Name: Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Erfahren Sie die Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und humaner Darmmikrobiota mit In-Vitro-Batchfermentationssystemen. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-Screening und diagnostische Anwendungen.

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Diese Studie wurde von der National Nature Science Foundation of China (Nr. 31741109), der Hunan Natural Science Foundation (Nr. 2018JJ3200) und dem Konstruktprogramm der angewandten charakteristischen Disziplin an der Hunan University of Science and Engineering finanziert. Wir danken LetPub (www.letpub.com) für seine sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission der Hunan University of Science and Engineering (Hunan, China) und der Zhejiang Gongshang University (Zhejiang, China).
1. Herstellung von Bakterien
<ol><li>Zubereitung von Bifidobacterium mittlerer Brühe<ol>
<li>Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in 950 ml destilliertem Wasser: Fleischextrakt, 5 g/L; Hefeextrakt, 5 g/L; Casein-Pepton, 10 g/L; Soytone, 5 g/L; Glukose, 10 g/L; K2HPO4, 2,04 g/L; MgSO47H2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 ml; Salzlösung, 40 ml (CaCl2.2H2O, 0,25 g/l; KH2PO4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); und Resazurin, 0,4 ml (2,5 mg/L). Stellen Sie den pH-Wert auf 6,8 mit 2 M NaOH ein.</li>
<li>Autoklav bei 121 °C für 15 min und lassen Sie die Brühe auf Raumtemperatur (RT) unter anaeroben Bedingungen abkühlen (10% H2, 10% CO2, 80% N2). Filtersterilisiertes Cystein-HCl (0,5 g/L) und Mupirocin (5 mg/L) zum Medium hinzufügen.</li>
</ol>
</li>
<li>Fügen Sie ein Aliquot (50 l) gefrorenes Bifidobacterium longum zu einem Kulturrohr mit 5 ml Bifidobacterium-Mediumbrühe unter anaeroben Bedingungen hinzu, dann Kultur in einem anaeroben Inkubator für 24 h bei 37 °C.</li>
</ol>2. Herstellung von bifidobakteriellen EPS
<ol><li>Vorbereitung des PYG-Agarmediums<ol>
<li>Kombinieren Sie folgendes: Pepton, 20 g/L; Hefeextrakt, 10 g/L; Glukose, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl2, 0,008 g/L; MgSO47H2O, 0,008 g/L; K2HPO4, 0,04 g/l; KH2PO4, 0,04 g/l; NaHCO3, 0,4 g/L; Agar, 12 g/L. Stellen Sie den pH-Wert mit 10 M NaOH auf 7,2 ein.</li>
<li>Autoklavieren Sie das Medium bei 121 °C für 15 min und kühlen Sie auf 50 °C. Dann, pro 1 L Medium, 0,5 ml filtersterilisierte Vitamin K1 Lösung (1 g Vitamin K1 gelöst in 99 ml 99% Ethanol), 5 ml Häminlösung (0,5 g Hämin gelöst in 1 ml 1 mol/L NaOH , dann bis zu 100 ml mit destilliertem Wasser) und 0,5 g Cystein-HCl.</li>
<li>Vor dem Gießen der PYG-Platten, fügen Sie filtersterilisierte 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-D-Galactopyranosid (X-Gal, 0,06 g/L), LiCl-3H2 O(5,7 g/L) und Mupirocin (5 mg/L) auf das Medium. HINWEIS: X-Gal und LiCl.3H2O ermöglichen die Identifizierung von B. LongumKolonien auf Platten über Färbungsänderungen.</li>
</ol>
</li>
<li>20 L B. Longum-Stämme (Schritt 1.2) auf PYG-Platten impfen und 72 h bei 37 °C in einen anaeroben Inkubator geben.</li>
