Weitfeld-Einzelphotonen optische Aufnahme in Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff
20. Juni 2019
Wir führen eine reproduzierbare und stabile optische Aufzeichnungsmethode für Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff ein. Der Artikel beschreibt spannungsempfindliche Farbstofffärbung und Aufzeichnung optischer Signale mit herkömmlichen Hippocampus-Scheibenpräparaten.
Die optische Aufnahmemethode mit spannungsempfindlichem Farbstoff gilt als ideale Technologie, um die Funktionsweise des Gehirns zu visualisieren. Diese Methode ermöglichte es uns, eine neuropsychische Dynamik stabil und zuverlässig über 12 Stunden aufzuzeichnen, da wir einen Blick auf die psychische Aktivität erhielten. Wir versuchen, die Anwendung zu erweitern, um Schaltungsänderungen zu erkennen, die durch Chemikalien auf der gesamten Entwicklungsstufe verursacht werden, wie z. B. wertvolle Säureanwendung bei Müttern.
Die Technik ist bereits etabliert. Bitte versuchen Sie, Studien zu reproduzieren, indem Sie die hier vorgestellte Methode befolgen. Um dieses Verfahren zu beginnen, tauchen Sie den enthaupteten Kopf in eiskalte ACSF in einem chirurgischen Tablett aus Edelstahl ein.
Extrahieren Sie das Gehirn innerhalb einer Minute und legen Sie es in einem Becher mit gekühltem ACSF für fünf Minuten. Als nächstes teilen Sie den Gehirnabschnitt an der Mittellinie mit einem Skalpell und legen Sie beide Hemisphären auf einen 4%Agar-Block. Legen Sie dann den Hirnblock mit beiden Hemisphären auf einen 4%Agar-Block.
Wischen Sie den überschüssigen ACSF mit einem Filterpapier aus dem Block. Anschließend Superkleber auf die Vibratome-Plattform auftragen. Legen Sie den Agarblock darauf und wischen Sie den übermäßigen Klebstoff mit einem Filterpapier ab.
Tragen Sie vorsichtig eine kleine Menge eiskalten ACSF von der Oberseite des Gehirnagarblocks auf, um überschüssigen Superkleber zu festigen und zu verhindern, dass der Kleber das Gehirn bedeckt und das Schneiden stört. Befestigen Sie anschließend die Plattform am Vibramtablett und gießen Sie den modifizierten ACSF. Stellen Sie das Vibratom auf eine langsame Geschwindigkeit ein und haben Sie die Klingenfrequenz bei ihrer maximalen Einstellung.
Dann beginnen Sie zu schneiden. Legen Sie die Scheiben in der Ecke der Scheibenkammer nacheinander, damit die Reihenfolge der Scheiben leicht unterschieden werden kann. Normalerweise können drei bis fünf Scheiben aus einer Hemisphäre gewonnen werden.
Als nächstes schneiden Sie den Hirnstammteil mit einer 30-Meter-Nadel ab. Mit einem kleinen gekippten Pinsel die Scheibe auf den Membranfilter legen, der mit einem Plexiglasring gehalten wird. Legen Sie den Ring in eine feuchte Rückgewinnungskammer und sichern Sie die Abdeckung, um den Innendruck hoch zu halten.
Wenn Sie die Scheibe auf den Membranfilter legen, passen Sie die Richtung und Position der Scheibe innerhalb des Rings an, um sicherzustellen, dass sie gut zentriert ist und eine konsistente Richtung hat. Lassen Sie die Probe bei 28 Grad Celsius für 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur für mindestens 10 bis 30 Minuten für die Erholung. Um die Scheiben zu färben, tragen Sie 100 Mikroliter der Färbelösung vorsichtig auf jede Scheibe auf und brüten bei 20 Minuten bei Raumtemperatur.
Als nächstes bereiten Sie 50 bis 100 Milliliter ACSF in einem Behälter vor. Legen Sie den Ring mit der Probe darin, um die Färbelösung zu spülen. Dann übertragen Sie die vorgespülten Scheiben in eine andere Inkubationskammer.
