Name: Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Erfahren Sie die Erstellung physiologischer 3D-Sphäroide aus Patientenproben für das Screening antineoplastischer Wirkstoffe. Diese Methode ermöglicht die gezielte Ansprache von Krebs-Stammzellen und unterstützt präzise personalisierte Therapieansätze.

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Diese Arbeit wird in erster Linie durch DOD OCRP Early Career Investigator Award W81XWH-13-1-0134(GM), DOD Pilot Award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Investigator Initiated Award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for Ovarian Cancer und Michigan Ovarian Cancer unterstützt. Allianz. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Nummer P30CA046592 unterstützt. CMN wird vom National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter Grant No. 1256260 unterstützt. MEB wird vom Department of Education Graduate Assistance in Areas of National Need (GAANN) Fellowship unterstützt.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die 384-Well hängende Fallplatte plattform für die 3D-Sphäroidbildung ist ein leicht zu implementierendes Werkzeug für alle Zellbiologie- oder Krebsbiologielabore. Diese physiologische Plattform ermöglicht das Studium von Zelllinien sowie primären Patientenproben in physiologisch relevanten 3D-Kulturen und ermöglicht gleichzeitig ein Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz. Die Plattform stellt außerdem sicher, dass die Kulturbedingungen hochgradig abstimmbar sind, was eine enge Kontrolle über Beschichtungsdichten, Zel...