<li>Sammeln Sie Mukoid-Bakterienkolonien aus den PYG-Platten mit einem Wägelöffel, dann vollständig in 10 ml Phosphat-gepufferter Kochsaline (PBS) mit einem Wirbeloszillator wieder aufsetzen. HINWEIS: Die Bakteriellen und EPS-Mischungen sollten vollständig durch Wirbeln oder Pipettieren nach oben und unten wiederholt resuspendiert werden, bis die Fasern vollständig in PBS gelöst sind.</li>
<li>Zentrifugieren Sie die Suspension bei 6.000 x g für 5 min.</li>
<li>Die Überstande vorsichtig auf ein neues Zentrifugenrohr übertragen und durch wiederholte Inversion und Mischung vollständig mit drei Volumen kaltem 99% Ethanol vermischen.</li>
<li>Zentrifugieren Sie die Mischung bei 6.000 x g für 5 min und entfernen Sie die Überräube vollständig.</li>
<li>Entfernen Sie die Ausscheide aus den Zentrifugenrohren, indem Sie die EPS-Extrakte über Nacht mit einem Geschwindigkeitsvakuum kratzen und trocknen.</li>
</ol>3. Herstellung des Fermentationsmediums
<ol><li>Vorbereitung des Grundkulturmediums VI<ol>
<li>Kombinieren Sie folgendes: Pepton, 3 g/L; Trypton, 3 g/L; Hefeextrakt, 4,5 g/L; Mucin, 0,5 g/L; Gallensalze Nr. 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl2bei 6H2O, 4,5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl2.6H2O, 0,2 g/L; KH2PO4, 0,4 g/l; MgSO4bei 7H2O, 3,0 g/L; MnCl24H2O, 0,32 g/L; FeSO47H2O, 0,1 g/L; CoSO47H2O, 0,18 g/L; CaCl22 H2O, 0,1 g/L; ZnSO4bei 7H2O, 0,18 g/L; CuSO4bei 5H2O, 0,01 g/L; und NiCl26H2O, 0,092 g/L. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 mit 1 M HCl ein.</li>
<li>Bereiten Sie Hämin und Cystein wie in Abschnitt 2.1 getan und nach dem Autoklavieren und Kühlen hinzufügen.</li>
</ol>
</li>
<li>Bereiten Sie Kulturmedien vor, die verschiedene Kohlenstoffquellen enthalten, mit einem VI-Basismedium. Vor dem Autoklavieren 8 g/L Bif EPS-Fasern zu Medium VI hinzufügen, bestehend aus Gruppe VI_Bif. Fügen Sie außerdem 8 g/L Stärke zu Medium VI hinzu, um Die Gruppe VI_Starch darzustellen. Schließlich wird Medium VI ohne Zugabe einer Kohlenstoffquelle als Steuerung verwendet (Gruppe VI). HINWEIS: Bif EPS und Stärke werden zunächst in heißem Wasser mit einem magnetischen Rührer gelöst und dann mit vorbereitetem VI-Medium gemischt.</li>
<li>Alle Medien bei 121 °C für 15 min autoklavieren und auf RT abkühlen lassen.</li>
<li>Übertragen Sie eine Unterprobe (5 ml) jedes Mediums in Kulturröhren in einem anaeroben Inkubator und lagern Sie die restlichen Medien bei 4 °C.</li>
</ol>4. Humane Fäkalienprobenvorbereitung
<ol><li>Sammeln Sie frische Fäkalienproben unmittelbar nach frischer Defäkation von gesunden erwachsenen menschlichen Freiwilligen mit Kotbehältern und anschließend für die Güllezubereitung. HINWEIS: Vor der Probenentnahme sollten alle Freiwilligen gescreent werden, um sicherzustellen, dass antibiotika, probiotische oder präbiotische Behandlungen mindestens 3 Monate vor der Entnahme von Proben nicht erhalten werden. Darüber hinaus müssen alle Spender eine informierte, schriftliche Zustimmung erteilen.</li>
<li>Eine frische Fäkalienprobe (1 g) auf 10 ml 0,1 M anaerobe PBS (pH 7,0) in Glasbecher geben, dann Glasstäbe verwenden, um eine 10% (w/v) Gülle zuzubereiten.</li>