Warten Sie mehr als eine Stunde auf die Wiederherstellung vor dem Experiment. Um mit diesem Vorgang zu beginnen, schalten Sie den Verstärker, den Computer und das Kamerasystem ein, und öffnen Sie die Software. ACSF in ein 50-Milliliter-Rohr gießen und mit Carbogen blasen.
Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, um den ACSF zu zirkulieren und den Durchfluss auf etwa einen Milliliter pro Minute einzustellen. Passen Sie dann die Höhe der Saugpipette so an, dass der Flüssigkeitsstand in der Experimentierkammer immer konstant ist. Legen Sie die Masseelektrode in die Kammer.
Anschließend die Glaselektrode mit einer kleinen Menge ACSF füllen und in den Elektrodenhalter legen. Befestigen Sie den Halter an der Stange des Manipulators. Achten Sie mit einem Verstärker darauf, dass der Elektrodenwiderstand etwa ein Megaohm beträgt.
Übertragen Sie in der Aufnahmesitzung eine Scheibe aus der feuchten Kammer in eine Versuchskammer. Drücken Sie die Kante des Rings fest in den Silikon-O-Ring. Achten Sie darauf, die Membran oder den Boden der Experimentierkammer nicht zu brechen.
Unter dem Mikroskop legen Sie die Spitze der stimulierenden Elektrode und die Feldpotential-Aufnahmeelektrode auf die Scheibe. Überprüfen Sie die evozierte Antwort, indem Sie einen Stimulus bereitstellen. Vergewissern Sie sich, dass das Sichtfeld den richtigen neuronalen Schaltkreis im optischen Aufzeichnungssystem abdeckt.
Passen Sie als Nächstes die Anregungslichtintensität auf ca. 70 bis 80 % der maximalen Kapazität an der Kamera an. Passen Sie mit der Fluoreszenzlichtquelle den Fokus mit dem Erfassungssystem an. Starten Sie dann die Aufzeichnung und analysieren Sie die Daten in einer Bildaufnahmesoftware nach der Erfassung.
Diese Abbildung zeigt das repräsentative optische Signal bei elektrischer Stimulation des Schaffer-Collaterols im Bereich CA1 einer Maus-Hippocampusscheibe. Diese aufeinanderfolgenden Bilder zeigen das optische Signal, bevor räumliche und zeitliche Filter angewendet wurden, während diese Bilder die gleichen Daten zeigen, nachdem sie zweimal einen fünf mal fünf kubischen Filter angewendet haben. Aufgrund der hohen Bildrate und der hohen räumlichen Auflösung änderte die Anwendung des Filters das Signal nicht, sondern filterte das Rauschen heraus, das auch im in Pixel aufgezeichneten Zeitverlauf in einer einzigen Versuchsstudie beobachtet werden kann.
Hier ist der Vergleich der typischen Antworten im Bereich CA1 der Hippocampus-Scheiben zwischen Maus und Ratte. Die kleine hyperpolarisierende Reaktion wird in der distalen Seite des CA1 nach 24 Millisekunden in der Maus Hippocampus-Scheibe beobachtet, aber massivere hyperpolarisierende Reaktion überholt die depolarisierende Reaktion in der Ratte Hippocampal-Scheibe. Sobald die Scheiben gefärbt sind, sollten sie über 12 Stunden dauern und Sie können andere elektrophysiologische Aufnahmen auf ihnen durchführen.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine stabile optische Aufnahmemethode unter Verwendung von spannungsensitivem Farbstoff für Gehirnschnitte vor, mit Fokus auf die Signalübertragung hippocampaler Neuronen. Die Technik ermöglicht eine zuverlässige Beobachtung neuropsychischer Dynamiken über längere Zeiträume und erleichtert Untersuchungen von Schaltkreisveränderungen infolge chemischer Applikationen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- Optische Bildgebung
Hintergrund
- Spannungsempfindliche Farbstoffe sind entscheidend für die Visualisierung von Gehirnaktivitäten.
- Konventionelle Schnittpräparationen des Hippocampus dienen als biologisches Modell.