Die weltweite krebsbedingte Sterblichkeit erreichte 2018 eine Zahl von 9,8 Millionen Todesfällen1, was die Notwendigkeit der Entwicklung verbesserter Therapeutika unterstreicht. Leider steigen die Kosten für die Entwicklung von Krebsmedikamenten, wobei die Entwicklung eines einzigen Medikaments, das etwa 650 Millionen US-Dollar kostet, darauf hinweist, dass verbesserte Strategien zur Entwicklung neuer Krebsmedikamente erforderlich sind. Krebsstammzellen (CSCs), die durch erhöhte Chemoresistenz gekennzeichnet sind3, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit, neue Tumoren4 auszusäen, werden als verantwortlich für Tumorrezidiv4, Metastasierung5und Chemoresistenz4,6, die alle zur bösartigen Kapazität des Tumors und damit zur hohen Zahl von Todesopfern beitragen. Bei Eierstockkrebs, Diese Zellen werden in der bösartigen Aszites Flüssigkeit in der Peritonealhöhle angereichert gefunden, ein Zustand mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden1. Als Folge der bösartigen Fähigkeiten von CSCs wurde versucht, neue CSC-Medikamente zu entwickeln, die in Verbindung mit herkömmlichen Chemotherapien verwendet werden können. Es gibt mehrere Herausforderungen, die die Entwicklung von CSC-Targeting-Medikamenten begleiten, darunter: 1) Schwierigkeiten bei der Ausweitung und Aufrechterhaltung von CSCs in vitro; 2) Knappheit der Patientenproben; 3) physiologische Relevanz der Kulturplattform; und 4) Heterogenität der Arzneimittelempfindlichkeit zwischen Patienten. Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung einer 3D-Kulturplattform mit hohem Durchsatz, die jede dieser Herausforderungen bewältigen kann. Insbesondere ermöglicht dieses System ein schnelles Arzneimittelscreening mit einer kleinen Anzahl von patientenabgeleiteten Ovarial-CSCs und ist für nachgelagerte Analysetechniken sehr gut geeignet. Unsere Plattform ist zwar ideal für die Untersuchung von Eierstockkrebs und CSCs, aber auch bei der Untersuchung anderer Krebsarten und differenzierter Zelltypen in komplexen 3D-Umgebungen.
Komplexe dreidimensionale (3D) Modelle sind entscheidend für die Untersuchung der Tumor-Mikroumgebung (TME), die eine 3D-Nische aus Krebszellen,nicht-krebsunterstützenden Zellen und extrazellulären Matrixproteinen (ECM) 4 ist. Diese 3D-Umgebung führt zu einer einzigartigen Zellmorphologie, Zellzell- und Zellmatrix-Wechselwirkungen, Zelldifferenzierung, Zellmigration, Zelldichte und Diffusionsgradienten im Vergleich zur traditionellen 2D-Zellkultur in vitro4. All diese Faktoren gipfeln in einer differenzierten Arzneimittelreaktion innerhalb von 3D-Kulturen, die eine erhöhte Arzneimittelresistenz und physiologische Relevanz aufweisen7,8. Aufgrund der Rolle des 3D-TME bei der CSC-Differenzierung und Chemoresistenz ist es wichtig, CSC-Targeting-Medikamente in physiologischen Mikroumgebungen zu überprüfen. Die Verbesserung der physiologischen Relevanz von CSC-Medikamentenscreening-Plattformen hat das Potenzial, patientenspezifische Arzneimittelscreenings, Arzneimittelentwicklung, Formulierung von Behandlungsstrategien und letztlich klinische Ergebnisse zu verbessern. Ebenso wichtig ist es, dass die für das Arzneimittelscreening verwendete Plattform mit hohem Durchsatz und kompatibel mit nachgelagerten Analysemethoden ist, um Kosten, Zeit und klinische Übersetzungszeit vielversprechender Medikamente zu minimieren9.
Derzeit ist das komplexe TME am besten für Arzneimittel-Screening-Anwendungen durch In-vivo-Modelle wie murine syngene Tumormodelle, zelllinienabgeleitete Xenografts und patientenabgeleitete Xenograft-Modelle (PDX)12, da sie physiologische Bedingungen. Der niedrige Durchsatz dieser Modelle sowie die Kosten,-Zeit- und technischen Fähigkeiten, die sie benötigen, schränken jedoch ihren Nutzen in schnellen, hochdurchsatzstarken Arzneimittelscreening-Anwendungenein 13. Als Alternativen zu diesen In-vivo-Modellen verwenden viele In-vitro-3D-Modelle Hydrogele8, Kultur in mikrofluidischen Geräten oder "Organ-on-a-Chip"-Geräten10,14und nicht-anhantigische Kulturen3,8 wurden auch entwickelt, aufgrund ihrer geringen Eintrittsbarriere in Bezug auf Kosten, Zeit und erforderliche Fähigkeiten.
