Name: Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Lernen Sie die Reprogrammierung peripherer Blutmononuklearzellen zu induzierten neuronalen Stammzellen und deren Differenzierung zu dopaminergen Neuronen für Parkinson-Studien. Diese Methode bietet eine autologe Zellquelle.

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Die Arbeit wurde durch folgende Stipendien unterstützt: Stem Cell and Translation National Key Project (2016YFA0101403), National Natural Science Foundation of China (81661130160, 81422014, 81561138004), Municipal Beijing Natural Science Foundation (5142005), Beijing Talents Foundation (2017000021223TD03), Support Project of High-Level Teachers in Beijing Municipal Universities in the period of 13th Five-year Plan (CIT & TCD20180333), Beijing Medical System High Level Talent Award (2015-3-063), Beijing Municipal Health Commission Fund (PXM 2018_026283_000002), Beijing One Hundred, Thousand, and Ten Thousand Talents Fund (2018A03), Beijing Municipal Administration of Hospitals Clinical Medicine Development of Special Funding Support (ZYLX201706) Royal Society-Newton Advanced Fellowship (NA150482).

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<li>Bazley, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+of+Human+Primordial+Germ+Cells+into+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Efficient+Generation+of+Genetically+Engineered+Germ+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells.</a> Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).</li>
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<li>Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+urine+iPS+cell+lines+from+patients+with+Attention+Deficit+Hyperactivity+Disorder+%28ADHD%29+using+a+non-integrative+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).</li>
<li>Cho, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+primary+somatic+cells+by+OCT4+and+chemical+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds.</a> Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).</li>
<li>Ono, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+neurogenic+potential+in+floor+plate+cells+along+an+anteroposterior+location%3A+midbrain+dopaminergic+neurons+originate+from+mesencephalic+floor+plate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells.</a> Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).</li>
<li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+functional+floor+plate+tissue+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).</li>
<li>Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rodent+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochirurgica+Supplements%22%5BJournal%5D)">Transgenic rodent models of Parkinson's disease.</a> Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).</li>
<li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopaminergic+neurons+directly+from+mouse+fibroblasts+and+fibroblast-derived+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors.</a> Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).</li>
<li>Prasad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+induced+pluripotent+stem+cell%2C+direct+conversion+by+trans-differentiation%2C+direct+reprogramming+and+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation.</a> Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier präsentierten wir ein Protokoll, das verschiedene Stadien der iNSC-DA-Zelltherapie für PD-Modelle abdeckte. Zu den kritischen Aspekten dieses Protokolls gehören: (1) Isolierung und Erweiterung von PBMNCs und Umprogrammierung von PBMNCs in iNSCs durch SeV-Infektion, (2) Differenzierung von iNSCs zu DA-Neuronen, (3) Etablierung einseitiger 6-OHDA-verleumderter PD-Mausmodelle und Verhaltens- und (4) Zelltransplantation von DA-Vorstufen und Verhaltensbeurteilung.
In diesem Protokoll umfasst d...

