Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Blut und mononukleäre Zellen auf neuronale Stammzellen umzuprogrammieren, die zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie Parkinson verwendet werden können. Es bietet eine autologe Zellquelle zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen. Auch der Zeitrahmen, der für die Umwandlung in induzierte neuronale Stammzellen und die Differenzierung zu gewünschten Zelltypen erforderlich ist, ist kürzer als bei induzierten pluripotenten Stammzellen.

Induzierte neuronale Stammzellen besitzen eine gute proliferative Kapazität und können vor der Anwendung skaliert werden. Da die iNSCs in verschiedene regionsspezifische Nervenzellen, wie Rückenmarksneuronen oder motorische Neuronen, spezifiziert werden können, kann diese Methode für die Behandlung anderer neurologischer Erkrankungen erweitert werden. Das ganze Verfahren dauert eine lange Zeit, mit allen Schritten im Zusammenhang und kritisch, so visuelle Demonstration gibt eine Vorstellung davon, wie die Zellen aussehen und gibt einige Tipps, um eine erfolgreiche Generierung der gewünschten Zellen zu gewährleisten.

Übertragen Sie zunächst isoliertes peripheres venöses Blut in ein 50-Milliliter-Konusrohr und verdünnen Sie es mit einem gleichen Volumen steriler Dulbecco-PBS. In einem anderen 50-Milliliter konischen Rohr, bereiten 15 Milliliter sterilisierte Dichte Gradient mittel. Neigen Sie das Rohr in einem 45-Grad-Winkel und legen Sie langsam und vorsichtig 30 Milliliter verdünntes peripheres Blut auf das Dichtegradientenmedium.

Zentrifugieren Sie das Rohr bei 800-fachem g 15 Minuten bei Raumtemperatur mit der Zentrifugebremse an der Aus-Position. Die gelbe, obere Plasmaschicht ansaugen und entsorgen. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die weiße, trübe Dünnschicht mit mononukleären Zellen in eine neue 50-Milliliter-Konikonröhre zu übertragen.

Fügen Sie 30 Milliliter D-PBS mit MNCs in die Röhre und Zentrifuge bei 600 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Wegwerfen des Überstandes 45 Milliliter D-PBS hinzufügen und die Zellen wieder aussetzen. Nachdem Sie das Rohr bei 400 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert haben, entsorgen Sie den Überstand.

Setzen Sie die Zellen mit fünf Millilitern D-PBS wieder aus, zählen Sie die lebenden Zellen mit der Trypan-Blau-Ausschlussmethode, legen Sie die für die Erweiterung erforderlichen MNCs beiseite und frieren die verbleibenden Zellen für die zukünftige Verwendung ein. Am Tag minus 14, Samen MNCs mit einer Dichte von zwei bis drei Millionen Zellen pro Milliliter pro Brunnen der Sechs-Well-Platte mit 1,5 Milliliter 37-Grad-Celsius, vorgewärmt MNC Medium. Inkubieren bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für zwei Tage.

Verwenden Sie am Tag minus 11 eine sterilisierte Pipette, um die Zellen mit dem Medium zu sammeln und in ein neues 15-Milliliter-Konusrohr zu übertragen. Zentrifugieren Sie bei 250 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in einem Milliliter vorgewärmtem MNC-Medium wieder auf. Nach dem Zählen der lebensfähigen Zellen mit Trypanblau, samen die MNCs mit einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter in vorgewärmtem MNC-Medium in einer Sechs-Brunnen-Platte.

Inkubieren bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für drei Tage, und Wiederholung samt Zellsammlung, Zentrifugieren und Plattieren in MNC-Medium an Tagen minus acht und minus vier. Sendai Virus in diesem Verfahren ist gefährlich, und alle Verfahren mit Sendai Virus müssen in einem Sicherheitsschrank durchgeführt werden. Und alle Spitzen und Schläuche, die dem Sendai-Virus ausgesetzt sind, sollten vor der Entsorgung mit Ethanol oder Bleichmittel behandelt werden.

