Name: Pan-lyssavirus Echtzeit RT-PCR für Tollwut-Diagnose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Lernen Sie eine Echtzeit-RT-PCR-Methode zur Tollwut-Diagnose mit Pan-Lyssavirus-Primern. Dieses sensitive Verfahren erkennt alle Lyssavirus-Arten in klinischen Proben zuverlässig.

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Die Autoren danken Miss Emma Wise und Miss Megan Golding für die Unterstützung bei der Durchführung der Experimente. Die Entwicklung dieses Protokolls wurde vom britischen Ministerium für Umwelt, Ernährung und Angelegenheiten des ländlichen Raums (Defra), der schottischen Regierung und der walisischen Regierung durch Zuschüsse [SV3500 und SE0431] sowie durch das Projekt European Virus Archive global (EVAg) finanziell unterstützt. im Rahmen des Förderabkommens Nr. 653316 aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union gefördert.

Proben von diagnostischem Material, das bei APHA nach einer natürlichen Infektion erhalten wurde oder durch Impfung von Mäusen unter Verwendung von Protokollen gewonnen wurde, die vom Ethik- und Statistikausschuss der APHA gemäß den Vorschriften des britischen Innenministeriums unter Lizenz 70/7394 bewertet wurden.
1. Quantifizierung der RNA mit einem Mikrovolumen-Spektrophotometer
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen des Spektralphotometers auf RNA eingestellt sind.</li>
	<li>Verwenden Sie 1-2 l molekularem Wasser, um die Maschine zu initialisieren und eine Basislinie festzulegen.</li>
	<li>Verwenden Sie 1-2 l jeder Test-RNA-Probe, um die RNA-Menge zu bewerten.</li>
	<li>Speichern Sie die Messwerte und das Dokument.</li>
	<li>Passen Sie die RNA bei Bedarf auf 1 g/l an. HINWEIS: RNA muss jederzeit auf Eis (oder in einem kühlen Block) gehalten werden. Wenn RNA mit einer Spalte oder einer perlenbasierten Methode erhalten wird, ist die RNA in der Regel kleiner als 1 g/l. In dieser Situation verwenden Sie die RNA ordentlich.</li>
</ol>2. Vorbereitung der RNA-Verdünnungsserie zur Bestimmung der Endpunktempfindlichkeit
<ol><li>
Machen Sie eine 10-fache serielle Verdünnung der RNA.
	<ol>
<li>Etikettenröhren mit der Verdünnungsreihe (z.B. 10-1, 10-2,etc.) und den RNA-Details.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Rohr 45 L wassermolekulares Wasser hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 5 l der RNA (zuvor auf 1 g/l) verdünnt und gut mischen.</li>
		<li>Pipettespitze in geeignetem Desinfektionsmittel entsorgen und durch eine frische Spitze ersetzen.</li>
		<li>Nehmen Sie 5 l aus dem 10-1 und fügen Sie zu 10-2 Rohr und gut mischen.</li>
		<li>Wiederholen Sie 2.1.3-2.1.5 mit den verbleibenden Verdünnungen. HINWEIS: RNA muss jederzeit auf Eis (oder in einem kühlen Block) gehalten werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung von Echtzeit-RT-PCR-Reaktionen
<ol><li>Planen Sie anhand einer Kalkulationstabelle das Plattenlayout nach der Anzahl der Testproben und Kontrollproben, sowohl für die Lyssavirus- als auch für die ß-Actin-Assays. HINWEIS: Sollen 4 Proben in doppelter Ausweise mit positiver und negativer Kontrolle getestet werden, entspricht dies 10 Reaktionen für beide Assays.</li>
	<li>Wischen Sie in einem von der RNA-Vorlage getrennten "Reinraum" oder Bereich die Oberflächen vor der Verwendung mit einem geeigneten Desinfektionsmittel ab oder bereiten Sie eine PCR-Workstation vor (falls verwendet). Zur Vorbereitung des Arbeitsplatzes wischen Sie die Schrankoberfläche mit einer entsprechenden Desinfektion ab und legen Sie die benötigten Gegenstände in den Arbeitsplatz und schließen Sie die Türen. Einschalten des UV-Lichts für 10 Minuten</li>
	<li>Entfernen Sie Regenten und Primer aus dem Gefrierschrank und tauen (Reagenzien in Tabelle 1 und Primer in Tabelle 2). HINWEIS: Der Enzymmix wird in Glycerin gespeichert, so dass kein Auftauen erforderlich ist und muss jederzeit auf Eis (oder in einem kühlen Block) gehalten werden. Alle anderen Reagenzien können bei Raumtemperatur aufgetaut werden.</li>
	<li>Nach dem Auftauen die Reagenzien und die Zentrifuge kurz mischen, um Flüssigkeit zu sammeln. HINWEIS: Wirbeln Sie nicht die Enzymmischung, nur Zentrifuge kurz.</li>
	<li>Bereiten Sie separate Master-Mischungen für Lyssavirus und ß-Actin vor. Fügen Sie für jede Reaktion 7,55 l molekularem Wasser, 10 l 2x universelles SYBR-Grünreaktionsmix, 0,6 l Vorwärtsprimer, 0,6 l Reverse primer, 0,25 l iTaq RT-Enzymmix hinzu.