Parkinson-Krankheit (PD) ist eine häufige neurodegenerative Erkrankung, verursacht durch Degeneration von dopaminergen (DA) Neuronen an der Substantia nigra pars compacta (SNpc) im ventralen Mesencephalon (VM), mit einer Prävalenz von mehr als 1% in der Bevölkerung über 60 Jahre alt 1 , 2. In den letzten zehn Jahren hat die Zelltherapie, die darauf abzielt, entweder die degenerativen oder geschädigten Zellen zu ersetzen oder die Mikroumgebung um die degenerierenden Neuronen zu nähren, Potenzial bei der Behandlung von PD3gezeigt. Inzwischen hat die Umprogrammierungstechnologie signifikante Fortschritte gemacht4, die eine vielversprechende zelluläre Quelle für die Ersatztherapie bietet. Es hat sich gezeigt, dass sich humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) und embryonale Stammzellen (ESCs) in DA-Neuralzellen differenzieren können, die überleben, reifen und die motorischen Funktionen verbessern könnten, wenn sie in Ratten- und nichtmenschliche Primaten-PD-Modelle eingepfropft werden5 ,6,7,8. iPSCs stellen einen Meilenstein in der zellulären Reprogrammierungstechnologie dar und haben ein großes Potenzial in der Zelltransplantation; Es besteht jedoch nach wie vor Bedenken hinsichtlich des Risikos einer Tumorbildung durch die unvollständig differenzierten Zellen. Eine alternative zelluläre Quelle für die Zelltransplantation sind abstammungsgebundene adulte Stammzellen, die durch direkte Reprogrammierung gewonnen werden, wie z. B. induzierte neuronale Stammzellen (iNSCs), die aus den instabilen Zwischenprodukten abgeleitet werden können, um die Pluripotenz zu umgehen. Stufe9,10,11.
Sowohl iPSCs als auch iNSCs können aus autologen Zellquellen wie Fibroblasten, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNCs) und verschiedenen anderen Zelltypen12,13,14umprogrammiert werden, wodurch die Immunogenität transplantierter Zellen in hohem Maße. Darüber hinaus sind iNSCs im Vergleich zu iPSCs mit einem reduzierten Risiko für Tumorbildung und liniengebundene Plastizität verbunden, die nur in der Lage sind, sich in Neuronen und Glia zu differenzieren11. In den ersten Studien wurden humane oder Maus-iPSCs und iNSCs aus Fibroblasten aus Hautbiopsien gewonnen, was ein invasives Verfahrenist 14,15. In diesem Zusammenhang sind PBMNCs eine ansprechende Starterzellquelle aufgrund des weniger invasiven Probenahmeprozesses und der Leichtigkeit, eine große Anzahl von Zellen innerhalb einer kurzen Expansionszeit zu erhalten16. Erste Reprogrammierungsstudien verwendeten integrative Abgabesysteme, wie z. B. lentivirale oder retrovirale Vektoren, die in vielen Zelltypen effizient und einfach umzusetzen sind17; diese Abgabesysteme können jedoch Mutationen und Reaktivierung endenvon Resttransgenen, die Sicherheitsprobleme für klinische therapeutische Zwecke darstellen12. Sendai-Virus (SeV) ist ein nicht-integratives RNA-Virus mit einem negativ-sinnlichen, einsträngigen Genom, das sich nicht in das Wirtsgenom integriert, sondern sich nur im Zytoplasma infizierter Zellen repliziert und ein effizientes und sicheres Vehikel für die Neuprogrammierung bietet18 ,19. Rekombinante SeV-Vektoren sind verfügbar, die Reprogrammierungsfaktoren wie menschliche OCT3/4, SOX2, KLF4 und c-MYC in ihren offenen Leserahmen enthalten. Darüber hinaus können SeV-Virusvektoren durch die Einführung temperaturempfindlicher Mutationen weiter verbessert werden, so dass sie schnell entfernt werden können, wenn die Kulturtemperatur auf 39 °C20angehoben wird. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zum Umprogrammieren von PBMNCs auf iNSCs mithilfe des SeV-Systems.
Viele Studien haben die Ableitung von DA-Neuronen von menschlichen ESCs oder iPSCs mit verschiedenen Methoden6,8,21berichtet. Es gibt jedoch einen Mangel an Protokollen, die die Differenzierung von DA-Neuronen von iNSCs im Detail beschreiben. In diesem Protokoll beschreiben wir die effiziente Generierung von DA-Neuronen von iNSCs mit einer zweistufigen Methode. Die da neuronalen Vorläufer können zur Sicherheit und Wirksamkeit in das Striatum von PD-Mausmodellen transplantiert werden. Dieser Artikel wird ein detailliertes Protokoll vorstellen, das verschiedene Stadien von der Generierung induzierter neuronaler Stammzellen durch Sendai-Virus, der Differenzierung von iNSCs in DA-Neuronen, der Etablierung von Maus-PD-Modellen bis hin zur Transplantation von DA-Vorläufern in das Striatum abdeckt. der PD-Modelle. Mit diesem Protokoll kann man iNSCs von Patienten und gesunden Spendern generieren und DA-Neuronen ableiten, die sicher, standardisierbar, skalierbar und homogen für Zelltransplantationszwecke sind, oder zur Modellierung von PD in einer Schale und zur Untersuchung der Mechanismen Grunderkrankungsbeginn und -entwicklung.