Hydrogelkulturplattformen sind vorteilhaft in der Feinkontrolle über die Matrixzusammensetzung, mechanische Eigenschaften und Matrixstruktur15; sie können jedoch die Zellkultur mit hoher Dichte hemmen14. Darüber hinaus kann die Ernte von Zellen aus Hydrogelen die nachgelagerte Analyse aufgrund potenziell schädlicher Auswirkungen der Erntemethoden erschweren15. Mikrofluidische Geräte hingegen sind Mikroskalige Geräte, die die Ausgangserkennung innerhalb desselben Geräts und für die Zellkultur in physiologisch relevanten Maßstäben mit minimalem Reagenzienverbrauch, verringerter Reaktionszeit, minimiertem Abfall und schnelle Diffusion14. Diese Eigenschaften machen sie vielversprechende Plattformen für die Untersuchung der Arzneimitteltoxizität, Wirksamkeit, und Pharmakokinetik. Die Herausforderungen einer effizienten, quantifizierbaren, reproduzierbaren und benutzerfreundlichen 3D-Zellkultur sowie sperriger und kostspieliger Pumpsysteme haben jedoch mikrofluidische Anwendungen in der Forschung mit hohem Durchsatz eingeschränkt10. Effiziente Erkennungseinstellungen und potenziell schwierige Implementierung enden über alle Bereiche hinweg haben auch die weit verbreitete Einführung mikrofluidischer Systeme behindert10.
Im Gegensatz dazu enthalten Sphäroide, die unter nicht haftenden Bedingungen in rotierenden Mischern (Nutatoren), ultraniedrigen Befestigungsplatten und hängenden Tröpfchen erzeugt werden, keine benutzerdefinierten Matrixkomponenten. Diese Methoden sind besonders relevant für die Untersuchung von Eierstockkrebs, da die nicht haftenden Bedingungen repräsentativ für die Bedingungen sind, unter denen Sphäroide innerhalb der Peritonealhöhle wachsen5. Innerhalb dieser nicht-haftenden Kulturmethoden haben Nutator- und hängende Tropfensphäroide gezeigt, dass sie eine höhere Verdichtung, Umgestaltung und Chemoresistenz im Vergleich zu Sphäroiden aufweisen, die in ultraniedrigen Befestigungsplatten erzeugt werden, was auf eine erhöhte physiologische Relevanz16,17,18,19. Aufgrund der erhöhten Kapazität für High-Throughput-Screening von kleineren Brunnengrößen und minimal erforderlichen Zellzahlen ist die Sphäroid-Generierung in hängenden Fallplatten eine ideale Plattform für das Drogenscreening. Hier präsentieren wir eine abstimmbare 3D-physiologische Plattform in 384 gut hängenden Fallplatten, die einfach zu implementieren ist und für nachgelagerte Analysen hochgradig zugänglich ist, was sie ideal für das Screening von Eierstockkrebs und Eierstock-CSCs mit hohem Durchsatz ermöglicht.
Unsere 3D-physiologische Plattform bietet alle Vorteile der 3D-Kultur, einschließlich physiologischer Zell-Zell-Kontakte, Diffusionsgradienten, Zelldichten und natürlich produzierten ECM-Proteinen, die zu realistischen Wirkstoffreaktionen beitragen können16, 17,18,19. Darüber hinaus sind wir durch die Erzeugung dieser Sphäroide mit patientenabgeleiteten CSCs in der Lage, patientenspezifische Reaktionen auf Medikamente1 mit vielen technischen Replikationen gleichzeitig zu bestimmen, um Heterogenität zu überwinden, die innerhalb des Patiententumors gefunden werden kann. Proben20. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die 3D-Kultur die Erhaltung der CSC-Populationen3,16 verbessert und somit repräsentativ für angereicherte CSC-Populationen in den Aszites7ist. Dies in Kombination mit einer einfachen nachgelagerten Analyse, einschließlich der Durchflusszytometrieanalyse der Lebensfähigkeit und cSC-Proportionen, ermöglicht eine optimale Bewertung der CSC-Targeting-Arzneimittelwirksamkeit. Schließlich ist diese physiologische Plattform mit der Bildgebung zu mehreren Zeitpunkten während des Experiments, der Bewertung von Zelltod und Zellproliferation, der Zellorganisation und Morphologie mit Immunhistochemie, der löslichen Signalisierung mit ELISA auf konditionierten Zellphänotypen mit Durchflusszytometrie und Genexpression nach PCR.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>ILT25200056</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>10.000 cSt Si-Öl</td><td>Millipore Sigma</td><td>63148-62-9</td><td>Wird verwendet, um Sphäroid-Array-Formen zu beschichten, um die Entnahme von Gewebeverarbeitungsgelen wie Histogel aus der Form zu erleichtern.</td></tr><tr><td>100 mm Gewebekulturschale</td><td>Thermo Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konisches Röhrchen</td><td>Celltreat</td><td>FL4021</td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM für Serum Free Medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>1x F12 für Serum Free Medium</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>ILT10010023</td><td></td></tr><tr><td>4',6- Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies Inc.