Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription
26. Juli 2019
Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren (TFs) mit der RNA-Polymerase werden in der Regel mit Pulldown-Assays untersucht. Wir wenden eine Biolayer Interferometry (BLI) Technologie an, um die Wechselwirkung von GrgA mit der Chlamydien-RNA-Polymerase zu charakterisieren. Im Vergleich zu Pulldown-Assays erkennt BLI Echtzeit-Assoziation und Dissoziation, bietet eine höhere Empfindlichkeit und ist sehr quantitativ.
Die Protein-Protein-Wechselwirkung bei der Transkription wurde traditionell mit Por-Dialyse untersucht. Die Por-Dialyse ist jedoch rein quantitativ. Wir verwenden Biolayer-Interferometrie, oder BLI, um dieses Problem zu überwinden.
Im Vergleich zu Por dan erkennt BLI Echtzeit-Assoziationen und Dissoziationen zwischen Bindungspartnern. Es erzeugt auch quantitative kinetische Parameter, die auf Interaktionsmechanismen hinweisen. BLI-Technologie mag einschüchternd klingen, aber es ist nicht schwer zu lernen, um diese Technologie zu verwenden, muss man den Zugriff auf ein BLI-Instrument und die zugehörige Software haben.
Mit diesem Video können Sie sich einfach an die BLI-Technologie anpassen. Etwa 10 Minuten vor Beginn eines Assays, Pipette 200 Mikroliter des BLI-Puffers in ein PCR-Rohr. Entfernen Sie einen Nickel-NTA-Biosensor aus der Originalverpackung, indem Sie den breiten Teil des Biosensors mit einer handgeliebten Hand halten.
Legen Sie den Biosensor über das PCR-Rohr, so dass nur die Glasspitze des Biosensors in den BLI-Puffer eingetaucht ist. Halten Sie die Biosensorspitze mindestens 10 Minuten unter Wasser, um eine vollständige Hydratation zu gewährleisten. Schalten Sie die Blitz-Maschine ein.
Stellen Sie sicher, dass das Gerät über einen USB-Datenausgangsanschluss auf der Rückseite des Geräts mit dem Computer verbunden ist. Öffnen Sie auf dem Computer die zugehörige Software und klicken Sie auf Advanced Kinetics auf der linken Seite des Bildschirms. Geben Sie in der Software alle entsprechenden Informationen über das Experiment unter den jeweiligen Überschriften ein.
Klicken Sie auf Biosensor Type und wählen Sie Nickel NTA aus dem Dropdown-Menü. Die Dauer jedes Schritts kann bei Bedarf von der Standardeinstellung geändert werden. Für optimale Ergebnisse mindestens 30 Sekunden für die Ausgangs- und Ausgangsbasislinie und 120 Sekunden für Die Zuordnung und Dissoziation verwenden.
Entfernen Sie den hydratisierten Nickel-NTA-Biosensor aus dem PCR-Rohr und befestigen Sie ihn an der Biosensorhalterung an der Maschine, indem Sie den breiten Teil des Biosensors auf die Halterung schieben. Legen Sie ein 0,5 Milliliter schwarzes Mikrozentrifugenrohr in den Rohrhalter der Maschine und Pipette 400 Mikroliter BLI-Puffer hinein. Schließen Sie die Abdeckung der Maschine so, dass die Biosensorspitze in den Puffer im Mikrozentrifugenrohr eingetaucht wird.
Klicken Sie auf Weiter in der Software, um mit der Aufzeichnung der ursprünglichen Baseline zu beginnen. Nachdem der erste Basisschritt die Aufzeichnung abgeschlossen hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine. Bewegen Sie den Schieberegler nach rechts, so dass sich der Fallhalter vor dem schwarzen Pfeil befindet.
Pipette vier Mikroliter eines dialyzierten Zintands mit Tindel auf den Fallhalter und schließen Sie die Abdeckung der Maschine, die automatisch mit der Aufzeichnung des Ladeschritts beginnt. Nachdem der Ladeschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine. Bewegen Sie den Schieberegler nach links, so dass sich der Rohrhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet.