<table><tbody><tr><td>Konisches 15-ml-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>Giftig für Inhalation und Hautkontakt</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>konisches 50-ml-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>6-OHDA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4381</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td>Reagenz für Zelldissoziation</td></tr><tr><td>Apomorphin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4393</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A92902</td><td>Giftig bei Hautkontakt</td></tr><tr><td>B27 Beilage&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>Neurotropher Faktor aus dem Gehirn</td></tr><tr><td>Blutentnahmeröhrchen mit Natriumheparin</td><td>BD</td><td>367871</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>yisheng</td><td>36106es60</td><td>Fötales Rinderserum</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>Dibutyryladenosin cyclisches Monophosphat</td></tr><tr><td>CellBanker 2</td><td>ZENOAQ</td><td>100ml</td><td>Wird als Gefriermedium für PBMNCs verwendet</td></tr><tr><td>Chemisch definiertes Lipidkonzentrat</td><td>Invitrogen</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Gene Operation</td><td>04-0004</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Fisher</td><td>25*25-2</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320</td><td></td></tr><tr><td>Eselsserum</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Peprotech</td><td>100-64-50UG</td><td>Humanes Erythropoietin</td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>P=1,077, Dichtegradient mittel</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>Gliaabgeleiteter neurotropher Faktor</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td>100 & mal; Glutamin-Stammlösung</td></tr><tr><td>Ham's-F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175079</td><td>Ausgewogene Salzlösung</td></tr><tr><td>Humaner Leukämie-Hemmfaktor</td><td>Millpore</td><td>LIF1010</td><td></td></tr><tr><td>Humane rekombinante SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07-100UG</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>Peprotech</td><td>100-11-100UG</td><td>Humanes insulinähnliches Wachstum Faktor&nbsp;</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10UG</td><td>Humanes Interleukin 3</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>215056-023</td><td>Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>12585014</tr><tr><td>ITS-X</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>Insulin-Transferrin-Selen-X Nahrungsergänzungsmittel</td></tr><tr><td>Knockout Serumersatz</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>Serum freies Basalmedium</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11243217001</tr><tr><td>Mikrospritze</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>N2 Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>Nicht-essentielle Aminosäure</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>Basisches Medium</td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>Poly-D-Lysin</td></tr><tr><td>SAG1</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-426-M01</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Gen Operation</td><td>04-0010-10mg</td><td>Vor Licht lagern bei -20?</td></tr><tr><td>Sendai-Virus</td><td>Life Technologies</td><td>MAN0009378</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>baiaoshengke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;?</td><td>Peprotech</td><td>100-36E</td><td>Transformierender Wachstumsfaktor&nbsp; &beta;?</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>R& D Systems</td><td>2914-HT-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Baiaoshengke</td><td></td><td>Nichtionisches Tensid</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Gibco</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1126</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung induzierter neuronaler stammzellen aus peripheren mononukleären zellen und differenzierung zu dopaminergen neuronenvorstufen für transplantationsstudien

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Die Parkinson-Krankheit (PD) wird durch Degeneration von dopaminergen (DA) Neuronen an der Substantia nigra pars compacta (SNpc) im ventralen Mesencephalon (VM) verursacht. Zellersatztherapie hält große Versprechen für die Behandlung von PD. In letzter Zeit haben sich induzierte neuronale Stammzellen (iNSCs) als potenzieller Kandidat für die Zellersatztherapie aufgrund des reduzierten Risikos der Tumorbildung und der Plastizität, die zu regionsspezifische Neuronen und Glia. iNSCs können aus autologen somatischen Zellquellen wie Fibroblasten, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMNCs) und verschiedenen anderen Zelltypen umprogrammiert werden. Im Vergleich zu anderen Arten von somatischen Zellen sind PBMNCs ein attraktiver Starterzellentyp, da der Zugriff auf die Kultur erleichtert und erweitert wird. Sendai Virus (SeV), ein nichtintegratives RNA-Virus, das Reprogramming-Faktoren wie humanoct3/4, SOX2, KLF4 und c-MYC kodiert, hat ein negativ-sinnliches, einsträngiges, nicht segmentiertes Genom, das sich nicht in Wirtsgenom, sondern nur im Zytoplasma infizierter Zellen repliziert, bietet ein effizientes und sicheres Vehikel für die Neuprogrammierung. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll, in dem iNSCs durch Neuprogrammierung von PBMNCs erhalten und durch eine zweistufige Methode in spezialisierte VM-DA-Neuronen differenziert werden. Dann werden DA-Vorläufer in einseitig 6-Hyroxydopamin (6-OHDA)-lsioned PD-Mausmodelle transplantiert, um die Sicherheit und Wirksamkeit für die Behandlung von PD zu bewerten. Diese Methode bietet eine Plattform, um die Funktionen und therapeutischen Wirkungen patientenspezifischer DA-Neuralzellen in vitro und in vivo zu untersuchen.