	<ol>
<li>Verwenden Sie eine Kalkulationstabelle, um korrekte Volumes zu berechnen, um Fehler bei der manuellen Berechnung zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass genügend Master-Mix vorbereitet ist, um Pipettierfehler zu kompensieren. Wenn also 10 Reaktionen erforderlich sind (siehe ANMERKUNG in 3.1), bereiten Sie 12 Reaktionen vor.</li>
		<li>Bereiten Sie den Master-Mix auf Eis (oder in einem kühlen Block) vor und bleiben Sie auf Eis, bis sie in die Echtzeitmaschine gelegt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Mischen Sie die vorbereiteten Master-Mixe, zentrifugieren Sie kurz und geben Sie 19 l in die entsprechenden Brunnen von Bandrohren oder eine 96-Well-Platte, die mit der im Einsatz sindden Echtzeitmaschine kompatibel ist. HINWEIS: Minimieren Sie die Produktion von Blasen in den Brunnen während des Pipettierens.</li>
	<li>In einem separaten Raum oder in einem UV-Schrank, wie in 3.2 beschrieben, fügen Sie sorgfältig 1 l der zuvor auf 1 g/l (siehe Schritt 1.5) eingestellten RNA unter die Oberfläche des entsprechenden Master-Mix gut und mischen Sie vorsichtig. Pipettenspitze direkt nach Gebrauch (unter der Oberfläche) in desinfizierend entsorgen.
	<ol>
<li>Fügen Sie die Steuerelemente nach den Testproben hinzu, wobei die Positivsteuerung als nächstes hinzugefügt und die No Template Control (NTC – molekulares Wasser) zuletzt hinzugefügt wurde. Die Menge der verwendeten RNA kann je nach Probentyp und verwendeter RNA-Extraktion verändert werden. Die verwendete Menge muss validiert werden, um sicherzustellen, dass die Reaktion optimiert wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Dichtungsplatte mit Streifendeckeln oder Versiegelung, die darauf achtet, dass alle Deckel fest verschlossen und ausreichend gekennzeichnet sind, um die Proben zu orientieren. Beschriften Sie den Rand der Platten-/Streifenrohre.</li>
	<li>Drehen Sie die Proben mit einer Zentrifuge herunter, um die gesamte Flüssigkeit am Boden der Brunnen zu sammeln.</li>
	<li>Übertragen Sie die Platte auf die Echtzeit-PCR-Maschine, öffnen Sie die Tür und platzieren Sie im Halter, um die korrekte Position/Ausrichtung der Proben entsprechend dem Plattenlayout zu gewährleisten. HINWEIS: Wenn Rohrstreifen verwendet werden, stellen Sie sicher, dass der Halter an Ort und Stelle ist.</li>
	<li>Öffnen Sie das Echtzeit-PCR-Maschinenprogramm und wählen Sie die Option für SYBR-Echtzeitexperiment mit Dissoziationskurve. Programmieren Sie die Echtzeit-PCR-Maschine unter Verwendung der in Tabelle 3angegebenen thermischen Zyklusbedingungen, einschließlich der Datenerfassungspunkte.</li>
	<li>Wählen Sie SYBR als Fluoreszenzfarbstoff aus, und wählen Sie unbekannt als Beispieltyp aus, und fügen Sie einen Namen in das richtige Beispielnamensfeld ein. HINWEIS: Unterscheiden Sie zwischen den Replikationen und auch zwischen dem Lyssavirus und ß-Actin-Brunnen.</li>
	<li>Wählen Sie einen Dateispeicherort aus, um die experimentellen Daten zu speichern, stellen Sie sicher, dass die Lampe am Ende des Laufs ausgeschaltet wird, und starten Sie dann den Lauf. HINWEIS: Da der erste Schritt eine RT-Stufe ist, werden während dieser Zeit keine Daten gesammelt, daher kann dies während der RT-Phase auftreten, wenn die Lampe eine Aufwärmphase erfordert. Die Echtzeitmaschine und Software zeigt die Verstärkungskurven in Echtzeit an, während die Schmelzkurve am Ende des Zyklus erzeugt wird.</li>
</ol>4. Datenanalyse
<ol><li>
Nachdem die Ausführung abgeschlossen ist, führen Sie die Datenanalyse wie folgt durch.