Schließen Sie den Deckel der Maschine und stellen Sie sicher, dass die Biosensorspitze in den BLI-Puffer des Rohres im Rohrhalter eingetaucht ist. Die Maschine und die Software beginnen automatisch mit der Aufzeichnung des Basisschritts. Nachdem der Basisschritt die Aufzeichnung abgeschlossen hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine.
Entfernen Sie den Tropfenhalter und reinigen Sie ihn, indem Sie ein Protein auspfeifen und insgesamt fünfmal mit doppelt entionisiertem Wasser ausspülen. Verwenden Sie ein Tuch, um die Oberfläche des Tropfenhalters nach der letzten Wäsche zu reinigen. Ersetzen Sie den Fallhalter wieder auf die Maschine.
Bewegen Sie den Schieberegler auf der Maschine nach rechts, so dass sich der Fallhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet. Pipette vier Mikroliter eines Dialyzanels analyt auf den Tropfenhalter und schließen Sie die Abdeckung der Maschine, die automatisch die Aufzeichnung der Assoziation Schritt beginnt. Nachdem der Assoziationsschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine.
Bewegen Sie den Schieberegler auf der Maschine nach rechts, so dass sich der Rohrhalter wieder vor dem schwarzen Pfeil befindet, und schließen Sie die Abdeckung der Maschine, die automatisch mit der Aufzeichnung des Dissoziationsschritts beginnt. Nachdem der Dissoziationsschritt die Aufnahme beendet hat, öffnen Sie die Abdeckung der Maschine und entfernen Sie den Fallhalter und den Rohrhalter. Spülen Sie beide mit doppelt entionisiertem Wasser gründlich ab, um jedes Protein wegzuwaschen.
Entfernen Sie den Biosensor und entsorgen Sie ihn sicher. Wiederholen Sie diese Schritte für dasselbe Ligand-Analytpaar mit unterschiedlichen Analytkonzentrationen. Sobald alle Durchläufe abgeschlossen sind, speichern Sie die Daten auf der Software, indem Sie auf Datei und Experiment speichern wie auf der linken Seite des Bildschirms klicken.
Wählen Sie unter der Überschrift Daten ausführen die Option Schrittkorrektur und Eins-zu-Eins aus, und klicken Sie auf Analysieren, um kinetische Daten zu generieren. Um die quantitativen Daten in ein Arbeitsblatt zu extrahieren und Diagramme zu generieren, klicken Sie auf In CSV exportieren und speichern Sie die aufgezeichneten Daten als CSV-Datei. Öffnen Sie die CSV-Datei mit einer Tabellenkalkulationssoftware.
GrgA in voller Länge besteht aus 288 Aminosäuren. Wie hier gezeigt, bindet ein 28 Aminosäure-Mittelbereich Sigma 28 direkt. Hier wurde der mittlere Bereich mit einem Endterminal His-Tag als Liganden verwendet, der zuerst bis zur Spitze eines Nickel-NTA-Biosensors immobilisiert wurde.
Gezeigt werden Aufnahmen von Experimenten mit drei verschiedenen Analytkonzentrationen, die jeweils 30 Sekunden vor der Ligandenbindung beginnen und zwei Minuten nach Beginn der letzten Wäsche enden. Die verbesserte Visualisierung der Liganand-Analytenzuordnung und -dissoziation wird nach dem Entfernen von Werten in den ersten beiden Phasen und dem Zurücksetzen der Basislinie angezeigt. Nach dem Waschen ungebunden und terminal Seine-getaggt GrgA 138 bis 165 aus dem Biosensor, Echtzeit-Assoziation mit dem Analyten wurde nach dem Zusatz von Sigma 28 aufgezeichnet.
Schließlich wurde die Echtzeit-Dissoziation nach dem Waschen aufgezeichnet. Vor BLI-Assays wird Glycerin aus Liganden und Analyten entfernt. Wir empfehlen, dass BLI kurz nach der Dialyse durchgeführt wird, wie im Text beschrieben.