Hier berichten wir über ein Protokoll, das verschiedene Stadien der iNSC-DA-Zelltherapie zur Behandlung von PD-Modellen abdeckt. Erstens wurden PBMNCs isoliert und erweitert und durch SeV-Infektion in iNSCs umprogrammiert. Eine schematische Darstellung der Prozeduren mit PBMNC-Erweiterung und iNSC-Induktion ist in Abbildung 1dargestellt. Am Tag -14 wurden PBMNCs mit einem Dichtegradientenmedium (Materialtabelle )isoliert. Vor der Zentrifugation wurden mit PBS und dem Dichteg...

Das Protokoll stellt die Reprogrammierung von peripheren mononukleären Blutzellen vor, um neuronale Stammzellen durch Sendai-Virusinfektion zu induzieren, Differenzierung von iNSCs in dopaminerge Neuronen, Transplantation von DA-Vorstufen in die einseitig Parkinson-Mausmodelle und Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von iNSC-abgeleiteten DA-Vorstufen für die PD-Behandlung.

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Blut und mononukleäre Zellen auf neuronale Stammzellen umzuprogrammieren, die zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie Parkinson verwendet werden können. Es bietet eine autologe Zellquelle zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen. Auch der Zeitrahmen, der für die Umwandlung in induzierte neuronale Stammzellen und die Differenzierung zu gewünschten Zelltypen erforderlich ist, ist kürzer als bei induzierten pluripotenten Stammzellen.Induzierte neuronale Stammzellen besitzen eine gute proliferative Kapazität und können vor der Anwendung skaliert werden. Da die iNSCs in verschiedene regionsspezifische Nervenzellen, wie Rückenmarksneuronen oder motorische Neuronen, spezifiziert werden können, kann diese Methode für die Behandlung anderer neurologischer Erkrankungen erweitert werden. Das ganze Verfahren dauert eine lange Zeit, mit allen Schritten im Zusammenhang und kritisch, so visuelle Demonstration gibt eine Vorstellung davon, wie die Zellen aussehen und gibt einige Tipps, um eine erfolgreiche Generierung der gewünschten Zellen zu gewährleisten.Übertragen Sie zunächst isoliertes peripheres venöses Blut in ein 50-Milliliter-Konusrohr und verdünnen Sie es mit einem gleichen Volumen steriler Dulbecco-PBS. In einem anderen 50-Milliliter konischen Rohr, bereiten 15 Milliliter sterilisierte Dichte Gradient mittel. Neigen Sie das Rohr in einem 45-Grad-Winkel und legen Sie langsam und vorsichtig 30 Milliliter verdünntes peripheres Blut auf das Dichtegradientenmedium.Zentrifugieren Sie das Rohr bei 800-fachem g 15 Minuten bei Raumtemperatur mit der Zentrifugebremse an der Aus-Position. Die gelbe, obere Plasmaschicht ansaugen und entsorgen. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die weiße, trübe Dünnschicht mit mononukleären Zellen in eine neue 50-Milliliter-Konikonröhre zu übertragen.Fügen Sie 30 Milliliter D-PBS mit MNCs in die Röhre und Zentrifuge bei 600 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Wegwerfen des Überstandes 45 Milliliter D-PBS hinzufügen und die Zellen wieder aussetzen. Nachdem Sie das Rohr bei 400 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert haben, entsorgen Sie den Überstand.Setzen Sie die Zellen mit fünf Millilitern D-PBS wieder aus, zählen Sie die lebenden Zellen mit der Trypan-Blau-Ausschlussmethode, legen Sie die für die Erweiterung erforderlichen MNCs beiseite und frieren die verbleibenden Zellen für die zukünftige Verwendung ein. Am Tag minus 14, Samen MNCs mit einer Dichte von zwei bis drei Millionen Zellen pro Milliliter pro Brunnen der Sechs-Well-Platte mit 1,5 Milliliter 37-Grad-Celsius, vorgewärmt MNC Medium. Inkubieren bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für zwei Tage.Verwenden Sie am Tag minus 11 eine sterilisierte Pipette, um die Zellen mit dem Medium zu sammeln und in ein neues 15-Milliliter-Konusrohr zu übertragen. Zentrifugieren Sie bei 250 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in einem Milliliter vorgewärmtem MNC-Medium wieder auf. Nach dem Zählen der lebensfähigen Zellen mit Trypanblau, samen die MNCs mit einer Dichte von einer Million Zellen pro Milliliter in