</td><td>1449</td><td>Ein sanftes Zellablösungsenzym, bestehend aus proteolytischen und kollagenolytischen Enzymen.</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1025</td><td>Resazurin-Farbstoff, der zur Messung der Lebensfähigkeit und Proliferation von Zellen auf der Grundlage ihrer Fähigkeit verwendet wird, Resazurin zu Resorufin zu reduzieren, das stark fluoreszierend ist.</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Assay Kit</td><td>Stem Cell Tech</td><td>1700</td><td>Kit zur Identifizierung von Stamm- und Vorläuferzellen, die einen hohen Gehalt an Aldehyddehydrogenase exprimieren, einem Indikator für Krebsstammzellen. Das Kit besteht aus ALDEFLUOR-Reagenz, DEAB, Salzsäure, Dimethylsulfoxid und ALDEFLUOR-Assay-Puffer.</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyd (DEAB)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>1705</td><td>Diethylaminobenzaldehyd (DEAB) ist ein Inhibitor von ALDH-Isoenzymen, der zur Bestimmung der unspezifischen ALDH-Färbung verwendet wird.</td></tr><tr><td>Andor iXon x3 CCD-Kamera</td><td>Oxford</td> <td>Instruments-Antibiotika</td><td></td></tr> <tr><td>und Antimykotika</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>APC-Isotyp IgG2b</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-092-217</td><td>Isotypkontrolle zur Quantifizierung der unspezifischen Färbung von IgG2b-Antikörpern.</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Stammzelltechnologien</td><td></td><td>78003.1</td><td></td></tr><tr><td>BD Lo-Dose U-100 Insulinspritzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek</td><td>7091000</td><td></td></tr><tr><td>CD133-APC</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-113-184</td><td>Fluoreszierender Antikörper gegen CD133, einen Marker für Krebsstammzellen.</td></tr><tr><td>cellSens Dimension Software</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4394</td><td>Chemotherapeutikum auf Platinbasis, das als Alkylierungsmittel fungiert und die DNA zerstört.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core Cell Imaging System</td><td>Life Technologies</td><td>AME3300</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum - Premium (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>Gewebeverarbeitungsgel, das in das Gel eindringen und die Probe im Gel halten kann, während es gleichzeitig Verfärbungen um die Probe herum beim Färben verhindert.</td></tr><tr><td>Humane mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe</td><td>Lonza</td><td>PT-5006</td><td></td></tr><tr><td>Humane mikrovaskuläre Endothelzellen</td><td>Lonza</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selen-Supplement</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Lebend/Tot Lebensfähigkeitskit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Kit für den fluoreszenzbasierten Nachweis von lebenden (Calcein-AM) und toten Zellen (Ethidium Homodimer-1).</td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph 7.8 Software</td><td>Molecular</td> <td>Devices-Olympus</td><td></td></tr> <tr><td>IX81 Inverses Konfokalmikroskop</td><td>Olympus-Olympus</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>IX83 Inverses Forschungsmikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Thomas Scientific</td><td>7315D35</td><td>Thermoplastische Polymerstreifen, die dazu dienen, die Tröpfchenverdunstung in hängenden Fallplatten zu begrenzen und gleichzeitig den Gasaustausch zu ermöglichen.</td></tr><tr><td>Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates</td><td>3D Biomatrix</td><td>HDP1384-8</td><td>Erhältlich über Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Phalloidin AlexaFluor488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Phalloidin ist ein Peptid zur fluoreszierenden Markierung von F-Aktin in fixierten Zellen.</td></tr><tr><td>ProJet 3500 HD Max</td><td>3D</td> <td>Systems-3D-Drucker</td><td></td></tr> <tr><td>Steriles DI-Wasser</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Azo-Farbstoff, der zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen verwendet wird, basierend auf seiner Fähigkeit, die beschädigte Membran toter Zellen zu passieren, aber nicht die intakte Membran lebender Zellen.</td></tr><tr><td>VisiJet M3 Crystal</td><td>3D</td> <td>Systems-Ein</td> <td>biokompatibles Polymermaterial für den 3D-Druck.</td></tr><tr><td>Yokogawa CSU-X1 Konfokale Scannereinheit</td><td>Yokogawa</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