<li>Verwenden Sie ein 0,4 mM Großes Sieb, um die Fäkalienschlämme zu filtern. Verwenden Sie dann eine Unterprobe der gefilterten Gülle, um Diefermentationsexperimente zur Chargenkultur zu impfen, und lagern Sie den Rest bei -80 °C für weitere Analysen. HINWEIS: Die Schritte 4.2–4.3 werden in einer anaeroben Kammer durchgeführt.</li>
</ol>5. In-vitro-Chargenfermentation
<ol><li>In Schritt 3.2 in einer anaeroben Kammer hergestellte gefilterte Fäkalienschlämme (500 l) in das Fermentationsmedium geben und dann bei 37 °C inkubieren.</li>
<li>Sammeln Sie 2 ml fermentierte Proben bei 24 h und 48 h in der anaeroben Kammer und zentrieren Sie dann außerhalb der Kammer bei 6.000 x g für 3 min.</li>
<li>Übertragen Sie die Überstande sorgfältig auf ein neues Zentrifugenrohr, das für Polysaccharidabbauanalysen und kurzkettige Fettsäuren (SCFAs) verwendet wird.</li>
<li>Bewahren Sie die Zentrifugationspellets bei -80 °C auf und verwenden Sie anschließend die bakterielle genomische DNA-Extraktion.</li>
</ol>6. EPS-Abbau durch menschliche Fäkalienmikrobiota
<ol><li>0,2 l fermentierte Überstoffe auf vorbeschichtete Kieselgel-60 TLC-Aluminiumplatten geben und anschließend mit einem Haartrockner trocknen.</li>
<li>Entwickeln Sie die Platten in 20 ml einer Ameisensäure/n-Butanol/Wasser (6:4:1, v:v:v) Lösung und trocknen Sie mit einem Haartrockner.</li>
<li>Die Teller im Orcinol-Reagenz einweichen, um zu färben, dann trocknen Sie mit einem Haartrockner.<ol>
<li>Bereiten Sie Orcin-Reagenzien vor, indem Sie 900 mg Lichenol in 25 ml destilliertem Wasser auflösen und dann 375 ml Ethanol hinzufügen. Anschließend sollte konzentrierte Schwefelsäure langsam zugesetzt und die Lösung gründlich vermischt werden.</li>
</ol>
</li>
<li>Hitzeplatten bei 120 °C für 3 min im Backofen und bewerten Denkwert von EPS durch Messung von TLC-Bändern.</li>
</ol>7. Auswirkungen von EPS auf die menschliche Darmmikrobiota
<ol><li>Gefrieren Sie die in Schritt 4.3 hergestellten Originalfäkalienproben und die in Schritt 5.4 hergestellten fermentierten Proben.</li>
<li>Extrahieren Sie bakterielle genomische DNA (gDNA) aus allen Proben mit einem Stuhl bakterielle genomische DNA-Extraktionkit nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
<li>Bestimmen Sie DNA-Konzentrationen, Integrasse und Größenverteilungen mit einem Mikrospektrophotometer und einer Agargelelektrophorese.</li>
<li>Führen Sie PCR von bakteriellen 16S rRNA-Genen aus der extrahierten gDNA mit den zuvor beschriebenen Vorwärts- und Reverse-Primern12: -Vorwärtsgrundierung (Barcode-Primer 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA -Reverse Primer (806R): GGACTACHVGGWTCTAAT Verwenden Sie die folgenden thermischen Cycler-Bedingungen:<ol>
<li>94 °C für 5 min.</li>
<li>94 °C für 30 s.</li>
<li>55 °C für 30 s.</li>
<li>72 °C für 1 min.</li>
<li>Wiederholen Sie 2–4 für 35 Zyklen</li>
<li>72 °C für 5 min.</li>
<li>4 °C halten bis zum Entfernen aus dem thermischen Cycler.</li>
</ol>
</li>
<li>Führen Sie die Sequenzierung von PCR-Produkten mit hohem Durchsatz bei einem DNA-Sequenzierungsunternehmen mithilfe einer mikrobiellen Community-Analyse mit ultrahohem Durchsatz durch.</li>