	<ol>
<li>Analysieren Sie zunächst die Amplifikationsdiagrammergebnisse der Testproben zusammen mit den Kontrollproben. Positive Stichproben zeigen exponentielle Rampen an, in der Regel gefolgt von Plateau und einem C t-Wert. Negative Stichproben zeigen flache Amplifikationsdiagramme ohne C t-Werte an (Abbildung 1A). Der C t-Wert wird automatisch von der Software berechnet, obwohl dieser überprüft und bei Bedarf manuell geändert werden sollte.</li>
		<li>Zweitens, analysieren Sie die Dissoziationskurvenergebnisse der Testproben zusammen mit den Kontrollproben. Eine positive Probe hat eine Schmelztemperatur (Tm) 77 – 80 °C und überlappt sich mit der Positivkontrolle Abbildung 1B).</li>
		<li>Rufen Sie das gesamtdiagnostische Ergebnis ab, indem Sie sicherstellen, dass die Steuerelemente gültig sind. Verwenden Sie Tabelle 4, um die Ergebnisse in Bezug auf die interne ß-Actin-Steuerung zu interpretieren. Wenn die Positivkontrollproben negativ und/oder die negativen Proben positiv sind, sollte der Lauf ignoriert werden.</li>
		<li>Notieren Sie die für die Kontroll-RNA erhaltenen C t- und T m-Werte in einer "Kontrollkarte", um Trendanalysen zu ermöglichen und Drifts in der Assayempfindlichkeit zu identifizieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>OIE. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OIE+Terrestrial+Manual+2018%22">OIE Terrestrial Manual 2018</a>. , 8-14 (2018).</li>
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<li>Wadhwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pan-Lyssavirus+Taqman+Real-Time+RT-PCR+Assay+for+the+Detection+of+Highly+Variable+Rabies+virus+and+Other+Lyssaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of Highly Variable Rabies virus and Other Lyssaviruses.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (1), e0005258(2017).</li>
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<li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Disease. 24 (4), 782-785 (2018).</li>
<li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland%5BTitle%5D)+AND+%22Transboundary+and+Emerging+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li>
<li>Hayman, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+real-time+assay+for+the+detection+of+Lyssaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).</li>
<li>Calisher, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+relationships+among+rhabdoviruses+from+vertebrates+and+hematophagous+arthropods%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Antigenic relationships among rhabdoviruses from vertebrates and hematophagous arthropods.</a> Intervirology. 30 (5), 241-257 (1989).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der beschriebene Pan-Lyssavirus-Echtzeit-RT-PCR-Assay ist ein geschlossener, einstufiger Assay, der Lyssaviren in allen drei Phylogruppen erkennt. Der Test wurde sowohl für die Tier- als auch für die menschliche Tollwutdiagnose validiert, einschließlich post-mortem Gehirngewebe (optimal Gehirnstamm) und Ante-Mortem-Proben wie Hautbiopsie, seriell gesammelter Speichel oder zerebrale Wirbelsäulenflüssigkeit (CSF). Die in diesem Test verwendeten Primer wurden zuerst für einen sondenbasierten Assay entwickelt und verwendet, um zwischen RABV, EBLV-1 und EBLV-23zu unterscheiden, die in vielen OIE-Tollwutlaboratorien verwendet wurde und in den EURL-Kompetenzschemata konstant funktioniert. Anschließend wurde die "Panlyssavirus"-Natur dieser Primer mit einem 2-stufigen Echtzeit-Assay15bestätigt. Der hier beschriebene Assay hat die Primer genutzt, um die RT-PCR in einem einstufigen SYBR-Assay weiter zu optimieren, der ein geschlossenes, schnelles System ermöglicht. Darüber hinaus hat die Ausbildung in tollwutendemischen Ländern, die diesen Test verwenden, die Eignung bestätigt, in jedem Labor mit grundlegenden PSA- und Qualitätssystemen zur Verringerung der Kreuzkontamination und Spurenproben, Einrichtungen zur Lagerung der Reagenzien und einer Echtzeit-Speicherung der Reagenzien und einer Echtzeit-Untersuchung zu implementieren. Maschine mit SYBR-Erkennung. Der Assay ist extrem robust und hat eine 100%ige Korrelation mit der FAT, mit verbesserter Empfindlichkeit für zersetzte Proben3. Einer der Hauptvorteile für einen DNA-Interkalierenden Farbstoff-basierten Assay im Vergleich zu einem sondenbasierten Assay sind die relativen Kosten. Ein weiterer Vorteil ist, dass der Assay nur zwei Primer verwendet, daher besteht ein geringeres Risiko einer fehlgeschlagenen Erkennung aufgrund von Sequenzabweichungen, was eine Schwäche in zuvor veröffentlichten sonsonenbasierten Assays war. Tatsächlich werden Vertreter aller Lyssavirus-Arten (mit Ausnahme von TWBLV und KBLV) mit diesem Test nachgewiesen, und die Sequenzanalyse von TWBLV und KBLV über die Primer-Sites zeigt keine signifikante Divergenz, die darauf hindeutet, dass sie auch mit diese Methode. Der Bereich der Nachweisgrenze, der bei den analysierten Viren beobachtet wird, kann als auf zwei Hauptfaktoren zurückzuführen sein. Die erste ist, dass die RNA aus klinischem Hirnmaterial isoliert wurde, daher ist die Menge der Genomkopien in jeder unverdünnten Probe nicht direkt vergleichbar. Die RNA wurde durch Die Einstellung der gesamten RNA auf 1 g/l "normalisiert"; der Anteil der viralen Genom-RNA innerhalb dieser Probe variiert jedoch. Die zweite ist die Vielfalt der Lyssavirus-Sequenzen, obwohl die Primer-Sites in konservierten Regionen liegen, gibt es weiterhin Positionen der Variation. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Mehrheit der Lyssaviren mit geringerer Empfindlichkeit für den Test Phylogruppe II und III Viren sind. Die Dissoziationskurvenanalyse stellt einen wesentlichen Parameter dar, der ein falsch positives Ergebnis minimiert, das andernfalls durch die Bildung von Primerdimermern oder die Verstärkung einer unspezifischen Region im Wirtsgenom auftreten könnte. In Wirklichkeit ist dies ein seltenes Ereignis und die Dissoziationskurvenanalyse entspricht dem Ausführen eines Agarose-Gels, um herkömmliche RT-PCR-Amplicons in korrekter Größe zu visualisieren. Der Bereich der akzeptablen T m-Werte wurde (77-80 °C) auf der Grundlage der in unserem Labor gesammelten Daten bereitgestellt. Es wird dringend empfohlen, dass einzelne Laboratorien interne Daten sammeln, um sicherzustellen, dass der Bereich übertragbar ist, und entsprechend geändert werden. Die Interpretation der Ergebnisse sowohl aus den Amplifikations- und Dissoziationsdiagrammen, als auch aus den positiven und negativen Kontrollen und den ß-Actin-Ergebnissen, ermöglicht robuste und reproduzierbare diagnostische Ergebnisse.