Nach der Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Transkription mit BLI kann man untersuchen, wie sich die Interaktion auf die Transkriptionsinitiierung, Dehnung und Beendigung auswirkt.
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Übersicht
Diese Studie nutzt die Bio-Layer-Interferometrie (BLI), um die Wechselwirkung zwischen GrgA und der chlamydialen RNA-Polymerase zu untersuchen. Die BLI bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen Pull-down-Assays, da sie Echtzeitdaten über Assoziation und Dissoziation sowie eine verbesserte Empfindlichkeit und quantitative Analyse bereitstellt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biologie
- Molekularbiologie
- Regulation der Transkription
Hintergrund
- Protein-Protein-Interaktionen sind entscheidend für Transkriptionsprozesse.
- Herkömmliche Methoden wie Pull-down-Assays weisen Einschränkungen bei der Echtzeitanalyse auf.
- Die Bioschicht-Interferometrie (BLI) ist eine neuere Technologie, die diese Einschränkungen überwindet.
- BLI liefert quantitative kinetische Parameter, die auf die Interaktionsmechanismen hinweisen.
Zweck der Studie
- Charakterisierung der Interaktion von GrgA mit der chlamydialen RNA-Polymerase.
- Aufzeigen der Vorteile der BLI gegenüber traditionellen Methoden.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Dynamik von Transkriptionsfaktor-Interaktionen.
Verwendete Methoden
- Biolayer-Interferometrie (BLI)-Technologie.
- Echtzeitüberwachung von Proteinwechselwirkungen.
- Quantitative Analyse von Assoziations- und Dissoziationsraten.
- Vergleich mit traditionellen Pulldown-Assays.
Hauptergebnisse
- BLI detektierte erfolgreich Echtzeit-Interaktionen zwischen GrgA und RNA-Polymerase.
- Die Ergebnisse zeigten eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu Pulldown-Assays.
- Es wurden quantitative kinetische Parameter generiert, die Einblicke in die Interaktionsmechanismen ermöglichten.
- Die Studie unterstreicht die einfache Erlernbarkeit und Anwendung der BLI-Technologie.
Schlussfolgerungen
- Die BLI ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Transkription.
- Sie liefert Echtzeitdaten und quantitative Einblicke, die bei traditionellen Methoden fehlen.
- Die Ergebnisse stützen den Einsatz der BLI in zukünftigen Transkriptionsstudien.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Bioschicht-Interferometrie (BLI) begegnet einer zentralen Herausforderung in der frühen Entdeckung, indem sie eine Echtzeit-Quantifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen ermöglicht, die für die Zielvalidierung in der Transkriptionsregulation entscheidend sind. Ihre Fähigkeit, Bindungsereignisse nachzuweisen, die mit herkömmlichen Pull-down-Assays übersehen werden, erhöht das Vorhersagevertrauen bei der mechanistischen Entschärfung von Transkriptionsfaktorwegen. Dies unterstützt fundierte Go/No-Go-Entscheidungen bei der Lead-Identifizierung und der Auswahl präklinischer Modelle für antimikrobielle Zielstrukturen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Bestätigung der Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren mit Sigma-Faktoren in pathogenen Bakterien.
- Operationaler Wert: Liefert quantitative kinetische Parameter (Assoziations- und Dissoziationsraten), die Interaktionsmechanismen klären und mechanistische Unschärfen verringern.
- Prädiktiver Wert: Erkennt schwache oder vorübergehende Wechselwirkungen, die bei Endpunktanalysen übersehen werden, und verbessert so die Zuversicht in Zielstrukturen sowie die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten in antimikrobiellen Programmen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt reproduzierbare Echtzeit-Bindungskurven, die für die Standardisierung über verschiedene Substanz-Screening-Kampagnen hinweg geeignet sind.