<li>Erhalten Sie saubere, qualitativ hochwertige Sequenzen mit der Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) Sequenzanalysepipeline13.</li>
<li>Definieren Sie operative taxonomische Einheiten (OTUs) für 16S rRNA-Gensequenzen mit einer Nukleotidähnlichkeit von mehr als 97 % mithilfe von Bioinformatik-Tools wie der Mothur Software Suite14.</li>
<li>Wählen Sie aus jeder OTU eine repräsentative Sequenz aus, und verwenden Sie den RDP-Klassifikator zusammen mit der taxonomischen SILVA-Datenbank, um repräsentative Sequenzen15zu klassifizieren.</li>
<li>Berechnen Sie Goods Abdeckung, Alpha-Diversitätsmetriken (einschließlich Simpson- und Shannon-Index) und Reichtum (beobachtete Anzahl von OTUs) mit Bioinformatik-Tools16.</li>
</ol>8. Auswirkungen von EPS auf die SCFA-Produktion durch menschliche Darmmikrobiota
<ol><li>In Schritt 5,3 bis 2 ml Zentrifugenrohren fermentierte Überräube (1 ml) hinzufügen.</li>
<li>Fügen Sie 0,2 ml 25% (w/v) Metaphosphorsäure zu jeder der Proben hinzu und mischen Sie die Lösungen gründlich durch Wirbeln.</li>
<li>Zentrifugieren Sie die Mischungen bei 13.000 x g für 20 min und übertragen Sie die Überräube in frische Schläuche.</li>
<li>Gleichzeitig Lösungen von 120 mM Essig-, Propion-, Butyric-, isobutyric-, Valeric- und Isovalersäuren vorbereiten. Dann 1 ml jeder vorbereiteten Säure zu 1,2 ml 25% (w/v) Metaphosphorsäure hinzufügen und als Standardcocktails verwenden.</li>
<li>Filtern Sie die Proben mit einer 0,22-M-Membran.</li>
<li>SCFA-Konzentrationen mit Hochleistungsgaschromatographie gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen11,17erkennen. HINWEIS: Für die Gaschromatographie (GC) wird eine InertCap FFAP-Säule (0,25 mM x 30 m x 0,25 m) verwendet. Die SCFA-Konzentrationen werden dann anhand von Spitzenbereichen mithilfe der internen Single-Point-Standardmethode im GC Solution-Softwarepaket quantifiziert.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben. Die Zahlen wurden in Yin et al.zitiert. 11.

In den letzten zehn Jahren wurden bedeutende Fortschritte beim Verständnis der Zusammensetzung und Der Aktivitäten der menschlichen Darmmikrobiota erzielt. Als Folge dieser Studien ist das holobionische Konzept entstanden, das die Wechselwirkungen zwischen Wirten und assoziierten mikrobiellen Gemeinschaften darstellt, wie z.B. zwischen Menschen und ihrer Darmmikrobiota19,20. Darüber hinaus werden Menschen sogar jetzt als Superorganismen betrachtet<sup class="xref...

Gut Mikrobiota spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion des menschlichen Darms und in der Wirtgesundheit. Folglich sind Darmmikrobiota in letzter Zeit ein wichtiges Ziel für die Prävention und Therapie von Krankheiten geworden1. Darüber hinaus interagieren Darmbakterien mit Wirtsdarmzellen und regulieren grundlegende Wirtsprozesse, einschließlich stoffwechselnder Aktivitäten, Nährstoffverfügbarkeiten, Modulation des Immunsystems und sogar Gehirnfunktion und Entscheidungsfindung2,3 . Endobiotika haben erhebliches Potenzial, die bakterielle Zusammensetzung und Vielfalt der Darmmikrobiota zu beeinflussen. So, Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darm Mikrobiota haben zunehmende Forschungsaufmerksamkeitangezogen 4,5,6,7,8,9.