physiologische rand-3d-sphäroide für antineoplastisches arzneimittel-screening, um krebs-stammzellen gezielt anzusprechen

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren zur Erzeugung von Tumorsphäroiden innerhalb von 384 gut hängenden Tröpfchen, um ein Hochdurchsatzscreening von Krebstherapeutika in einer physiologisch repräsentativen Mikroumgebung zu ermöglichen. Wir skizzieren die Bildung von patientenabgeleiteten Krebsstammzellsphäroiden sowie die Manipulation dieser Sphäroide für eine gründliche Analyse nach medikamentöser Behandlung. Insbesondere beschreiben wir die Sammlung von Sphäroidmorphologie, Proliferation, Lebensfähigkeit, Arzneimitteltoxizität, Zellphänotyp und Zelllokalisierungsdaten. Dieses Protokoll konzentriert sich stark auf Analysetechniken, die leicht mit der 384-Well hängenden Tropfen-Plattform implementiert werden können, so dass es ideal für High-Through-Through-Drogen-Screening. Während wir die Bedeutung dieses Modells in der Eierstockkrebsforschung und der Krebsstammzellforschung betonen, ist die 384-Well-Plattform für die Erforschung anderer Krebsarten und Krankheitsmodelle zugänglich und erweitert den Nutzen der Plattform auf viele Bereiche. Durch die Verbesserung der Geschwindigkeit des personalisierten Arzneimittelscreenings und der Qualität der Screening-Ergebnisse durch leicht zu implementierende physiologisch repräsentative 3D-Kulturen wird diese Plattform bei der Entwicklung neuer Therapeutika und patientenspezifischer Behandlungsstrategien und haben daher weitreichende klinische Auswirkungen.

