Pan-lyssavirus Echtzeit RT-PCR für Tollwut-Diagnose

Diese Echtzeit-RT-PCR eignet sich zur schnellen Diagnose von Tollwut in Ante-mortem- und Post-Mortem-Proben. Die Pan-Lyssavirus-Primer wurden optimiert, um alle Mitglieder der Gattung Lyssavirus zu identifizieren. Dies ist ein schneller, empfindlicher und geschlossener Assay, der Viren aus der gesamten Gattung des Lyssavirus erkennt, einschließlich sehr unterschiedlicher Arten von klinischen Proben.

Das OIE hat vor kurzem molekulare Assays akzeptiert, um Tollwutinfektionen zu melden. Dies ist besonders wichtig für zersetzte Proben, die nicht immer durch Viruskultur oder Antigennachweismethoden diagnostiziert werden können. Aufgrund der Empfindlichkeit dieses Tests ist eine gute Laborpraxis einschließlich der Trennung der verschiedenen Stufen unerlässlich, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren.

Die Diagnose des Verfahrens wird Daisy Jennings sein, eine Diagnostikerin aus meinem Labor. Beginnen Sie mit der Quantifizierung der RNA mit einem Mikrovolumenspektrophotometer. Stellen Sie sicher, dass die Maschine auf RNA eingestellt ist, und verwenden Sie ein bis zwei Mikroliter molekularen Wassers, um die Maschine zu normalisieren und eine Basislinie zu erstellen.

Messen Sie die RNA-Konzentration und passen Sie sie auf ein Mikrogramm pro Mikroliter an. Planen Sie das Layout Ihrer PCR-Platte mit einer Kalkulationstabelle unter Berücksichtigung von Test- und Steuermustern. Bereiten Sie eine PCR-Workstation vor, indem Sie Oberflächen desinfizieren, und schalten Sie das UV-Licht 10 Minuten vor dem Start ein, wenn Sie einen UV-Schrank verwenden.

Entfernen Sie Reagenzien und Primer aus dem Gefrierschrank, um aufzutauen, aber halten Sie die Enzymmischung jederzeit auf Eis. Mischen Sie die Reagenzien und Zentrifuge kurz, um die Flüssigkeit zu sammeln. Bereiten Sie PCR-Master-Mischungen für Lyssavirus und Beta-Actin entsprechend den Manuskriptanweisungen vor.

Lassen Sie die Master-Mischungen auf Eis, bis sie einsatzbereit sind. Mischen und zentrifugieren Sie die vorbereiteten Master-Mischungen und geben Sie 19 Mikroliter in die entsprechenden Brunnen der PCR-Maschinen-kompatiblen Platte oder Rohrleiste. In einem separaten Raum oder einem UV-Schrank vorsichtig einen Mikroliter der vorbereiteten RNA hinzufügen.

Wenn Sie einen UV-Schrank verwenden, schalten Sie das UV-Licht 10 Minuten vor dem Start ein. Fügen Sie nach den Testbeispielen das Positivsteuerelement und das Steuerelement "Keine" hinzu. Wenn Sie die RNA zu den Master-Mixes hinzufügen, stellen Sie sicher, dass sie dem richtigen Brunnen hinzugefügt wird.

Verwenden Sie einen Plattenplan, um diesen Schritt zu unterstützen. Versiegeln Sie die Platte, um zu überprüfen, ob die Deckel flach über der Platte sind, und drehen Sie sie nach unten, um die gesamte Flüssigkeit an der Unterseite der Brunnen zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass jeder Brunnen das gleiche Flüssigkeitsvolumen hat und keine Blasen sichtbar sind.

Dann übertragen Sie die Proben auf die PCR-Maschine. Öffnen Sie das Programm, indem Sie SYBR Green mit Dissoziation auswählen. Wählen Sie die zu analysierenden Brunnen aus und wählen Sie unbekannt als Probentyp und SYBR als Fluoreszenzfarbstoff aus.