Am Tag Null, sammeln Sie die Zellen in MNC Medium und übertragen sie in ein 15-Milliliter konisches Rohr. Nach der Zentrifugierung der Zellen bei 200 mal g für fünf Minuten, aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit einem Milliliter vorgewärmtem MNC-Medium. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und setzen Sie sie dann mit vorgewärmten MNC-Medium auf eine Konzentration von 200.000 Zellen pro Brunnen in 24-Well-Platten aus.

Die Rohre, die aus einem Speicher mit dem Sendai-Virus mit minus 80 Grad Celsius entfernt wurden, in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad für fünf bis zehn Sekunden auftauen lassen und dann bei Raumtemperatur auftauen lassen. Nach dem Auftauen sofort auf Eis legen. Fügen Sie das aufgetaute Sendai-Virus in die Brunnen der 24-Well-Platte mit MNCs bei einer Vielzahl von Infektionen von 10 hinzu.

Um die Befestigung der Zellen zu erleichtern, zentrieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 1.000 mal g und legen Sie danach die Platten bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, in den Inkubator. Übertragen Sie die Zellen am ersten Tag in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr. Um die verbleibenden Zellen weiter zu lösen, spülen Sie die Brunnen mit einem Milliliter MNC-Medium pro Bohrung ab und fügen Sie die Zellen mit Medium in die Röhre ein.

Nach zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 mal g für fünf Minuten, aspirieren Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern frischem vorgewärmtem MNC-Medium und fügen Sie zu einem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzu. Verwenden Sie am zweiten Tag einen Milliliter pro Brunnen von zuvor verdünnten 50 Mikrogramm pro Mikroliter Poly-D-Lysin in D-PBS, um sechs Wellplatten mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur zu beschichten. Poly-D-Lysin von den Sechs-Brunnen-Platten ansaugen und ca. 10 Minuten auf der vertikalen Reinigungsbank trocknen.

Dann einen Milliliter pro Brunnen eines zuvor verdünnten fünf Mikrogramm pro Milliliter Laminin zu den Sechs-Brunnen-Platten hinzufügen, und inkubieren für vier bis sechs Stunden bei 37 Grad Celsius zu beschichten. Waschen Sie die Platten vor Gebrauch mit D-PBS. Am dritten Tag plattieren alle Sendai-Virus-transduzierten MNCs in induzierten neuronalen Stammzellmediumaufen auf den Poly-D-Lysin/Laminin-beschichteten Sechs-Brunnen-Platten.

An den Tagen fünf und sieben, sanft einen Milliliter 37-Grad Celsius, vorgewärmt iNSC Medium zu jedem Brunnen der Sechs-Well-Platten. Ersetzen Sie das Medium vom neunten tag bis zum 28. Tag täglich durch frisches vorgewärmtes iNSC-Medium. Überwachen Sie die Entstehung von iNSC-Kolonien, und in etwa zwei bis drei Wochen pflücken Kolonien mit entsprechender Morphologie mit verbrannten Glaspipetten und übertragen Sie jede Kolonie in einen separaten Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte für die Expansion.

Um einseitige 6-Hyroxydopamin-lsioned Mausmodelle zu etablieren, rasieren Sie den Kopf einer anästhesierten, erwachsenen, männlichen, SCID-beige Maus, und wenden Erythromycin Augensalbe. Legen Sie die Maus auf das stereotaxic Gerät, und fixieren Sie die Maus mit Schneidezähnen. Legen Sie die Ohrmuscheln richtig ein, um den Mauskopf sicher und angemessen zu positionieren.

Sterilisieren Sie den Kopf mit Povidon Jod und Isopropylalkohol, und verwenden Sie dann eine Skalpellklinge, um einen etwa 1,5-Zentimeter-Sagittalschnitt auf der Kopfhaut zu machen, wobei der Schädel freigelegt wird. Stellen Sie die Schneidezähne und Ohrstangen ein, um den Höhenunterschied zwischen Bregma und Lambda auf weniger als 0,1 Millimeter zu reduzieren. Bewegen Sie sich langsam und senken Sie die Spitze der Mikrospritze Nadel in Richtung Bregma, und behandeln Bregma als Nullpunkt.