Außerhalb des Geltungsbereichs dieses Protokolls ist die RNA-Extraktionsmethode zur Gewinnung hochwertiger RNA. Alle in diesem Protokoll analysierten RNA wurde mit TRIzol erstellt; Es gibt jedoch viele geeignete Guanidium-basierte Extraktions-RNA-Extraktionsprotokolle, einschließlich Säulen- und Perlen-basierte Extraktionskits. Der Umgang mit Lyssavirus-positiven (oder vermuteten positiven) Proben muss sich in lizenzierten Biocontainment-Einrichtungen befinden, die innerhalb des Landes zugelassen sind. Die gesamte extrahierte RNA ist jedoch nicht infektiös und wird daher in Laboratorien mit niedrigem Containment behandelt. Je nach verwendeter Extraktionsmethode müsste die Anforderung zur Quantifizierung und Verdünnung der RNA bewertet werden. Für Phenol-basierte Extraktionen, einschließlich TRIzol, ist dieser Schritt erforderlich und verhindert, dass die Hemmung des Tests gDNA kontaminiert; Spalten- und Perlenextraktionen (insbesondere solche mit einem DNA-Abbaustadium) erfordern jedoch keine Verdünnung vor der Prüfung.
Während des gesamten Protokolls ist es wichtig, dass Sorgfalt und Sorgfalt eingesetzt werden, um Kreuzkontamination und genaue Zugabe von Proben zu den richtigen Brunnen zu verhindern. Eine Kalkulationstabelle mit den Reagenzienberechnungen und dem Plattenlayout steht als Zusatzdatei zum Download zur Verfügung. Gute Laborpraxis, einschließlich sauberer Arbeitsflächen, regelmäßiger Handwechsel, Verwendung von Barrierespitzen und verschiedenen Räumen/UV-Schränken, um jede Stufe zu trennen, minimiert die Gefahr einer Kontamination. Um sicherzustellen, dass der Test mit erwarteten Parametern durchgeführt wird, müssen positive und negative Steuerelemente einbezogen werden, und alle Testbeispiele werden in doppelter Ausführung (oder dreifach) ausgeführt.
Die Einbeziehung von Steuerungen ist ein wesentliches Merkmal jeder PCR, insbesondere für die Diagnose. Positive Control RNA wurde aus CVS (Challenge Virus Standard) infizierten Maushirnen in Chargen hergestellt und validiert und kalibriert, um konsistenzzwischen den Chargen zu gewährleisten. Die Kontroll-RNA wurde quantifiziert und auf 1 g/l verdünnt. RNA, für die ein positives Ergebnis in einer seriellen Verdünnung bis mindestens 10-4 (entspricht 100 pg/l) erzielt wurde, wurde als zweckdienlich angesehen. Die Positivkontroll-RNA wurde bei -80 °C in 10-1 Aliquots gespeichert. Bei Bedarf wurde ein Aliquot 1:100 verdünnt, um einen Arbeitsbestand bei 1 ng/l zur Verfügung zu stellen, und bei -80 °C in 5 L Einweg-Aliquots gelagert. Die verdünnte Positivkontroll-RNA wurde verwendet, um positive Proben auf niedrigem Niveau darzustellen und sicherzustellen, dass eine Verringerung der Empfindlichkeit des Assays nachgewiesen wurde. Für jede Steuerung wurde eine "Kontrollkarte" aufbewahrt, um die C t-Werte zu überwachen und Trends zu identifizieren (Tabelle 5). Tabelle 5 zeigte eine gute Inter-Run-Vergleichbarkeit für die CVS-Positivkontrollprobe Ct und T m-Werte über mehrere Tage und Operatoren und gab der Sicherheit, dass der Test robust und reproduzierbar ist. Ergebnisse, die von diesen Messungen abweichen, sollten untersucht und Bei Bedarf Proben wiederholt werden. Molekulares Wasser wurde in jedem Lauf als NTC enthalten, um zu bestätigen, dass die Reagenzien frei von Kontamination mit Lyssavirus-RNA waren und eine negative Probe bestätigen. Um die Wirksamkeit der RNA-Extraktion zu gewährleisten, wurde ß-Actin zusammen mit den Testproben in einem separaten Röhrchen getestet. Die Lyssavirus-Positivkontroll-RNA wurde