- Die Studie untersucht neuropsychische Dynamiken und Schaltkreisveränderungen.
- Frühere Methoden wiesen über längere Aufzeichnungszeiträume hinweg an Zuverlässigkeit Mängel auf.
Zweck der Studie
- Eine reproduzierbare Methode für optische Ableitungen in Gehirnschnitten vorstellen.
- Einblicke in die Wirkung von Chemikalien auf die Dynamik neuronaler Schaltkreise liefern.
- Langzeitbeobachtungen neuronaler Aktivität und Reaktionen ermöglichen.
Verwendete Methoden
- Die verwendete Plattform sind ex vivo Gehirnschnitte, die aus dem Hippocampus von Mäusen präpariert wurden.
- Das zentrale Modell umfasst Hippocampusschnitte und ermöglicht Untersuchungen zur elektrischen Aktivität.
- Es werden keine Multiomics-Workflows erwähnt; der Fokus liegt auf optischen und elektrophysiologischen Techniken.
- Die Präparation umfasst sorgfältige Schritte wie das Kühlen, Färben und Inkubieren der Schnitte.
- Die Ableitsitzungen werden in einer Versuchskammer unter genau definierten Aufbauanforderungen durchgeführt.
Hauptergebnisse
- Die optische Methode ermöglicht eine zuverlässige Datensammlung über einen Zeitraum von 12 Stunden.
- Der Vergleich der Reaktionen zwischen hippocampalen Schnitten von Maus und Ratte zeigt unterschiedliche neurophysiologische Profile.
- Elektrophysiologische Veränderungen, wie hyperpolarisierende Antworten, werden durch optische Aufzeichnungen gestützt.
- Die Technik vertieft das Verständnis der Dynamik neuronaler Schaltkreise unter verschiedenen Bedingungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode stellt einen bedeutenden Fortschritt bei der Untersuchung von Gehirnschaltkreisen und neuropsychischen Phänomenen dar.
- Sie ermöglicht es Forschenden, zeitgleiche Veränderungen in der neuronalen Signalübertragung zu beobachten.
- Das Verständnis dieser Mechanismen könnte Einblicke in die Plastizität und mögliche therapeutische Anwendungen liefern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mittels der Weitfeld-Einzelphotonen-Bildgebung mit spannungsempfindlichen Farbstoffen ist eine stabile, langfristige funktionelle Untersuchung neuronaler Schaltkreise in Gehirnschnitten möglich, wodurch eine zentrale Herausforderung bei der Zielvalidierung in der Neurowissenschaft adressiert wird. Die Methode ermöglicht eine mechanistische Risikominimierung, indem sie quantitative, hochauflösende optische Signale der neuronalen Aktivität über längere Zeiträume liefert, was für die Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Dynamik neuronaler Schaltkreise im präklinischen Screening entscheidend ist.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung der dynamischen neuronale Signalübertragung in Echtzeit in hippocampalen Schaltkreisen.
- Operativer Wert: Bietet stabile und reproduzierbare Ableitungen über mehr als 12 Stunden, was die longitudinale Beurteilung der Zielinteraktion und der Modulation von Signalwegen unterstützt.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Detektion von Schaltkreisveränderungen, die durch chemische Applikationen hervorgerufen werden, und hilft so bei der frühen Identifizierung der Wirkungen neuroaktiver Verbindungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erreicht eine Bildrate von 10 kHz und eine Auflösung von 100×100 Pixel, wodurch eine hochdurchsatzfähige zeitliche und räumliche Analyse neuronaler Antworten ermöglicht wird.
- Signalgüte: Die nachträgliche Filterung der Aufzeichnung verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht die zuverlässige Detektion subthresholder Schaltungsänderungen, die für die Empfindlichkeit des Assays entscheidend sind.
- Reproduzierbarkeit: Stabile Protokolle zur Schnittführung und Färbung minimieren mechanische Artefakte und gewährleisten konsistente Daten über Wiederholungen und experimentelle Durchgänge hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Unterstützt die Bewertung von Schaltkreisveränderungen in hippocampalen Netzwerken, einer Region, die bei kognitiven und neuropsychiatrischen Erkrankungen eine Rolle spielt.