- Quantitative Ausgabe: Liefert kinetische Konstanten (kon, koff, KD), die eine Rangfolge von Liganden oder Mutanten in der Optimierung von Leitverbindungen ermöglichen.
- Skalierbarkeit: Unterstützt Analysen mit mehreren Konzentrationen unter Verwendung von Regenerationszyklen und ermöglicht so das mittelhochdurchsatzfähige Profiling von Interaktionsnetzwerken.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Beschreibt Wechselwirkungen in Chlamydia, einem obligaten intrazellulären Pathogen, und unterstützt die präklinische Validierung transkriptionsbezogener Virulenzmechanismen.
- Translationale Kontinuität: Verbindet molekulare Interaktionsdaten mit funktionellen Ergebnissen der Genexpression und ermöglicht so die zielgerichtete Validierung im Einklang mit Biomarkern.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem sie Bindungsstärke und -spezifität früh im Entdeckungsprozess quantifiziert.
Pipeline- und Workflow-Integration
BLI ist in den Entdeckungsprozess von der Target-Engagement-Screening bis zur Lead-Optimierung eingebettet und liefert mechanistische Erkenntnisse, die die nachgeschaltete präklinische Validierung von transkriptionsmodulierenden Therapeutika unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Transkriptionsfaktor-Netzwerken, indem sie Echtzeit-Daten zu quantitativen Wechselwirkungen bereitstellt, die für die Aufklärung von Signalwegen unerlässlich sind.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft von Assays durch reproduzierbare, markierungsfreie Detektion biomolekularer Wechselwirkungen mit definierten kinetischen Ausgaben.
- Analytik: Erzeugt Assoziations-/Dissoziations-Sensorgramme und angepasste KD-Werte, die einen objektiven Vergleich von Bindungsbedingungen über verschiedene Analytkonzentrationen hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Interaktionskinetik mit funktioneller transkriptioneller Regulation in krankheitsrelevanten Systemen wie Chlamydia.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine portable, markierungsfreie Plattform dar, die auf verschiedene Zielklassen jenseits der Transkription anwendbar ist und gemeinsam genutzte Service-Labormodelle unterstützt.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem reale Bindungskinetiken in Echtzeit sichtbar gemacht und Interaktionen nachgewiesen werden, die mit Pull-down-Assays nicht detektierbar sind.
- Operativer Wert: Bietet standardisierte, reproduzierbare Arbeitsabläufe mit minimalem Probenverbrauch und ohne Notwendigkeit radioaktiver oder fluoreszierender Markierungen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem falsch-positive Ergebnisse in der frühen Screening-Phase reduziert und datenbasierte Priorisierung von Zielstrukturen mit hoher Vertrauenswürdigkeit ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem quantitative Bindungsdaten bereitgestellt werden, die Struktur-Wirkungs-Beziehungen und die Optimierung von Leitverbindungen informieren.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Proteinaufreinigung, His-Tagging und im Umgang mit Biosensoren, um eine korrekte Ligandenimmobilisierung und Analytenzufuhr sicherzustellen.
- Setzt den Zugang zu einem BLI-Gerät (z. B. Blitz-System) und der dazugehörigen Software für die Echtzeit-Datenaufnahme und kinetische Anpassung voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg hinsichtlich Pufferbedingungen, Dialyseprotokolle und Baseline-Korrekturschritte, um die Vergleichbarkeit der Daten zu gewährleisten.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung auf unterschiedliche Modellsysteme, insbesondere bezüglich der Ligandenstabilität und der Effizienz der Oberflächenregeneration.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit einer optimierten Immobilisierungsdichte, um Transportartefakte zu vermeiden und eine genaue kinetische Modellierung sicherzustellen.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
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Title
0:59
Biosensor Hydration and Assay Set-Up
2:51
Loading of Ligand onto Biosensor and Washing Away Additional Ligand
3:43
Association of Analyte to Ligand and Dissociation of Analyte from Ligand
5:41
Results: A 28 Amino Acid Middle Region of GrgA Binds σ28 In Vitro
6:45
Conclusion
