaue Quantifizierung, indem er eine konsistente Ausgangsbasis liefert, und die...

Quantifizierung der Verteilung eines präsynaptischen Proteins im Gehirn von Mäusen mittels Immunfluoreszenz

Quelle: Jolly, S., et.al. Kombination von Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit Immunmarkierung zum Nachweis der Expression von drei Genen in Hirnschnitten von Mäusen. J. Vis. Exp. (2016). Dieses Video zeigt die Verwendung von Doppelfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, um die Expression von zwei RNA-Zielen in Hirnschnitten von Mäusen sichtbar zu machen. Das Protokoll umfasst den sequentiellen Nachweis von RNA mit Sonden, die mit Fluoresceinisothiocyanat und Digoxigenin markiert sind,...

 Durchführung einer Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zum Nachweis der Genexpression in Gehirnschnitten von Mäusen

Quelle: Kimmelmann-Shultz, B., &lt;span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'&gt;et. al. Mit Nahinfrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung der Proteinexpression im Nagetiergehirn. J. Vis. (2019) Dieses Video zeigt eine Nahinfrarot-Fluoreszenz- und hochauflösende Scanmethode zur Messung der Proteinexpression im Gehirn...

Messung der Proteinexpression im Nagetiergehirn mittels Nahinfrarot-Fluoreszenz und hochauflösender Abtastung 

Quelle: Lacin, E., et al. Konstruktion von zellbasierten Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reportern (CNiFERs) für die optische Detektion von Neurotransmittern in vivo. J. Vis. Exp. (2016)Dieses Video zeigt eine Technik zur Abbildung der Neurotransmitterfreisetzung in vivo unter Verwendung von zellbasierten Neurotransmitter-Fluoreszenz-Reportern (CNiFERs), spezialisierten Reporterzellen, die in die Hirnrinde der Maus vorinjiziert werden. Die Maus wird unter einem Zwei-Photonen-Mikroskop...

Bildgebung der Freisetzung von Neurotransmittern mit zellbasierten Neurotransmitter-Fluoreszenz-Reportern

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Technik zu verwenden, um bestimmte Arten von Nervenzellen für die anschließende Analyse der zelltypspezifischen Genexpression, epigenetischen Markern und/oder Proteinexpression zu sortieren.

Mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung die zelltypspezifische Genexpression im Hirngewebe von Ratten untersuchen

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur subzellulären Protein Lokalisierung auf Zebrafisch Netzhaut Ergebnisse korrelieren Höchstauflösung Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie Bilder scannen.

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

Die Proteinsynthese ist ein kritischer biologischer Prozess für Zellen. Im Gehirn ist es für adaptive Veränderungen erforderlich. Die Messung der Raten der Proteinsynthese im intakten Gehirn erfordert sorgfältige methodische Überlegungen. Hier stellen wir die l-[1-14C]-eucinquantitative autoradiographische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in vivo vor.

Quantitative autoradiografische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in Vivo

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) in verschiedenen zellulären Kompartimenten des Nagetierhirns effizient zu quantifizieren. Anwender sind in der Lage, die USB-Funktion in nuklearen, zytoplasmatischen und synaptischen Fraktionen bei demselben Tier zu untersuchen, wodurch die Zeit und Anzahl der Tiere, die für die Durchführung dieser komplexen Analysen benötigt werden, reduziert wird.

Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

Wir berichten über einen einfachen, zeiteffizienten und auf Fluoreszenzspektroskopie basierenden Hochdurchsatz-Assay zur Quantifizierung von Aktinfilamenten in ex vivo biologischen Proben aus Hirngeweben von Nagetieren und menschlichen Probanden.

Ein zeiteffizienter Fluoreszenzspektroskopie-basierter Assay zur Bewertung des Actin-Polymerisationsstatus in Nagetier- und menschlichem Hirngewebe

Erfahren Sie die Proteinquantifizierung in Gehirnregionen mittels Immunhistochemie und Nahinfrarot-Scanning. Diese Methode ermöglicht die Analyse molekularer Signalwege und kognitiver Marker in Rattenhirnschnitten.

Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains

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