vorgewärmtem MNC-Medium in einer Sechs-Brunnen-Platte.Inkubieren bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid für drei Tage, und Wiederholung samt Zellsammlung, Zentrifugieren und Plattieren in MNC-Medium an Tagen minus acht und minus vier. Sendai Virus in diesem Verfahren ist gefährlich, und alle Verfahren mit Sendai Virus müssen in einem Sicherheitsschrank durchgeführt werden. Und alle Spitzen und Schläuche, die dem Sendai-Virus ausgesetzt sind, sollten vor der Entsorgung mit Ethanol oder Bleichmittel behandelt werden.Am Tag Null, sammeln Sie die Zellen in MNC Medium und übertragen sie in ein 15-Milliliter konisches Rohr. Nach der Zentrifugierung der Zellen bei 200 mal g für fünf Minuten, aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit einem Milliliter vorgewärmtem MNC-Medium. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und setzen Sie sie dann mit vorgewärmten MNC-Medium auf eine Konzentration von 200.000 Zellen pro Brunnen in 24-Well-Platten aus.Die Rohre, die aus einem Speicher mit dem Sendai-Virus mit minus 80 Grad Celsius entfernt wurden, in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad für fünf bis zehn Sekunden auftauen lassen und dann bei Raumtemperatur auftauen lassen. Nach dem Auftauen sofort auf Eis legen. Fügen Sie das aufgetaute Sendai-Virus in die Brunnen der 24-Well-Platte mit MNCs bei einer Vielzahl von Infektionen von 10 hinzu.Um die Befestigung der Zellen zu erleichtern, zentrieren Sie die Platten 30 Minuten lang bei 1.000 mal g und legen Sie danach die Platten bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, in den Inkubator. Übertragen Sie die Zellen am ersten Tag in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr. Um die verbleibenden Zellen weiter zu lösen, spülen Sie die Brunnen mit einem Milliliter MNC-Medium pro Bohrung ab und fügen Sie die Zellen mit Medium in die Röhre ein.Nach zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 mal g für fünf Minuten, aspirieren Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern frischem vorgewärmtem MNC-Medium und fügen Sie zu einem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzu. Verwenden Sie am zweiten Tag einen Milliliter pro Brunnen von zuvor verdünnten 50 Mikrogramm pro Mikroliter Poly-D-Lysin in D-PBS, um sechs Wellplatten mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur zu beschichten. Poly-D-Lysin von den Sechs-Brunnen-Platten ansaugen und ca. 10 Minuten auf der vertikalen Reinigungsbank trocknen.Dann einen Milliliter pro Brunnen eines zuvor verdünnten fünf Mikrogramm pro Milliliter Laminin zu den Sechs-Brunnen-Platten hinzufügen, und inkubieren für vier bis sechs Stunden bei 37 Grad Celsius zu beschichten. Waschen Sie die Platten vor Gebrauch mit D-PBS. Am dritten Tag plattieren alle Sendai-Virus-transduzierten MNCs in induzierten neuronalen Stammzellmediumaufen auf den Poly-D-Lysin/Laminin-beschichteten Sechs-Brunnen-Platten.An den Tagen fünf und sieben, sanft einen Milliliter 37-Grad Celsius, vorgewärmt iNSC Medium zu jedem Brunnen der Sechs-Well-Platten. Ersetzen Sie das Medium vom neunten tag bis zum 28. Tag täglich durch frisches vorgewärmtes iNSC-Medium. Überwachen Sie die Entstehung von iNSC-Kolonien, und in etwa zwei bis drei Wochen pflücken Kolonien mit entsprechender Morphologie mit verbrannten Glaspipetten und übertragen Sie jede Kolonie in einen separaten Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte für die Expansion.Um einseitige 6-Hyroxydopamin-lsioned Mausmodelle zu etablieren, rasieren Sie den Kopf einer anästhesierten, erwachsenen, männlichen, SCID-beige Maus, und wenden Erythromycin Augensalbe. Legen Sie die Maus auf das stereotaxic Gerät, und fixieren Sie die Maus mit Schneidezähnen. Legen Sie die Ohrmuscheln richtig ein, um den Mauskopf sicher und angemessen zu positionieren.Sterilisieren Sie den Kopf mit Povidon Jod und Isopropylalkohol, und verwenden Sie dann eine Skalpellklinge, um einen etwa 1,5-Zentimeter-Sagittalschnitt auf der Kopfhaut zu machen, wobei der Schädel freigelegt wird. Stellen Sie die Schneidezähne und Ohrstangen