auch zur ß-Actin-Positivkontrolle eingesetzt. Andere endogene Gene oder heterologe interne Kontrollsysteme können genutzt werden. Die Verwendung dieser Kontrollen stellte sicher, dass alle Schritte unter den gleichen Bedingungen wie die Testproben analysiert wurden. Gelegentlich, wenn die Probe stark abgebaut war oder nicht genügend Wirts-RNA (wie Speichel oder CSF) enthielt, kann das endogene Gen PCR versagen. In diesem Fall, wenn das Lyssavirus-Echtzeit-RT-PCR-Ergebnis positiv war, Bestätigung auf eine unabhängige RNA-Extraktion - eine Kontamination während der RNA-Extraktion auf dem ursprünglichen Test oder durch einen sekundären Test auszuschließen (entweder molekular, wie herkömmliche RT-PCR) oder FAT. Die Verwendung von Tabelle 4 bei der Analyse einer diagnostischen Probe sorgte für die korrekte Interpretation.
Ungeachtet des molekularen Assays zur Bestätigung der Tollwutinfektion sollten folgeuntersuchungen mit Sanger-Sequenzierung zur Bestimmung der Lyssavirus-Arten durchgeführt werden, und klassische Techniken in der Virologie wie FAT oder Virusisolation sollten ebenfalls durchgeführt werden, um weitere Viruscharakterisierung und unterstützen die Meldung positiver Fälle an OIE und WHO.

Die Diagnose von Tollwut mit molekularen Methoden wurde 2018 vom OIE akzeptiert1, wobei die Vorteile dieser Techniken bei der Bestätigung von Tollwutfällen, insbesondere in Situationen, in denen die Proben suboptimal sind, oder für die Ante-mortem-Diagnose anerkannt wurden, anerkannt wurden, da es keine Anforderung für lebende Viren oder frische Proben gibt. PCR-Assays für Lyssaviren erfordern eine Reverse-Transkription (RT), bevor PCR beginnen kann, da das Genom RNA ist. RT-PCR-Assays, die die proximale Region 3 des Genoms erkennen, gelten als die empfindlichsten, da transkriptionelle Gradienten während der Lyssavirus-Replikation auftreten. Häufig verwendete RT-PCR-Assays können grob in zwei Kategorien unterteilt werden: Endpunkt (oder Gel-basiert) und Echtzeit. Beide Ansätze sind sensibel und spezifisch; Der Echtzeit-Assay hat jedoch einige zusätzliche Vorteile, wie z. B. die Erzielung von Ergebnissen in "Echtzeit" und die Durchführung in einem vollständig geschlossenen Rohrsystem, wodurch das Potenzial für eine Kontamination durch den Bediener verringert wird. Es gibt zwei Hauptansätze, um Lyssavirus-spezifische Amplicons zu erkennen, die mit Echtzeit-Assays erhalten wurden. Die erste verwendet Hydrolysesonden (wie TaqMan-Sonden), die ein Fluorophor und einen Quencher enthalten. Wenn die Sonde während der Amplifikation an den Zielbereich bindet, führt die Exonukleaseaktivität der Polymerase zu einer Dissoziation von Fluorophor und Quencher, wodurch die resultierende Fluoreszenz gemessen werden kann. Die zweite verwendet einen DNA-Interkalierenden Farbstoff (Fluorchrom wie SYBR Green), der während der Amplifikation an doppelsträngige DNA bindet. Die gebundenen Fluorchrome emittieren Fluoreszenz, die bei jedem Zyklus erkannt wird, was eine Echtzeiterkennung und Quantifizierung des Produkts ermöglicht. Aufgrund der unspezifischen Bindung an jede dsDNA wird eine Dissoziationskurvenanalyse durchgeführt, um die Spezifität der Reaktion zu bestätigen. Echtzeit-RT-PCRs sind schnell aufgrund der kleinen Amplicon-Größen, in der Regel weniger als 200 bp in der Länge; Die Identifizierung geeigneter Regionen für die Auslegung von Primern und Sonden in konservierten Regionen kann sich jedoch als schwierig erweisen, daher ist es ein klarer Vorteil, die Anforderung an eine Sonde zu beseitigen.