Beschriften Sie die Brunnen auf dem Plattenlayout mit den Probeninformationen, einschließlich der Frage, ob der Test für Lyssavirus L oder Beta-Actin gilt. Klicken Sie auf thermoprofil-Setup und ändern Sie die thermischen Zyklusbedingungen, wie im Manuskript angegeben. Klicken Sie auf Start, und wählen Sie dann einen Speicherort aus, um die Datei zu speichern, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um die Lampe am Ende des Durchlaufs auszuschalten.

Wenn die Option zum Starten vor dem Lampenaufwärmen angezeigt wird, klicken Sie jetzt auf Ausführen, stellen Sie jedoch sicher, dass die Lampe weniger als 15 Minuten zum Aufwärmen hat. Wenn der PCR-Lauf abgeschlossen ist, fahren Sie mit der Datenanalyse fort. Analysieren Sie zunächst die Amplifikationsdiagramme des Lyssavirus.

Positive Stichproben zeigen exponentielle Rampen an, während negative Stichproben flache Amplifikationsdiagramme ohne CT-Werte aufweisen. Analysieren Sie anschließend die Ergebnisse der Lyssavirus-Dissoziationskurve der Testproben zusammen mit den Kontrollproben. Eine Lyssavirus-positive Probe hat eine Schmelztemperatur zwischen 77 und 80 Grad Celsius und überlappt sich mit der Positivkontrolle.

Analysieren Sie als Nächstes die Beta-Actin-Verstärkungsdiagramme und Dissoziationskurven, die mit den Steuerelementen verglichen werden, um das Gesamtergebnis zu interpretieren. Zeigen Sie den Textbericht an, und verwenden Sie die Details, um die für die Kontroll-RNA erhaltenen CT- und TM-Werte in einer Kontrollkarte aufzuzeichnen, um zu bestätigen, dass der Lauf erfolgreich war und die Teststichprobenergebnisse gemeldet werden können. Dieses Protokoll wird verwendet, um die Empfindlichkeit des Pan-Lyssavirus RT-PCR auf einer RNA-Verdünnungsserie eines Kontrollstandardvirus zu demonstrieren.

Die Verstärkungskurve zeigt an, dass nur 10 Piktogramme des Lyssavirus nachgewiesen werden können und die Dissoziationskurven die Schmelztemperatur des Produkts überprüfen. Die Schmelztemperatur wird verwendet, um zu bestätigen, dass das Amplikon Lyssavirus-spezifisch ist. Die Ergebnisse zeigen hier einen Schmelztemperaturbereich der Gattung Lyssavirus von 77,34 bis 79,67 Grad Celsius.

Schmelztemperaturwerte unter 76,8 oder über 80,2 gelten als unspezifisch. Die Empfindlichkeit dieses RT-PCR-Assays wird auch durch den Nachweis von RNA aus drei Lyssavirus-positiven Gehirnproben bestimmt. Für zwei der drei Proben können nur 0,1 Piktogramme pro Mikroliter Ziel-RNA nachgewiesen werden.

Insbesondere werden Vertreter aller anerkannten Lyssavirus-Arten mit diesem Test nachgewiesen. Bei der Analyse von RNA-Extrakten aus klinischen Proben wie Speichel oder CSF können Beta-Actin-Ergebnisse aufgrund eines Mangels an Wirtnukleinsäuren negativ sein. Die Hinzufügung einer exogenen Kontrolle kann dieses Problem lösen.

Die Sequenzierung von Lyssavirus-positiven Proben wird empfohlen, um zusätzliche Informationen über die geografische und die wirtliche Herkunft einer Tollwutinfektion bereitzustellen. Der Umgang mit Lyssavirus-positiven oder vermuteten positiven Proben muss den örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien entsprechen. Die extrahierte RNA ist nicht infektiös und kann daher in Niedrigeinschließungslaboratorien behandelt werden.