Es ist schwierig, Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und humaner Darmmikrobiota in vivo aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen zu bewerten. Zum Beispiel können Experimente, die die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota untersuchen, nicht ohne Erlaubnis der Food and Drug Administration durchgeführt werden, und die Rekrutierung von Freiwilligen ist teuer. Daher werden für solche Untersuchungen häufig Tiermodelle verwendet. Die Verwendung von Tiermodellen ist jedoch aufgrund unterschiedlicher Mikrobiotazusammensetzungen und Diversität in tier- und menschenverbundenen Gemeinschaften begrenzt. Eine alternative In-vitro-Methode zur Erforschung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota ist der Einsatz von Batch-Kulturexperimenten.
Exopolysaccharide (EPS) sind Präbiotika, die wesentlich zur Erhaltung der menschlichen Gesundheit beitragen10. Verschiedene EPS, die aus verschiedenen Monosaccharid-Zusammensetzungen und -Strukturen bestehen, können unterschiedliche Funktionen aufweisen. Frühere Analysen haben die Zusammensetzung der Bif EPS bestimmt, die das repräsentative Xenobiotikum sind, das in der aktuellen Studie11ins Visier genommen wird. Die wirtassoziierten metabolischen Effekte wurden jedoch hinsichtlich der EPS-Zusammensetzung und -Vielfalt nicht berücksichtigt.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet die fäkale Mikrobiota von 12 Freiwilligen, um Bif EPS zu fermentieren. Die Dünnschichtchromatographie (TLC), die 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und die Gaschromatographie (GC) werden dann in Kombination verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen EPS und humaner Darmmikrobiota zu untersuchen. Deutliche Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu In-vivo-Experimenten sind seine niedrigen Kosten und die Vermeidung von störenden Effekten aus dem Stoffwechsel des Wirts. Darüber hinaus kann das beschriebene Protokoll in anderen Studien verwendet werden, die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota untersuchen.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Membranfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>Zur Filterung von Proben</td></tr><tr><td>0,4-mm-Sieb</td><td>Thermo Fischer</td><td>308080-99-1</td><td>Zur Vorbereitung von menschlichen Stuhlproben</td></tr><tr><td>5-Brom-4-chlor-3-indolyl &beta;-D-Galactopyranosid (X-Gal)</td><td>Solarbio</td><td>X1010</td><td>Zur Vorbereitung der Farbplatte</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71251</td><td>Standardprobe für SCFA-Agar</td></tr><tr><td></td><td>Solarbio</td><td>YZ-1012214</td><td>Die Komponente der</td></tr><tr><td>Medium Anaerobe Kammer</td><td>Electrotek&nbsp;</td><td>AW 400SG</td><td>Bakterienkultur und Fermentation</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>SANYO</td><td>MLS-3750</td><td>Verwendung zum Autoklavieren</td></tr><tr><td>von Bacto Sojaton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70178</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>Backofen</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd</td><td>DHG-9240A</td><td>Zum Erhitzen und Backen</td></tr> von <tr><td>Rindfleischextrakt</td><td>Solarbio</td><td>G8270</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>Bifidobacterium longum Reuter</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; 51870&trade;</td><td>Bakterien</td></tr><tr><td>Gallensalze</td><td>Solarbio</td><td>YZ-1071304</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td></td><td>Buttersäure Sigma-Aldrich</td><td>19215</td><td>Standardprobe für SCFA</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Solarbio</td><td>C7250</td><td>Salzlösung des Mediums</td></tr><tr><td>Kapillarsäule</td><td>SHIMADZU-GL</td><td>InertCap FFAP (0,25 mm & mal 30 m - 0,25 % / mu; m)</td><td>Wird zur SCFA-Detektion</td></tr><tr><td>verwendet Kasein, Pepton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39396</td><td>Die Komponente der</td></tr><tr><td>Medium Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 8</td><td>Verwendung für die Zentrifugation</td></tr><tr><td>CoSO4.7H2O</td><td>Solarbio</td><td>C7490</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Solarbio</td><td>203165</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>Cystein-HCl</td><td>Solarbio</td><td>L1550</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td></td><td>Ethanol Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>Zur