Eine Reihe von Echtzeit-RT-PCRs wurden entwickelt, um einzelne Stämme oder Abstammungen von RABV2 gezielt zu erkennen und auch Lyssaviren der Gattung3,4,5,6, 7,8,9. Alle Assays haben eine Detektionsgrenze, abhängig davon, wie konserviert die Primer(und gegebenenfalls die Sonde) Sequenzen über die Gattung sind. Tatsächlich können neu auftretende oder neuartige Virusstämme die hochspezifischen sonsischen Assays unwirksam machen. Die Wahl der Echtzeit-Erkennung (Dye vs. Sonde) hängt von der beabsichtigten Anwendung ab. Für ein Labor, das die Überwachung von lokal genutztem Hirnmaterial durchführt und eine hohe Anzahl negativer Proben erwartet, ist die Verwendung des billigeren Interkalierenden Farbstoffs eine sinnvolle Wahl. Der SYBR Green-Ansatz wäre auch bei der Durchführung von Scan-Überwachungen optimal, bei denen das Vorhandensein neuartiger oder divergierender Lyssaviren durch eingeschränktere sondenbasierte Assays unentdeckt bleiben würde.
Alle Mitglieder der Gattung Lyssavirus verursachen die Krankheit Tollwut, die tödlich ist, sobald Symptome auftreten. Die überwiegende Mehrheit der Tollwutfälle bei Mensch und Tier ist auf das Tollwutvirus (RABV) zurückzuführen, das vorherrschende Reservoir ist der Haushund10. Fledermäuse sind wichtige Wirtsreservoirs für Lyssaviren und alle bis auf zwei lyssavirus Arten gekennzeichnet wurden direkt in Fledermäusen identifiziert — Ikoma lyssavirus (IKOV) und Mokola virus (MOKV) — und von diesen beiden, IKOV wurde spekuliert, um eine Fledermaus Host Reservoir haben 11. Neben den 16 anerkannten Lyssavirus-Arten12gibt es zwei Lyssaviren, die kürzlich beschrieben wurden: Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)13 und Kotalahti bat lyssavirus (KBLV)14. Lyssaviren können genetisch in drei Phylogruppen unterteilt werden, wobei die Mehrheit der Lyssaviren, einschließlich RABV, zur Phylogruppe I gehört. Die unterschiedlichsten Lyssaviren gehören jedoch zur Phylogruppe III und werden wahrscheinlich nicht von RT-PCRs nachgewiesen, die auf RABV- oder Phylogruppe-I-Virussequenzen abzielen.
Der hier beschriebene Assay verwendet das Echtzeit-Primerpaar JW12-N165, das erstmals 2005 beschrieben wurde3. Die Primer wurden als Pan-Lyssavirus entwickelt, obwohl die ursprüngliche Anwendung als TaqMan-Assay mit Sonden zur Differenzierung von Lyssavirus-Arten erfolgte. Spätere Bestätigung, dass das Primer-Paar pan-lyssavirus in Spezifität war erreicht wurde mit einem 2-stufigen SYBR-Echtzeit-Assay auf alle verfügbaren Lyssavirus-Arten einschließlich WCBV15. Das Primer-Paar wird hier in einem einstufigen RT-PCR-Echtzeittest unter Verwendung eines interkalierenden Fluorchroms beschrieben, das mit Vertretern aller 16 anerkannten Lyssavirus-Arten validiert wird. Dieser einstufige Echtzeit-Assay ist ein schneller, empfindlicher, Lyssavirus-spezifischer Test und zeigt, dass die Robustheit des Primers selbst sehr unterschiedliche Lyssavirus-Arten identifizieren kann.

<table><tbody><tr><td>Art Barrier Pipettenspitzen (verschiedene Größen)</td><td>Thermofisher</td><td>verschiedene</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Allegra 21R</td><td>Rotor für 96 Well-Platten erforderlich. Schritt 3.8.</td></tr><tr><td>Zentrifuge (mico)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipetten (zur Dosierung von 0,5-1.000 &Mikro; L)</td><td>Thermofisher</td><td>verschiedene</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5150</td><td>Gleichwertige Kits können verwendet werden, wenn</td></tr> validiert <tr><td>MX3000P oder MX3005P real-tme PCR-System</td><td>Stratagene</td><td>N/A</td><td>Gleichwertige Maschinen können verwendet werden, wenn validiert</td></tr><tr><td>MicroAmp Reaktionsplattenboden</td><td>Jeder geeignete</td><td></td><td>Wird verwendet, um Röhrchenstreifen und Platten sicher zu halten.</td></tr><tr><td>Optisch klare, flache, klare Streifen (8)</td><td>ABgene</td><td>AB-0866</td><td></td></tr><tr><td>Perfekter Rahmen (bei Verwendung von Rohrstreifen)</td><td>Stratagene</td><td>N/A</td><td>Spezifisch für maschinelle</td></tr><tr><td>Primer: Details zu den Primern siehe Tabelle 2.</td><td></td><td></td><td>Bestellt bei 0.05 &micro; HPLC im Maulwurfsmaßstab gereinigt.</td></tr><tr><td>Thermo-Fast 96 Well Plares, ohne Rand</td><td>ABgene</td><td>AB-600</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Fast Streifen (8) Thermo-Tubes</td><td>ABgene</td><td>AB-0452</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Maschine / Wirbelmischer</td><td>Fisons Wissenschaftliche Ausrüstung</td><td>SGP-202-010J</td><td></td></tr><tr><td>Sofern nicht anders angegeben, können alternative Geräte verwendet</td><td></td><td></td><td></td> werden</tr></tbody></table>

