Ein All-in-One-Probenhalter für makromolekulare Röntgenkristallographie mit minimaler Hintergrundstreuung

Dieser Probenhalter kann zum Anbau von Kristallen und zum Sammeln von Röntgenbeugungsdaten verwendet werden. Dieser Probenhalter wurde für den Einsatz auf 24-Well-Platten hergestellt, die in der MX-Community weit verbreitet sind. Der sehr wichtige Aspekt ist, dass keine Manipulation erforderlich ist.

Ein Musterhalter mit diesen hier beschriebenen Aspekten gab es vorher nicht. Etwas zu sehen ist immer viel besser, als nur darüber zu lesen. Durch das Ansehen des Videos kann ein potenzieller Benutzer die Funktionen und Feinheiten des neuen Probenhalters sofort erfassen.

Erstellen Sie zunächst eine saubere und staubfreie Oberfläche mit einem feuchten, fusselfreien Tuch. Nehmen Sie einen Probenhalter aus der Box und legen Sie ihn vorsichtig, gelbe Folie nach oben, auf die saubere Oberfläche, um Beschädigungen oder unerwünschte Einstiche der HINTERen COC-Folie zu vermeiden. Richten Sie die Kristallisationstropfen auf der gelben Folie ein, wie es auf häufig verwendeten Deckrutschen geschehen würde.

Legen Sie die Tropfen vorsichtig, um einen Bruch oder Piercing der Folie mit einer Pipette zu vermeiden. Bei Probenhaltern nach Typ 2 und Typ 3 sind zwei Tropfen das empfohlene Maximum. Auf einem Typ-1-Probenhalter können bis zu drei Tropfen platziert werden.

Drehen Sie den Probenhalter um und legen Sie ihn auf einen vorgefetteten Hohlraum einer 24-Well-Linbro-Platte. Verwenden Sie die Positionierhilfen des Probenhalters, um ihn in seine optimale Position zu führen. Stellen Sie die korrekte Position des Probenhalters sicher, um unerwünschte Verdunstung zu vermeiden.

Durch Platzieren der Kristallisationsplatte unter einem Transmissionslichtmikroskop, ohne oder ohne Polarisatoren, überwachen Sie das Kristallwachstum ohne Störung des Experiments. Führen Sie den Kryoschutz unter einem Transmissionslichtmikroskop durch. Durchbohren Sie die äußere COC-Folie vorsichtig mit einer feinen Kanüle.

Stellen Sie sicher, dass die innere gelbe Folie unberührt bleibt. Die Punktion sollte direkt neben dem Tropfen sein, der manipuliert werden soll. Legen Sie einen feinen Papierdocht in das gelochte Loch ein.

Schieben Sie den Docht vorsichtig nach vorne, bis er die gelbe Polyimidfolie berührt. Halten Sie den Docht in Kontakt mit der perforierten Folie. Der Docht saugt alle überschüssigen Lösungen weg.

Die Zeit, die für die vollständige Flüssigkeitsentfernung benötigt wird, hängt von der Viskosität der Lösungen und der Mutterlauge Zusammensetzung ab. Nachdem die Flüssigkeit weggesaugt wird, ziehen Sie den Papierdocht vorsichtig zurück. Denken Sie an die Position des Tropfens, da er nach dem Entfernen des Mutterlikörs möglicherweise nicht sichtbar ist.

Nehmen Sie eine Standardpipette, um ein kleines Volumen an kryoschützender Lösung aufzutragen, indem Sie eine extrudierte Spitze durch das gleiche Loch verwenden. Um die selbstheilende COC-Folie wieder zu versiegeln, legen Sie etwa eine Sekunde lang vorsichtig einen geschützten Finger auf das Loch und schieben Sie ihn über die Punktion. Der leichte Druck in Kombination mit der erhöhten Temperatur fördert die Wiederversiegelung von Punktionen, die nicht zu groß sind.

Lösen Sie den Liganden in Mutterlauge in der gewünschten Konzentration in einem Reaktionsrohr. Drehen Sie die Lösung für 10 Minuten bei 12.000 mal g, um unlösliche Partikel zu entfernen. Verwenden Sie bei Bedarf eine temperaturgeregelte Zentrifuge.