- Translative Kontinuität: Ermöglicht parallele optische und elektrophysiologische Ableitungen und stärkt dadurch die Validierung funktioneller Ergebnisse über verschiedene Messmodalitäten hinweg.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterschiedliche Ansprechprofile zwischen Maus- und Rattenschnitten liefern Hinweise zur Übertragung zwischen Spezies und helfen, die präklinische Kandidatenauswahl risikoärmer zu gestalten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie funktionelle Schaltkreis-Auslesungen bereitstellt, die eine Brücke zwischen der Zielvalidierung und der Identifizierung von Leitverbindungen schlagen, insbesondere für neuroaktive Verbindungen, die eine phänotypische Bewertung auf Schaltkreisebene erfordern.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung neuropsychischer Dynamiken und die Aufklärung von Wegen durch direkte Visualisierung evozierter optischer Signale in definierten neuronalen Schaltkreisen.
- Screening: Liefert quantitative, hochauflösende optische Daten, die für die automatisierte Analyse und den Vergleich von durch Verbindungen hervorgerufenen Veränderungen der neuronalen Aktivität geeignet sind.
- Analytik: Ermöglicht den Einsatz räumlich-zeitlicher Filter zur Signalextraktion aus dem Rauschen und erleichtert so die objektive Quantifizierung von Schaltkreisantworten sowie die Bewertung der Variabilität.
- Translationale Forschung: Verbindet Beobachtungen von Schaltkreisen aus der Entdeckungsphase mit der präklinischen Validierung, indem wiederholte Aufzeichnungen über längere Zeiträume hinweg ermöglicht werden, um Stabilität und Reproduzierbarkeit von Wirkstoffeffekten zu bewerten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Standardisierte Schnittpräparation und Imaging-Plattform unterstützen die Wiederverwendung über mehrere Projekte und Wirkstoffserien hinweg und verringern so die methodische Variabilität in neurowissenschaftlichen Screening-Kaskaden.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert Einblicke in die funktionellen Mechanismen neuronaler Schaltkreise, verringert die Uneindeutigkeit bei der Zielvalidierung und stärkt das Vorhersagevertrauen in der neuropharmakologischen Bildschirmung.
- Operativer Wert: Erhält die physiologischen Bedingungen aufrecht und verhindert Schichtbewegungen, wodurch eine stabile, artefaktfreie Datenaufnahme für zuverlässige Wirkstofftests gewährleistet ist.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem frühzeitige Erkennung von Nebenwirkungen oder unerwünschten Effekten auf Schaltkreisebene ermöglicht wird und somit das Risiko spätzeitiger Fehlschläge in der ZNS-Wirkstoffentwicklung reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf funktionellen Schaltkreisprofilen und steigert so die Kapitalwirtschaftlichkeit in präklinischen Entwicklungsstufen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Elektrophysiologie, optischer Bildgebung und Gewebehandhabung, um die Lebensfähigkeit der Schnitte und die Färbungseffizienz sicherzustellen.
- Abhängig von Hochgeschwindigkeitskamerasystemen, fluoreszierenden Lichtquellen und Perfusionsaufbauten, die in der Lage sind, physiologische Bedingungen über längere Aufzeichnungszeiten aufrechtzuerhalten.
- Setzt eine Standardisierung der Schnittrichtung, der Färbungsdauer und der Erholungsprotokolle zwischen den Arbeitsgruppen voraus, um die Variabilität des optischen Signalgrundwerts und der Reaktionsfähigkeit zu minimieren.
- Die Anpassung an andere Hirnregionen oder Krankheitsmodelle kann eine Validierung der Färbungseffizienz und der zirkuitspezifischen Signalexpression erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die sorgfältige Optimierung der Exzitationslichtintensität, um Phototoxizität zu vermeiden und gleichzeitig eine ausreichende Signalamplitude für die Detektion aufrechtzuerhalten.