pan-lyssavirus echtzeit rt-pcr für tollwut-diagnose

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Molekulare Assays sind schnell, empfindlich und spezifisch und sind für die Diagnose von Tollwut zentral geworden. PCR-basierte Assays werden seit Jahrzehnten zur Bestätigung der Tollwutdiagnose verwendet, wurden aber erst vor kurzem vom OIE (World Organisation for Animal Health) als primäre Methode zum Nachweis von Tollwutinfektionen akzeptiert. Echtzeit-RT-PCR-Assays liefern Echtzeitdaten und sind geschlossene Röhrensysteme, wodurch das Risiko einer Kontamination während des Setups minimiert wird. DNA-Intercalating Fluorchrome-Echtzeit-RT-PCR-Assays erfordern keine teuren Sonden, wodurch die Kosten pro Probe minimiert werden, und wenn die Primer in konservierten Regionen entwickelt werden, assays, die spezifisch für Viren sind und nicht nur für ein Virus spezifisch sind. Arten sind möglich. Hier beschreiben wir einen Pan-Lyssavirus SYBR Echtzeit-RT-PCR-Assay, der Lyssaviren in der gesamten Gattung Lyssavirus erkennt, einschließlich der unterschiedlichsten Viren IKOV, WCBV und LLEBV. In Verbindung mit der Dissoziationskurvenanalyse ist dieser Test empfindlich und spezifisch, mit dem Vorteil, alle Lyssavirus-Arten zu detektieren. Der Test wurde in vielen diagnostischen Laboratorien mit qualitätsgesicherten Umgebungen übernommen, was eine robuste, schnelle und sensible Diagnose von Tollwutfällen bei Tieren und Menschen ermöglicht.

Diese Echtzeit-RT-PCR mit dsDNA interkalierenden Farbstoff ist geeignet, Lyssavirus-Infektionen zu diagnostizieren. Die Methode beginnt mit RNA, die aus Tollwut-Verdachtsproben für Ante-Mortem- oder Post-Mortem-Proben extrahiert wird, detaillierung der Master-Mix-Vorbereitung, RNA-Addition, Einrichtung der Echtzeitmaschine und korrekte Interpretation der Ergebnisse.

Pan-lyssavirus Echtzeit RT-PCR für Tollwut-Diagnose

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Diese Echtzeit-RT-PCR eignet sich zur schnellen Diagnose von Tollwut in Ante-mortem- und Post-Mortem-Proben. Die Pan-Lyssavirus-Primer wurden optimiert, um alle Mitglieder der Gattung Lyssavirus zu identifizieren. Dies ist ein schneller, empfindlicher und geschlossener Assay, der Viren aus der gesamten Gattung des Lyssavirus erkennt, einschließlich sehr unterschiedlicher Arten von klinischen Proben.Das OIE hat vor kurzem molekulare Assays akzeptiert, um Tollwutinfektionen zu melden. Dies ist besonders wichtig für zersetzte Proben, die nicht immer durch Viruskultur oder Antigennachweismethoden diagnostiziert werden können. Aufgrund der Empfindlichkeit dieses Tests ist eine gute Laborpraxis einschließlich der Trennung der verschiedenen Stufen unerlässlich, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren.Die Diagnose des Verfahrens wird Daisy Jennings sein, eine Diagnostikerin aus meinem Labor. Beginnen Sie mit der Quantifizierung der RNA mit einem Mikrovolumenspektrophotometer. Stellen Sie sicher, dass die Maschine auf RNA eingestellt ist, und verwenden Sie ein bis zwei Mikroliter molekularen Wassers, um die Maschine zu normalisieren und eine Basislinie zu erstellen.Messen Sie die RNA-Konzentration und passen Sie sie auf ein Mikrogramm pro Mikroliter an. Planen Sie das Layout Ihrer PCR-Platte mit einer Kalkulationstabelle unter Berücksichtigung von Test- und Steuermustern. Bereiten Sie eine PCR-Workstation vor, indem Sie Oberflächen desinfizieren, und schalten Sie das UV-Licht 10 Minuten vor dem Start ein, wenn Sie einen UV-Schrank verwenden.Entfernen Sie Reagenzien und Primer aus dem Gefrierschrank, um aufzutauen, aber halten Sie die Enzymmischung jederzeit auf Eis. Mischen Sie die Reagenzien und Zentrifuge kurz, um die Flüssigkeit zu sammeln. Bereiten Sie PCR-Master-Mischungen für Lyssavirus und Beta-Actin entsprechend den Manuskriptanweisungen vor.Lassen Sie die Master-Mischungen auf Eis, bis sie einsatzbereit sind. Mischen und zentrifugieren Sie die vorbereiteten Master-Mischungen und geben Sie 19 Mikroliter in die entsprechenden Brunnen der PCR-Maschinen-kompatiblen Platte oder Rohrleiste. In einem