Generierung von Tumororganoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen von Prostatakrebs

Mausorganoidkulturen ähneln eher der in vivo Zellorganisation als traditionellen Zellkulturen. In der Krebsforschung modellieren Organoide den ursprünglichen Tumor besser als 2D-Zelllinien und können verwendet werden, um potenzielle Krebstherapien in vitro zu testen, um neue medikamentöse Behandlungen zu entwickeln. Für en bloc Extraktion der männlichen Maus urogenitalsystem greifen Sie das Fettpolster auf beiden Seiten der Blase und ziehen Sie nach oben, um den Hoden auszusetzen.

Sezieren Sie vorsichtig jeden Hoden vom Rest der Urogenitalregion entfernt. Heben Sie die Blase vorsichtig an, so dass der Urogenitalbereich zusammen erhöht wird, wodurch die Harnröhre darunter freigelegt wird. Während Des Haltens der Blase die Schere an der Unterseite der dorsalen Prostata ausrichten, um die Harnröhre zu indieren.

Die gesamte Urogenitalregion wird aus der Bauchhöhle befreit. Nach dem Entfernen des Urogenitalsystems werden die Beckenlymphknoten, die unmittelbar hinter dem Urogenitalsystem und auf beiden Seiten der Wirbelsäule positioniert sind, freigelegt. Um die Lymphknoten zu entfernen, orientieren gerade Zangen unter dem Lymphgewebe und ziehen Sie nach oben.

Als nächstes greifen Sie das Rektum mit den geraden Zangen und schneiden, ziehen auf dem Rektum, um den gesamten Dickdarm und Dünndarm zu entwirren, um nach metastasierenden Läsionen in den mesenterischen Lymphknoten zu suchen. Wenn das gesamte Ilium entfernt wurde, ziehen Sie weiter am Zwölffingerdarm, um den Magen freizulegen. Schneiden Sie die Speiseröhre, um den Magen vollständig zu entfernen.

Wenn metastasierende Läsionen in den Lymphknoten beobachtet werden, sezieren Sie diese Knoten vorsichtig vom Darm weg, um sie in PBS zu speichern. Wenn der Magen entfernt wurde, kann die Milz von der Rückenseite des Bauches geerntet werden, um sie in 4% Paraformaldehyd einzulagern. Entfernen Sie die Leber für die Lagerung in PBS.

Entfernen Sie die Nieren von beiden Seiten der Wirbelsäule zusammen mit allen Nierenlymphknoten, die metastasierende Läsionen enthalten. Um die Brusthöhle vorsichtig zu belichten, schneiden Sie das Zwerchfell entlang des Rippenkäfigs sorgfältig. Der in der Brusthöhle freigesetzte Unterdruck setzt Herz und Lunge frei.

Ziehen Sie auf das Brustbein, um die Brusthöhle weiter zu öffnen. Scannen Sie die ventrale Fläche der Brusthöhle entlang des Rippenkäfigs auf metastasierende Läsionen in den thorakalen Lymphknoten zur Zerlegung, falls vorhanden. Während Sie noch das Brustbein halten, schneiden Sie den ventralen Rippenkäfig ab, um auf das Herz und die Lunge zuzugreifen und das Herz hochzuziehen, um unter die Lunge zu schneiden.

Um das Herz und die Lunge en bloc vollständig zu entfernen, schneiden Sie alle vorderen Blutgefäße in der Luftröhre. Übertragen Sie das Herz vorsichtig, ohne das Lungengewebe oder die metastasierenden Lungenläsionen in einen Behälter mit PBS zu übertragen. Zur Zerlegung des Prostatatumors stellen Sie den Urogenitalbereich unter ein Dissektionsmikroskop.

Verwenden Sie ein Paar gerade Zangen und ein Paar gekrümmte Zangen, um den Urogenitalbereich auf seine dorsale Oberfläche zu kippen. Suchen Sie den proximalen Prostatabereich, der durch die rosarote Farbe der Harnröhre identifiziert werden kann. Greifen Sie die Harnröhre fest, um die Manipulation des Urogenitalgewebes mit den gekrümmten Zangen zu ermöglichen.

Suchen Sie die Basis der Samenbläschen, um ihre sorgfältige Entfernung zu ermöglichen. Dann verwenden Sie die gekrümmte Seite der Zange, um die Vas deferens und so viel Fett- und Bindegewebe wie möglich zu entfernen. Während Sie die Harnröhre und den proximalen Prostatabereich noch fest halten, verwenden Sie eine feine spitze Schere, um die Blase aus der Harnröhre zu entfernen.