Mit einer langen, extrudierten Pipettenspitze maximal drei Mikroliter Liganden-haltige Lösung in den Spalt zwischen der COC-Folie und der Polyimidfolie legen; die Spitze einfahren. Um die selbstheilende COC-Folie wieder zu versiegeln, legen Sie etwa eine Sekunde lang vorsichtig einen geschützten Finger auf das Loch und schieben Sie ihn über die Punktion. Inkubieren Sie das Experiment für einige Zeit, um eine Diffusion über die Membran zu ermöglichen.

Die Einweichzeit hängt stark von der Viskosität der Streulösung und ihrer Komponenten ab. Wiederholen Sie die Ligandeneinweichschritte mehrmals, um anschließend verschiedene Liganden einzuweichen. Um die Lösungsmittelstreuung zu minimieren, entfernen Sie überschüssige Lösung vor der Datenerfassung.

Sorgen Sie für eine stabile, feuchtigkeitsgesteuerte Beamline-Umgebung mit vorab festgelegten Bedingungen. Um die In-situ-Beugungsdatenerfassung bei Umgebungstemperatur durchzuführen, heben Sie die transparente COC-Folie an der vorgesehenen Stelle vorsichtig mit Zangen an und ziehen Sie sie ab. Heben Sie nun den Probenhalter vorsichtig aus seinem Hohlraum und legen Sie ihn sofort in eine vorgefertigte magnetische Probenhalterbasis ein.

Für diesen Schritt ist kein Kleber erforderlich. Tragen Sie sanften Druck auf, um die korrekte Positionierung des Probenhalters innerhalb der Basis zu gewährleisten. Bei Probenhaltern mit abnehmbarem Außenring sanften Druck ausüben, indem Sie den äußeren Ring festhalten und an den vorgesehenen Bruchstellen abbrechen.

Die Stichprobe ist nun für die Zentrierung und Beugungsdatenerfassung bereit. Montieren Sie den Probenhalter auf einem Beamline-Goniometer und sorgen Sie für eine korrekte Positionierung des Halters. Je nach Goniometergeometrie kann der Probenhalter um bis zu 160 Grad gedreht werden, ohne dass während des Beugungsexperiments Schatten verursacht wird.

Verwenden Sie einen Papierdocht und berühren Sie vorsichtig die gelbe Polyimidfolie von der Rückseite, um überschüssige Mutterlauge zu entfernen. Die Stichprobe ist nun für die Zentrierung und Beugungsdatenerfassung bereit. Bereiten Sie sich auf die Erfassung der In-situ-Beugungsdaten bei kryogener Temperatur wie bei Umgebungstemperatur vor, tauchen Sie die Probe dann in flüssigen Stickstoff und übertragen Sie sie in eine SPINE-kompatible Durchstechflasche.

Die Geometrie der Probenhaltertypen 2 und 3 ermöglicht deren Übertragung in Standard-SPINE-Probenfläschchen, die für die robotergestützte Probenmontage verwendet werden können. Der Probenhalter Typ 1 und Typ 2 wurden so konzipiert, dass sie auf einen Brunnen einer 24-Well-Linbro-Platte passen. Jeder einzelne Probenhalter enthält Positionierhilfen auf beiden Seiten der Außenfelge, um eine optimale Positionierung am Rand des Brunnens zu gewährleisten.

Eine 24-Well Linbro-Stil Platte wurde mit dem Typ 1 Probenhalter verwendet, um einen Tropfen bei 293 Kelvin gegen 500 Mikroliter Mutterlauge zu ausstatten. Kristalle von 40 bis 50 Mikrometern wurden nach fünf Stunden mit einem Transmissionslichtmikroskop mit oder ohne Polarisator beobachtet. Ein Probenhalter mit Hühnerei-weiß-Lysozym-Kristallen wurde in einen feuchtigkeitsgesteuerten Luftstrom auf HZB-MX-Beamline 14.3 gelegt.

Hier wird ein typisches Beugungsbild gezeigt. Es kann keine erhöhte Hintergrundstreuung auf dem Beugungsbild erkannt werden. Es ist entscheidend, dass Verunreinigungen der Polyimidfolie vermieden werden müssen.

Darüber hinaus ist es wichtig, dass der Probenhalter genau positioniert und die Kristallmanipulation sorgfältig durchgeführt wird. Der Probenhalter ermöglicht den Umgang mit sehr empfindlichen Kristallen, einer der wichtigsten Schritte in der mikromolekularen Kristallographie. Seine Verwendung verringert die Wahrscheinlichkeit, die Probe zu zerstören, stark.