separaten Raum oder einem UV-Schrank vorsichtig einen Mikroliter der vorbereiteten RNA hinzufügen.Wenn Sie einen UV-Schrank verwenden, schalten Sie das UV-Licht 10 Minuten vor dem Start ein. Fügen Sie nach den Testbeispielen das Positivsteuerelement und das Steuerelement "Keine" hinzu. Wenn Sie die RNA zu den Master-Mixes hinzufügen, stellen Sie sicher, dass sie dem richtigen Brunnen hinzugefügt wird.Verwenden Sie einen Plattenplan, um diesen Schritt zu unterstützen. Versiegeln Sie die Platte, um zu überprüfen, ob die Deckel flach über der Platte sind, und drehen Sie sie nach unten, um die gesamte Flüssigkeit an der Unterseite der Brunnen zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass jeder Brunnen das gleiche Flüssigkeitsvolumen hat und keine Blasen sichtbar sind.Dann übertragen Sie die Proben auf die PCR-Maschine. Öffnen Sie das Programm, indem Sie SYBR Green mit Dissoziation auswählen. Wählen Sie die zu analysierenden Brunnen aus und wählen Sie unbekannt als Probentyp und SYBR als Fluoreszenzfarbstoff aus.Beschriften Sie die Brunnen auf dem Plattenlayout mit den Probeninformationen, einschließlich der Frage, ob der Test für Lyssavirus L oder Beta-Actin gilt. Klicken Sie auf thermoprofil-Setup und ändern Sie die thermischen Zyklusbedingungen, wie im Manuskript angegeben. Klicken Sie auf Start, und wählen Sie dann einen Speicherort aus, um die Datei zu speichern, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um die Lampe am Ende des Durchlaufs auszuschalten.Wenn die Option zum Starten vor dem Lampenaufwärmen angezeigt wird, klicken Sie jetzt auf Ausführen, stellen Sie jedoch sicher, dass die Lampe weniger als 15 Minuten zum Aufwärmen hat. Wenn der PCR-Lauf abgeschlossen ist, fahren Sie mit der Datenanalyse fort. Analysieren Sie zunächst die Amplifikationsdiagramme des Lyssavirus.Positive Stichproben zeigen exponentielle Rampen an, während negative Stichproben flache Amplifikationsdiagramme ohne CT-Werte aufweisen. Analysieren Sie anschließend die Ergebnisse der Lyssavirus-Dissoziationskurve der Testproben zusammen mit den Kontrollproben. Eine Lyssavirus-positive Probe hat eine Schmelztemperatur zwischen 77 und 80 Grad Celsius und überlappt sich mit der Positivkontrolle.Analysieren Sie als Nächstes die Beta-Actin-Verstärkungsdiagramme und Dissoziationskurven, die mit den Steuerelementen verglichen werden, um das Gesamtergebnis zu interpretieren. Zeigen Sie den Textbericht an, und verwenden Sie die Details, um die für die Kontroll-RNA erhaltenen CT- und TM-Werte in einer Kontrollkarte aufzuzeichnen, um zu bestätigen, dass der Lauf erfolgreich war und die Teststichprobenergebnisse gemeldet werden können. Dieses Protokoll wird verwendet, um die Empfindlichkeit des Pan-Lyssavirus RT-PCR auf einer RNA-Verdünnungsserie eines Kontrollstandardvirus zu demonstrieren.Die Verstärkungskurve zeigt an, dass nur 10 Piktogramme des Lyssavirus nachgewiesen werden können und die Dissoziationskurven die Schmelztemperatur des Produkts überprüfen. Die Schmelztemperatur wird verwendet, um zu bestätigen, dass das Amplikon Lyssavirus-spezifisch ist. Die Ergebnisse zeigen hier einen Schmelztemperaturbereich der Gattung Lyssavirus von 77,34 bis 79,67 Grad Celsius.Schmelztemperaturwerte unter 76,8 oder über 80,2 gelten als unspezifisch. Die Empfindlichkeit dieses RT-PCR-Assays wird auch durch den Nachweis von RNA aus drei Lyssavirus-positiven Gehirnproben bestimmt. Für zwei der drei Proben können nur 0,1 Piktogramme pro Mikroliter Ziel-RNA nachgewiesen werden.Insbesondere werden Vertreter aller anerkannten Lyssavirus-Arten mit diesem Test nachgewiesen. Bei der Analyse von RNA-Extrakten aus klinischen Proben wie Speichel oder CSF können Beta-Actin-Ergebnisse aufgrund eines Mangels an Wirtnukleinsäuren negativ sein. Die Hinzufügung einer exogenen Kontrolle kann dieses Problem lösen.Die Sequenzierung von Lyssavirus-positiven Proben wird empfohlen, um zusätzliche Informationen über die geografische und die wirtliche Herkunft einer Tollwutinfektion bereitzustellen. Der Umgang mit Lyssavirus-positiven oder vermuteten positiven Proben muss den örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien entsprechen. Die extrahierte RNA ist nicht infektiös und kann daher in Niedrigeinschließungslaboratorien behandelt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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