Halten Sie die proximale Prostataregion und Harnröhre fest mit den geraden Zangen greifen die vordere Prostatabereich mit der gekrümmten Seite der Zange, um das Gewebe fest weg von der Blase und den Rest der Prostata zu ziehen. Legen Sie das vordere Prostatagewebe in PBS und lokalisieren Sie die ventrale Prostataregion. Entfernen Sie den ventralen Prostatabereich auf die gleiche Weise.

Wenn der seitliche Bereich von der dorsalen Region unterschieden werden kann, entfernen Sie den seitlichen Prostatabereich auf beiden Seiten. Entfernen Sie dann die dorsale Prostataregion und legen Sie die proximale Prostataregion in 4%Paraformaldehyd. Nach dem Hacken die Tumorstücke für eine eineinhalb- bis zweistündige Verdauung bei 37 Grad Celsius in eine 15-Milliliter-Röhre des Verdauungspuffers geben.

Am Ende der Verdauung das verdaute Gewebe durch Zentrifugation ablagern und den Überstand entsorgen. Streichen Sie das Rohr, um das Zellpellet zu lösen. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter vorgewärmtem Trypsin wieder auf, ergänzt mit 10 Mikromolaren Y-27632 ROCK-Hemmern für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.

Am Ende der Inkubation trituieren Sie die Gewebeschlämme fünfmal mit einer Standard-P1000 Pipettenspitze. Bringen Sie das Rohr für weitere fünf Minuten Inkubation und Trituration ins Wasserbad zurück. Für Matrix-Dome-Beschichtung waschen Sie die verdauten Zellen in neun Milliliter kaltem Medium, dann sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.

Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter frisches Medium zum Zählen aus. Und nach dem Zählen, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation wieder. Verdünnen Sie die Tumorzellen im entsprechenden Matrixvolumen.

Lassen Sie vorsichtig 200 Mikroliter Matrixzelllösung in jeden Brunnen einer 55 Grad Celsius erwärmten Sechs-Brunnen-Platte fallen. Lassen Sie die Kuppeln bei Raumtemperatur für zwei Minuten erstarren, bevor Sie die Platte 20 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius Inkubator auf den Kopf stellen. Wenn die Kuppeln vollständig verfestigt haben, fügen Sie zwei Milliliter Prostata-Organoid-Medium mit Androgen R1881 und ROCK-Hemmer zu jedem Brunnen ergänzt.

Geben Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück. Fluoreszierende Sezierbilder zeigen grünes fluoreszierendes Protein oder GFP-Expression durch feste Prostatatumoren, was darauf hinweist, dass die Tumorzellen Cre ausdrücken. Die Leber und die Lunge desselben Tieres weisen metastasierende Tumoren auf, die GFP ausdrücken und zeigen, dass diese Tumoren aus dem primären Prostatatumor stammen.

Der Beckenlymphknoten von dieser Maus drückt GFP und nicht Tomate aus, was darauf hindeutet, dass dieser metastasierende Tumor den Lymphknoten überholt hat und kein normales Gewebe übrig bleibt. Am ersten Tag der Kultur beginnen sich kleine Organoide, die aus einem soliden Prostatatumor erzeugt werden, mit Tomaten- und GFP-exemitten Zellen zu bilden, die in der Tumororganoidkultur vorhanden sind. Am siebten Tag und darüber hinaus, wenn sich die Prostatatumor-Organoide jedoch vollständig gebildet haben, exprimieren die Organoide GFP, aber nicht Tomate, was darauf hindeutet, dass die Organoide aus cre-exprimierenden Tumorzellen stammen und nicht aus normalen Epithelzellen.

Am ersten Tag der Kultur der kleinen Organoide aus flüssigkeitsgefüllten Prostatatumor sowohl Tomaten- als auch GFP-exemittierende Zellen sind innerhalb der Organoidkultur vorhanden. Organoide aus flüssigkeitsgefüllten Prostatatumoren drücken entweder GFP oder Tomate an Tag sieben und darüber hinaus aus, was darauf hindeutet, dass die Organoide aus Zellen gebildet wurden, die Cre nicht ausdrücken. Um sich bei der Ernte des Prostatagewebes zu orientieren, beachten Sie jederzeit die Blasen- und Harnröhrenpositionen.

Nach ihrer Entstehung können die Organoide in bildgebenden Anwendungen, molekularbiologischen Analysen und Medikamentenscreens eingesetzt werden.