Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

Das Protokoll ist hilfreich, um quantitative Einblicke in die zeitliche Regulation von Virusgenprodukten im Kontext von Wirtszellen, insbesondere in Bezug auf Herpesviren, zu gewinnen. Diese Technik kann helfen, Forschungsfragen im Zusammenhang mit Wirt sanieren und virale RNAs und Proteine zu behandeln. Darüber hinaus ist diese Technik mit gleichzeitigen biochemischen Assays kompatibel.

Um die Zellen an acht Kammergleitern zu haften, tragen Sie 200 Mikroliter einer inhärenten Zellsuspension auf jede Kammer eines sterilen, achtkammerigen Dias auf und ermöglichen das Saatgutwachstum für 12-24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am Ende der Inkubation, aspirieren Sie die überstehenden und ungebundenen Zellen, und fixieren Sie sofort die Zellen mit vorgekühlten 4%Formaldehyd in PBS auf Eis, für 30 Minuten. Am Ende der Fixierung die Zellen mit drei, fünf Minuten Wäscht in 200 Mikroliter n4 Grad Celsius PBS pro Wäsche waschen.

Nach der letzten Wäsche die festen Zellen mit 200 Mikrolitern vorgekühlten 0,5%Triton-X in PBS pro Brunnen 10 Minuten auf Eis permeabilisieren. Am Ende der Permeabilisation die Kammern vorsichtig entfernen, ohne die Rutsche zu knacken, und spülen Sie die Zellen mit vorgekühltem PBS ab. Blockieren Sie die entspülten Zellen mit vorgekühlten 4%BSA in PBS für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, gefolgt von einer Inkubation mit entsprechendem polyklonalen primärer Antikörper von Interesse in 0,1%BSA in PBS für eine Stunde, bei vier Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation die Zellen dreimal mit frischem PBS waschen und die Zellen mit einem geeigneten sekundären Antikörper bebrüten, der mit einem fluorophoren konjugierten Fluorophor konjugiert ist, der mit dem FISH-Detektionsantikörper für eine Stunde bei vier Grad Celsius kompatibel ist. Nach drei PBS-Washes, wie gezeigt, fixieren Sie die Proben erneut in 4%Formaldehyd in PBS für 10-15 Minuten vor einer zweiten Permeablisierung, wie gezeigt. Dann bedecken Sie den Schlitten mit Aluminiumfolie, um das fluoreszierende Signal zu erhalten und Photobleichungen zu verhindern.

Und waschen Sie die Zellen mit 2x satinasinnatriumcitrat, bevor Sie 45 Mikroliter Hybridisierungslösung auftragen. Nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer destilliertes Wasser in die Antisense-Oligonukleotide von Interesse geben, um das Denaturierungsvolumen auf 10 Mikroliter zu bringen. Denaturieren Sie die Oligonukleotide bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, bevor Sie 35 Mikroliter frischer Hybridisierungslösung pro Rutsche hinzufügen.

Dann inkubieren Sie die Proben von 10-24 Stunden in der befeuchteten Kammer bei 37 Grad Celsius, mit Folie geschützt. Am nächsten Tag die Zellen mit zwei, 10 Minuten waschen. 2X saline Natriumcitrat wäscht bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Wäsche in 1X satiniertem Natriumcitrat für 10 Minuten, bei 25 Grad Celsius.

Nach der letzten Wäsche die Zellen mit vorgekühltem 4%Formaldehyd in PBS für 10-15 Minuten auf Eis fixieren, gefolgt von drei Wäschen mit frischem PBS. Als nächstes permeabilisieren Sie die Proben, wie gezeigt, gefolgt von inkubation mit Anti-Dioxigenin FTC und vorgekühlten 0,1%BSA in PBS, für eine Stunde bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Dias dreimal in frischer NEBENstellenanlage waschen und die Proben mit vorgekühltem 4%Paraformaldehyd in PBS fixieren, für 10-15 Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach drei Washes in PBS, beschriften Sie die Kerne mit 0,4 Mikrogramm pro Milliliter DAPI und vorgekühlten 0,5%Triton-X in PBS für 15 Minuten auf Eis, gefolgt von drei letzten Wäbungen in PBS. Mount Dias mit fluoreszierenden Perlen, als experimentell relevant und in geeigneter Montagemedium. Nachdem Sie überschüssiges Montagemedium mit sterilen Tüchern entfernt haben, versiegeln Sie einen Deckelrutsch an jedem Schlitten mit mehreren Schichten aus klarem Nagellack und verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die erfolgreiche Durchführung des Experiments zu bestätigen.

Die Bilder können dann auf einem konfokalen Mikroskop aufgenommen werden, um Bilder der Proben innerhalb einer Stunde bis zu einer Woche nach der Montage bei einer 630-fachen Vergrößerung zu sammeln. Diese repräsentativen FISH- und Immunfluoreszenzergebnisse sind semiquantitativ und bieten Einblicke in die Oligonukleotid-Lokalisierung und nicht in Vergleiche zwischen den Intensitäten der verschiedenen fluoreszierenden Flecken, da diese Experimente keine fluoreszierende Perle in die Diapräparation einbeziehen. In diesen Experimenten waren die zytoplasmatischen und nuklearen Bereiche und ihre Verhältnisse für latente und lytische KSHV-infizierte Zellen unterschiedlich.

Wie in dieser Abbildung dargestellt, wird der Bereich im Nukleozytoplasma-Verhältnis kontrolliert. Wenn die KSHV-DNA-Replikation in der lytischen Phase gehemmt wird, verschiebt sich das frühe lytische Protein der KSHV-Oligonukleotid-Transkription zu einer überwiegend zytoplasmatischen Lokalisation. KSHV polyadenylierte RNA lokalisiert jedoch trotz der Hemmung der viralen DNA-Replikation auf bestimmte Kernstandorte.

Achten Sie beim Entfernen der Kammern aus den Dias darauf, dass sich nur sehr geringe Klebstoffrückstände auf dem Werkzeug befinden, und verwenden Sie Ethanol, um die Zellen zu durchdringen und den Klebstoff zu schwächen. Biochemische Tests wie QPCR, Western Blot und High-Throughput-Sequenzierung können gemeinsam durchgeführt werden, um die quantitativen Daten, die aus den Mikrographen gesammelt werden, zu erweitern.