Bewegen Sie die Spitze in eine Position mit Koordinaten von vorderen 0,5 Millimetern und seitlichen 2,1 Millimetern relativ zu Bregma. Ziehen Sie die Spitze zurück, markieren Sie den Punkt mit einem Markerstift und bohren Sie mit einem elektronischen Bohrer ein kleines Loch in den Schädel. Extrahieren Sie zwei Mikroliter von fünf Mikrogramm pro Milliliter 6-Hyroxydopamin-Lösung in die Mikrospritze.

Bringen Sie die Nadel an den markierten Punkt zurück, und setzen Sie die Nadel auf dorsale/ventrale 3,2 Millimeter ein. Die 6-Hyroxydopamin-Lösung mit einer Rate von einem Mikroliter pro Minute aus der Spritze injizieren, die Injektionsnadel für weitere fünf Minuten an Ort und Stelle lassen und dann langsam einziehen. Nach dem Schließen des Schnittes mit Nähten, Erythromycin Augensalbe wieder auf die Augen anwenden.

Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaxic Apparat, legen Sie es in den Erholungskäfig, und ermöglichen Sie den Zugang zu Nahrung und Wasser, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Nachdem PBMNCs mit SeV infiziert waren, veränderte sich ihre Morphologie und die Zellen erlitten bis zum fünften Tag einen drastischen Tod. INSC Kolonien entstanden am Tag 12.

Nach der Kommissionierung und Übertragung von iNSC-Klonen zur Erweiterung für eine Reihe von Passagen zeigten sie eine gute Morphologie und konnten sich im iNSC-Medium stabil erneuern, entweder in einer Monolayer-Form oder als Kugeln. Nach 24 Tagen der Differenzierung wurden iNSCs als dopaminerge Neuronen identifiziert, da die Mehrheit von ihnen Tyrosinhydroxylase, Gabelstapler A2 und neuronspezifische Beta-Tubulin-Marker der Klasse III exprimierte. Nach der Etablierung von einseitigen 6-Hyroxydopamin-lsioned Parkinson-Krankheit Maus-Modelle, Verhaltensanalyse wurde durchgeführt, um Parkinson-Krankheit Symptome zu schätzen.

Die Mäuse, die eine Zelltransplantation erhalten hatten, zeigten eine signifikante Verbesserung der motorischen Funktion. Das Ausmaß der 6-Hyroxydopamin-induzierten Läsion wurde durch post-mortem immunfluoreszierende Färbung für TH am Striatum, medialem Vorhirnbündel und Substantia nigra pars compacta überprüft. Die TH-positiven Signale wurden stark im Striatum zurückgewonnen, wo Zellen implantiert und auch bei SN leicht zurückgewonnen wurden. Drei Monate nach der Transplantation waren unter den überlebenden Zellen etwa 13,84% TH-positive dopaminerge Neuronen.

Etwa 91,72% der TH-positiven Zellen exprimierten einen verwaisten Kernrezeptor, etwa 86,76% foxA2 und etwa 98,77% wurden mit G-Protein-gekoppeltem rein empfiffizierem Kalium gekennzeichnet. Wenn Sie 30 mils verdünntes peripheres Blut auf das Dichtegradientenmedium legen, tun Sie es bitte langsam und vorsichtig, um die Gradientenschnittstelle nicht zu stören. Es sollte darauf geachtet werden, dass das Sendai-Virus wiederholt auftaut und gefriert, um eine hohe Virusaktivität zu gewährleisten.

Bei der Umprogrammierung peripherer mononukleischer Blutzellen auf induzierte neuronale Stammzellen beobachten Sie bitte jeden Tag genau die Morphologie der Zellen. Außerdem ist 6-Hydroxydopamin licht- und temperaturempfindlich. Achten Sie darauf, die Lösung vor Licht zu schützen, und halten Sie sie vor der Anwendung auf Eis.

Nach diesem Verfahren, Kann man weiterhin die Krankheitsmechanismen mit familiären PD Patienten abgeleitet enpogen Neuronen in der Kultur zu studieren. Man kann auch weiter untersuchen, wie die transplantierten Zellen die beschädigten neuronalen Schaltkreise beeinflussen.