Sphäroide, die mit Zelllinien oder vom Patienten abgeleiteten CSCs gebildet werden, können mit einem Bereich von kleinen Zellnummern innerhalb hängender Tröpfchen gebildet werden (Abbildung 2A). Sphäroide bilden sich zuverlässig mit nur 10 Zellen pro Brunnen, was die Konservierung seltener Patientenproben ermöglicht. Zellen innerhalb dieser Sphäroide sind von anderen Zellen in 3 Dimensionen umgeben, wie sie in vivo wären, was physiologische Zell-Zell-Kontakte und Diffusionsraten ermöglicht. ...

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von vom Patienten abgeleiteten Sphäroiden und nachgelagerte Analysen, einschließlich Quantifizierung der Proliferation, Zytotoxizitätstests, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung, um Potenzial der Kandidaten als antineoplastische Therapeutika. Dieses Protokoll unterstützt Präzisionsmedizin mit der Identifizierung spezifischer Medikamente für jeden Patienten und das Krankheitsstadium.

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Unser Protokoll bietet eine einfache Methode für die 3D-Zellkultur und ist für die nachgelagerte Analyse sehr gut geeignet. Dies erleichtert die Bewertung heterogener Patientenproben und deren spezifische Wirkstoffreaktionen. Der Vorteil dieser Technik ist, dass Sphäroide aus kleinen Zellnummern gebildet werden können, was sowohl die Konservierung knapper Primärproben als auch ein Screening mit hohem Durchsatz für patientenspezifische Arzneimittelreaktionen ermöglicht.Das Hängende Tropfenmodell schafft eine physiologische Umgebung mit 3D-Medikamentendiffusion und reagiert entsprechend dem Tumorstadium. Dies ermöglicht die Entwicklung gezielter Therapien und patientenspezifischer Behandlungen. Diese Methode ist ideal für die Untersuchung von Eierstockkrebs, Heterogenität und der Entwicklung von Chemoresistenz.Jedoch, Es kann auch verwendet werden, um andere Krebsarten und medikamentenresistente Zellpopulationen zu studieren. Bei der Beschichtung von Sphäroiden ist es wichtig, präzise Volumen zu pipette. Dadurch wird die Konsistenz zwischen Sphäroiden sichergestellt.Die Sphäroide und ihre jeweiligen Tröpfchen sind von Natur aus zerbrechlich und ohne richtige Handhabung leicht verloren, daher zeigen wir, wie man eine hängende Fallplatte entsprechend plattiert, pflegt und analysiert. Demonstriert wird dieses Verfahren von Michael Bregenzer, einem Doktoranden unseres Labors. Beginnen Sie damit, jeden Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte mit vier bis fünf Milliliterautokton-entionisiertem Wasser zu füllen und die hängende Fallplatte zwischen Deckel und Boden der Platte zu verstauen.Fügen Sie 800 bis 1000 Mikroliter Wasser um den Rand der hängenden Fallplatte hinzu, um eine feuchte Umgebung zu schaffen und die Verdunstung zu minimieren. Als Nächstes sammeln Sie 2D gewachsene Zellen, indem Sie sie mit Trypsin lösen und dann sechs oder acht Milliliter Medium hinzufügen, das FBS enthält. Die Zellen mit der 10 Milliliter serologischen Pipette ansaugen und in einem 15 Milliliter konischen Rohr ablagern.Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. Bereiten Sie die Zellsuspension nach Manuskriptrichtungen vor und mischen Sie sie vorsichtig mit der Pipette, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten. Legen Sie die Spitze der Pipette in einem Winkel von 45 Grad und Pipette 20 Mikroliter Suspension in jedem hängenden Tropfen gut.Legen Sie den Deckel der Sechs-Well-Platte wieder auf und verwenden Sie einen dehnbaren thermoplastischen Streifen, um die Kanten zu versiegeln. In einem Standard-Kohlendioxid-Befeuchtungsbrutschrank inkubieren und die hängenden Tropfen alle zwei bis drei Tage füttern, indem man jedem sphäroidhaltigen Brunnen zwei bis drei Mikroliter Zellkulturmedium hinzufügt. Um die Proliferation und Lebensfähigkeit der Zellen zu quantifizieren, fügen Sie zwei Mikroliter gefilterter Resazurin-basierter Lösung in die Brunnen ein, die für die Proliferationsanalyse bestimmt sind, und inkubieren Sie gemäß Manuskriptrichtung.Öffnen Sie nach der Inkubationszeit das hängende Tropfen-Sandwich in einem Biosicherheitsschrank und bringen Sie die 384-Wellplatte mit dem Deckel noch an Ort und Stelle zum Plattenleser. Legen Sie es in den Plattenleser und lesen Sie die Platte. Speichern Sie das Experiment im Popupfenster, und exportieren Sie die Daten in eine Kalkulationstabelle.Geben Sie die Platte wieder auf die Sechs-Brunnen-Basis zurück und legen Sie sie in den Inkubator. Sobald alle Zeitpunkte für den Tag gelesen wurden, versiegeln Sie die Platte vor dem Inkubieren erneut. Um Sphäroide für die Durchflusszytometrieanalyse vorzubereiten, verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um sie aus jedem Brunnen zu sammeln und sie in ein 15 Milliliter konisches Rohr zur Disaggregation zu legen.Aliquot Zellsuspension in fünf Mikrozentrifugenröhren, so dass jede Röhre mindestens 50.000 Zellen enthält. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 400 mal G für fünf Minuten in einer Mikrozentrifuge, dann aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie Pellets in 100 Mikroliter Aldefluorpuffer wieder auf. Beschriften Sie die Rohre nach Manuskriptanweisungen.Fügen Sie 0,5 Mikroliter APC-Isotyp-Antikörper in das APC ISO-Rohr und einen Mikroliter CD133-Antikörper in die ALDH CD133-Röhre ein. Dann fügen Sie fünf Mikroliter DEAB-Reagenz und 0,5 Mikroliter ALDH in das DEAB-Rohr und einen Mikroliter ALDH in die ALDH CD133-Röhre. Wirbel alle Rohre für ein paar Sekunden und inkubieren sie bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten.Nach der Inkubation alle Röhren wieder wirbeln und fünf Minuten lang bei 400 mal G zentrieren. Beschriften Sie FACS-Rohre nach Manuskriptanweisungen und füllen Sie einen isolierten Schaumbehälter mit Eis. Aspirieren Sie den Überstand aus den Mikrozentrifugenrohren.Dann setzen Sie die ungefärbte Kontrolle in 400 Mikroliter FACS-Puffer und den Rest der Zellen in 400 Mikroliter FACS DAPI Puffer wieder aus. Legen Sie die Rohre auf das Eis, bis sie auf einem Durchflusszytometer analysiert werden können. Verwenden Sie FlowJo, um die Daten aus dem Durchflusszytometer zu analysieren.Doppelklicken Sie auf die unbefleckte Datei und legen Sie die Y-Achse auf Seitenstreuhöhe oder SSCH oder Die X-Achse auf Streuhöhe oder FSCH nach vorne. Klicken Sie auf die T-Schaltfläche neben jeder Achse, um die Skalierung anzupassen und die Trennung zwischen verschiedenen Zellpopulationen zu maximieren. Klicken Sie als Nächstes auf die Schaltfläche Polygon-Gating, zeichnen Sie Polygon-Gate um die Zellenpopulation und beschriften Sie die Grundgesamtheitszellen.Doppelklicken Sie auf die Grundgesamtheit der Zelle im Arbeitsbereich, und ändern Sie dann die FSC-Achse in Die FSC-Breite und die SSC-Achse in die FSC-Höhe. Wählen Sie das Rechtecktor aus, um nur ein Rechteck um die linke dichte Grundgesamtheit von Zellen zu zeichnen, die sich über die gesamte Y-Achse erstreckt. Beschriften Sie dieses Gate Single Cells.Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf diese Zellen in das verschachtelte Einzelne Zellen-Gate, und fügen Sie sie unter jedem Beispiel im Arbeitsbereich ein. Doppelklicken Sie auf das Unter das DAPI-Beispiel verschachtelte Tor für einzelne Zellen, um die Einzelzellenpopulation aus diesem Beispielrohr anzuzeigen. Ändern Sie den FSC-Achsenkanal in den DAPI-Bereichskanal, und ändern Sie den SSC-Achsenkanal in Histogramm.Klicken Sie auf die T-Schaltfläche neben der DAPI-Achse und klicken Sie auf Achse anpassen, um die Skalierung anzupassen und die Trennung zwischen DAPI-positiven und DAPI-negativen Peaks zu maximieren. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Anwenden, und wählen Sie die Schaltfläche Range Gate aus. Verteilen Sie es über die negative DAPI-Spitze und beschriften Sie dieses Gate Live Cells.Kopieren Sie das Live Cells-Gate und fügen Sie es unter das Einzelzellen-Gate unter den APC ISO DEAB- und ALDH-CD133-Röhren ein, um den gleichen Teil der lebenden Zellen in jeder Röhre auszuwählen. Doppelklicken Sie dann auf die Live Cells-Population, die unter der APC ISO-Beispieldatei verschachtelt ist, und wechseln Sie die X-Achse in den ALDH-Bereich und die Y-Achse in den APC-Bereich. Wenden Sie Quadrant Gate an und passen Sie den Schnittpunkt des Tores an, so dass etwa 0,5 % der Bevölkerung in der oberen linken Ecke des Plotfensters liegen.Benennen Sie dann die Quadranten wie gewünscht, kopieren Sie dann die Quadrantentore und fügen Sie sie auf die unter der DEAB-Datei verschachtelte Grundgesamtheit der lebenden Zellen ein, und passen Sie die vertikale Linie so an, dass etwa 0,15 % der Zellpopulation innerhalb des ALDH-positiven Quadranten liegen. Kopieren sie schließlich die Quadrantentore in die ALDH CD133-Dateien Live Cells Population und Bewertung KrebsStammzellproportionen basierend auf ALDH und CD133 Proportionen. Dieses Protokoll kann für die Analyse von Krebsstammzellen mit hohem Durchsatz verwendet werden.So wenig wie 10 Zellen pro Brunnen können zuverlässige Sphäroide bilden und wenn sich die Zellen vermehren, dehnen sich die Sphäroide in der Größe aus. Die Proliferationsfähigkeit kann leicht mit einem auf Resazurin basierenden Blütenstand-Assay quantifiziert werden. Die Wirkung von Medikamenten auf die Sphäroidmorphologie kann mit Phasenkontrastbildgebung visualisiert und durch den Vergleich der Resazurinblütenin in unbehandelten und behandelten Zellen quantifiziert werden.Der Zelltod kann durch Zugabe von Calcein-AM und Ethidium Homodimer I zu Sphäroiden validiert werden, gefolgt von einer Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop. Schließlich können Sphäroide geerntet und in eine einzelne Zellsuspension zur Analyse mit Durchflusszytometrie dispergiert werden, was es ermöglicht, die Wirksamkeit verschiedener medikamentöser Behandlungen an bestimmten Zellpopulationen zu erkennen. Um Tröpfchenverlust, mittlere Verdunstung und Variation der Sphäroidgröße zu vermeiden, ist es wichtig, Ihre Platten sorgfältig zu handhaben, Pipette mit Präzision und vollständig versiegeln Sie Ihre hängenden Fallplatten.Zur Bewertung von Veränderungen der Genexpression und der löslichen Signalisierung durch medikamentöse Behandlung können einzellige RNA-Sequenzierungen und enzymgebundene Immunsorbent-Assays verwendet werden, um die Entwicklung von Therapeutika zu erleichtern. Diese Technik ermöglicht es Forschungen in der Onkologie, Präzisionsmedizin und Arzneimittelentwicklung, die Intra- und Interpatientenheterogenität sowie die Chemoresistenz durch das Arzneimittelscreening kleiner Biopsien mit hohem Durchsatz zu erforschen. Achten Sie bei der Durchführung dieses Protokolls darauf, alle standardmäßigen persönlichen Schutzausrüstungen zu tragen.Inklusive Handschuhen, Schutzbrillen, Labormänteln, Hosen und schuhen.