ein, um den Höhenunterschied zwischen Bregma und Lambda auf weniger als 0,1 Millimeter zu reduzieren. Bewegen Sie sich langsam und senken Sie die Spitze der Mikrospritze Nadel in Richtung Bregma, und behandeln Bregma als Nullpunkt.Bewegen Sie die Spitze in eine Position mit Koordinaten von vorderen 0,5 Millimetern und seitlichen 2,1 Millimetern relativ zu Bregma. Ziehen Sie die Spitze zurück, markieren Sie den Punkt mit einem Markerstift und bohren Sie mit einem elektronischen Bohrer ein kleines Loch in den Schädel. Extrahieren Sie zwei Mikroliter von fünf Mikrogramm pro Milliliter 6-Hyroxydopamin-Lösung in die Mikrospritze.Bringen Sie die Nadel an den markierten Punkt zurück, und setzen Sie die Nadel auf dorsale/ventrale 3,2 Millimeter ein. Die 6-Hyroxydopamin-Lösung mit einer Rate von einem Mikroliter pro Minute aus der Spritze injizieren, die Injektionsnadel für weitere fünf Minuten an Ort und Stelle lassen und dann langsam einziehen. Nach dem Schließen des Schnittes mit Nähten, Erythromycin Augensalbe wieder auf die Augen anwenden.Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaxic Apparat, legen Sie es in den Erholungskäfig, und ermöglichen Sie den Zugang zu Nahrung und Wasser, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Nachdem PBMNCs mit SeV infiziert waren, veränderte sich ihre Morphologie und die Zellen erlitten bis zum fünften Tag einen drastischen Tod. INSC Kolonien entstanden am Tag 12.Nach der Kommissionierung und Übertragung von iNSC-Klonen zur Erweiterung für eine Reihe von Passagen zeigten sie eine gute Morphologie und konnten sich im iNSC-Medium stabil erneuern, entweder in einer Monolayer-Form oder als Kugeln. Nach 24 Tagen der Differenzierung wurden iNSCs als dopaminerge Neuronen identifiziert, da die Mehrheit von ihnen Tyrosinhydroxylase, Gabelstapler A2 und neuronspezifische Beta-Tubulin-Marker der Klasse III exprimierte. Nach der Etablierung von einseitigen 6-Hyroxydopamin-lsioned Parkinson-Krankheit Maus-Modelle, Verhaltensanalyse wurde durchgeführt, um Parkinson-Krankheit Symptome zu schätzen.Die Mäuse, die eine Zelltransplantation erhalten hatten, zeigten eine signifikante Verbesserung der motorischen Funktion. Das Ausmaß der 6-Hyroxydopamin-induzierten Läsion wurde durch post-mortem immunfluoreszierende Färbung für TH am Striatum, medialem Vorhirnbündel und Substantia nigra pars compacta überprüft. Die TH-positiven Signale wurden stark im Striatum zurückgewonnen, wo Zellen implantiert und auch bei SN leicht zurückgewonnen wurden. Drei Monate nach der Transplantation waren unter den überlebenden Zellen etwa 13,84% TH-positive dopaminerge Neuronen.Etwa 91,72% der TH-positiven Zellen exprimierten einen verwaisten Kernrezeptor, etwa 86,76% foxA2 und etwa 98,77% wurden mit G-Protein-gekoppeltem rein empfiffizierem Kalium gekennzeichnet. Wenn Sie 30 mils verdünntes peripheres Blut auf das Dichtegradientenmedium legen, tun Sie es bitte langsam und vorsichtig, um die Gradientenschnittstelle nicht zu stören. Es sollte darauf geachtet werden, dass das Sendai-Virus wiederholt auftaut und gefriert, um eine hohe Virusaktivität zu gewährleisten.Bei der Umprogrammierung peripherer mononukleischer Blutzellen auf induzierte neuronale Stammzellen beobachten Sie bitte jeden Tag genau die Morphologie der Zellen. Außerdem ist 6-Hydroxydopamin licht- und temperaturempfindlich. Achten Sie darauf, die Lösung vor Licht zu schützen, und halten Sie sie vor der Anwendung auf Eis.Nach diesem Verfahren, Kann man weiterhin die Krankheitsmechanismen mit familiären PD Patienten abgeleitet enpogen Neuronen in der Kultur zu studieren. Man kann auch weiter untersuchen, wie die transplantierten Zellen die beschädigten neuronalen Schaltkreise beeinflussen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Dieses Video zeigt die Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs) in induzierte neurale Stammzellen (iNSCs) unter Verwendung des Sendai-Virus. Das Sendai-Virus ist ein nicht-integrierendes Virus, das ein effizientes und sicheres Vehikel für die Reprogrammierung von Zellen bietet.