physiologic-patient-derived-3d-spheroids-for-anti-neoplastic-drug

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Ein Protokoll für den robotergestützten Druck von Krebszell-Sphäroiden in einem 96-Well-Plattenformat mit hohem Durchsatz unter Verwendung eines wässrigen Zweiphasensystems wird vorgestellt.

Roboter-Produktion von Cancer Cell Sphäroide mit einer wässrigen Zwei-Phasen-System für Drug Testing

Die Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele, die von präklinischen Tests zu Versuchen am Menschen übergehen, ist eine wissenschaftliche Priorität. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier einen funktionellen genomischen Ansatz, um die Auswirkungen der Genverarmung auf Sphäroide von Krebszelllinien zu untersuchen, die menschliche Krebserkrankungen in vivo besser modellieren.

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

Wir beschreiben die Evolution ein Sphäroid-basierte, dreidimensionales in Vitro -Modell, das uns ermöglicht, den aktuellen Stand der experimentellen Therapie-Schemata für Kopf und Nacken Squamous Zelle Krebsgeschwür auf Zelllinien, testen, zur Bewertung der Therapie Empfänglichkeit und Resistenz auf primäre Zellen aus menschlichen Proben in der Zukunft.

Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Über eine Vielzahl von Anzeichen der Krankheit werden mehr physiologisch relevanten Modelle entwickelt und implementiert in Drug Discovery-Programme. Das neue Modellsystem hier beschriebenen zeigt wie dreidimensionale Tumor Sphäroide kultiviert und in ein Hochdurchsatz-1536-Well-Platte-basiertes System zur Suche neuer Krebsmedikamente abgeschirmt werden können.

Generation von Hochdurchsatz-dreidimensionale Tumor Sphäroide für Drogen-Screening

Dieses Protokoll dient zur Immuntherapie umgeleiteten T-Zellen (Auto T-Zelle) Zytotoxizität gegen 3D strukturierte Krebszellen (Sphäroide) in Echtzeit zu bewerten.

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Optische Kohärenztomografie (OCT), eine dreidimensionale imaging-Technologie, wurde verwendet, um zu überwachen und zu charakterisieren, die Wachstum Kinetik der vielzelligen Tumor Sphäroide. Präzise volumetrische Quantifizierung der Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie abgestorbenes Gewebe-Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung dagegen wurden demonstriert.

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Ein neuartiges dreidimensionales Sphäroidmodell, das auf der heterotypischen Interaktion von Tumorzellen und stromalen Fibroblasten basiert, wird etabliert. Hier präsentieren wir Kokultur von Tumorzellen und stromalen Fibroblasten, Zeitraffer-Bildgebung und konfokale Mikroskopie, um die Bildung von Sphäroiden zu visualisieren. Dieses dreidimensionale Modell bietet eine entsprechende Plattform, um Tumor-Stroma-Wechselwirkungen zu untersuchen und Krebstherapeutika zu testen.

Ein neuartiges Stromal Fibroblast-moduliertes 3D-Tumor-Sphäroid-Modell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion und der Arzneimittelforschung

Dieses Protokoll stellt ein neuartiges, robustes und reproduzierbares Kultursystem zur Erzeugung und zum Wachstum dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen dar. Die Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Krebsstammzellbiologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.

Ein dreidimensionales Modell von Sphäroiden zur Untersuchung von Darmkrebs-Stammzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von 3D-Tumorkulturmodellen aus primären Krebszellen und die Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten unter Verwendung von Zellviabilitätsassays und mikroskopischen Untersuchungen.

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

Dieser Artikel demonstriert eine standardisierte Methode zur Konstruktion dreidimensionaler Tumorsphäroide. Eine Strategie zur Sphäroidbeobachtung und bildbasierten Deep-Learning-Analyse unter Verwendung eines automatisierten Bildgebungssystems wird ebenfalls beschrieben.

Generierung von 3D-Tumorsphäroiden für Wirkstoffevaluierungsstudien

In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur Identifizierung von Verbindungen vor, die den ADCC-Mechanismus, einen wichtigen Krebszell-Abtötungsmechanismus von Antitumor-Antikörpern, modulieren. Die zytotoxische Wirkung von NK-Zellen wird in Brustkrebszell-Sphäroiden in Gegenwart von Trastuzumab gemessen. Die Bildanalyse identifiziert lebende und tote Killer- und Zielzellen in Sphäroide.

Quantifizierung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität in einem Tumor-Sphäroid-Modell: Anwendung für die Wirkstoffforschung

Erfahren Sie die Erstellung physiologischer 3D-Sphäroide aus Patientenproben für das Screening antineoplastischer Wirkstoffe. Diese Methode ermöglicht die gezielte Ansprache von Krebs-Stammzellen und unterstützt präzise personalisierte Therapieansätze.

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

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