Generierung von induzierten neuralen Stammzellen (iNSCs) aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs): Ein auf dem Sendai-Virus basierendes Verfahren zur Umprogrammierung von PBMNCs in iNSCs

Dieses Video zeigt die direkte Reprogrammierung von genetisch veränderten hämatopoetischen Vorläuferzellen in neuronale Stammzellen. Transkriptionsfaktoren, die von hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert werden, lösen eine Kaskade von molekularen Ereignissen aus, die ihre Umwandlung erleichtern. Weitere spezifische Medien werden verwendet, um induzierte neuronale Stammzellen zu selektieren und zu züchten.

Direkte Reprogrammierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen in neurale Stammzellen

Dieses Video zeigt die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) in dopaminerge Neuronen, um ein Modell für die Untersuchung der Parkinson-Krankheit bereitzustellen. Die hES-Zellen werden in einem neuronalen Induktionsmedium in einer Mikrotiterplatte kultiviert, um 3D-Neurosphären zu bilden. Diese werden dann in einem neuronalen Induktionsmedium kultiviert, um die Differenzierung in dopaminerge Vorläuferneuronen zu fördern. Die endgültige Reifung der Neuronen erfolgt in einem...

Erzeugung dopaminerger neuronaler Organoide aus humanen embryonalen Stammzellen

Wir, basierend auf Erkenntnissen aus der Entwicklungsbiologie und veröffentlichten Forschungsergebnissen, haben ein optimiertes Protokoll entwickelt, um effizient A9-Mittelhirn-dopaminerge Neuronen sowohl aus menschlichen embryonalen Stammzellen als auch aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, was für die Krankheitsmodellierung und Zellersatztherapie bei der Parkinson-Krankheit nützlich wäre.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Marrow Stromazellen (MSCs) mit neuronalen Potenzial gibt es im Knochenmark. Unser Protokoll bereichert diese Population von Zellen durch hypoxische Vorkonditionierung und leitet sie dann zu reifen Schwann-Zellen.

Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

Wir stellen eine gentechnisch veränderte (GV-freie) Methode vor, um Zellen mit einem neuronalen Phänotyp aus reprogrammierten peripheren Blutzellen zu gewinnen. Die Aktivierung eines Signalwegs, der mit einem neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Protein verbunden ist, zeigt eine effiziente GENV-freie Methode zur Gewinnung menschlicher pluripotenter Stammzellen.

GEN-freie Erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen Zellen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Entwicklung chemisch umprogrammierter Stammzellen, um eine präzise neuronale Modulation zu erreichen, indem diese Zellen in dopaminerge Vorläuferzellen differenziert, in Mausmodelle der Parkinson-Krankheit transplantiert und verhaltensbezogene und elektrophysiologische Ergebnisse ausgewertet werden, um die erfolgreiche Integration und funktionelle Wirksamkeit der transplantierten Zellen zu bestätigen.

Chemogenetische Regulation in reprogrammierten Stammzell-abgeleiteten Vorläuferzellen bei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen

Lernen Sie die Reprogrammierung peripherer Blutmononuklearzellen zu induzierten neuronalen Stammzellen und deren Differenzierung zu dopaminergen Neuronen für Parkinson-Studien. Diese Methode bietet eine autologe Zellquelle.

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien (Video) | JoVE Journal

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

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