Herstellung von Vitamin K1</td></tr><tr><td>FeSO4.7H2O</td><td>Solarbio</td><td>YZ-111614</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>Wird für die DC-Gaschromatographie</td></tr><tr><td></td><td>verwendet Shimadzu Corporation</td><td>GC-2010 Plus</td><td>Wird für die SCFA-Detektion</td></tr><tr><td>von Glasbechern</td><td>verwendet Fisher Scientific</td><td>FB10050</td><td>Wird für die Schlammvorbereitung</td></tr><tr><td>verwendet Glukose</td><td>Solarbio</td><td>G8760</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>Haemin</td><td>Solarbio</td><td>H8130</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td>Basische Lösung zur Einstellung des pH-Werts der</td></tr><tr><td>Puffer Isobuttersäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46935-U</td><td>Standardprobe für SCFA</td></tr><tr><td>Isovaleriansäuren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>129542</td><td>Standardprobe für SCFA</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Solarbio</td><td>D9880</td><td>Salzlösung des Mediums</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Solarbio</td><td>P9921</td><td>Bestandteil des Mediums</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Solarbio</td><td>P7392</td><td>Salzlösung des Mediums</td></tr><tr><td>LiCl.3H2O</td><td>Solarbio</td><td>C8380</td><td>Zur Herstellung von Farbplatten</td></tr> verwenden <tr><td>Fleischextrakt</td><td>Sigma-Aldrich-Aldrich</td><td>70164</td><td>Bestandteil des Mediums</td></tr><tr><td>Metaphosphorsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7350</td><td>Standardprobe für SCFA</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Solarbio</td><td>M8160</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>MgSO47H2O</td><td>Solarbio</td><td>M8300</td><td>Salzlösung des Mediums</td></tr><tr><td>MISEQ</td><td>Illumina</td><td>MiSeq 300PE System</td><td>DNA-Sequenzierung</td></tr><tr><td>MnSO4. H20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8179</td><td>Salzlösung des Mediums</td></tr><tr><td>Mupirocin</td><td>Solarbio</td><td>YZ-1448901</td><td>Antibiotikum</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio</td><td>YZ-100376</td><td>Salzlösung des Mediums</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792519</td><td>Salzlösung des Mediums</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-2000</td><td>NanoDrop Technologies</td><td>ND-2000</td><td>Bestimmung der DNA-Konzentrationen</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30620</td><td>Basische Lösung zur Einstellung des pH-Werts der Puffer</td></tr><tr><td>n-Butanol</td><td>ChemSpider</td><td>71-36-3</td><td>Zur Gleichbehandlung</td></tr><tr><td>von NiCl2</td><td>Solarbio</td><td>746460</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>Orcinol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>447420</td><td>Zur Herstellung von Orcinol-Reagenzien</td></tr><tr><td>Propionic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94425</td><td>Standardprobe für SCFA</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Stool Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>51504</td><td>Extrakt bakterielle genomische DNA</td></tr><tr><td>Gebrauchsfertiges PBS-Pulver</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>A610100-0001</td><td>Zur Herstellung der Lipidsuspension</td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Solarbio</td><td>R8150</td><td>Anaerober</td></tr><tr><td>Gerätedrehzahl-Vakuumkonzentrator</td><td>LABCONCO</td><td>CentriVap</td><td>Zur Herstellung von EPSs</td></tr><tr><td>Stärke</td><td>Solarbio</td><td>YZ-140602</td><td>Zur Verwendung zur Kohlenstoffquelle</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>150692</td><td>Zur Herstellung von Orcin-Reagenzien</td></tr><tr><td>T100 PCR</td><td>BIO-RAD</td><td></td> 1861096 <td>PCR-Amplifikation</td></tr><tr><td>TLC-Aluminiumbleche</td><td>MerckMillipore</td><td>116835</td><td>Wird zur TLC</td></tr><tr><td>von Trypticase Pepton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z699209</td><td>verwendet Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Solarbio</td><td>T8360</td><td>Salzlösung des Mediums</td></tr><tr><td>Valeric</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75054</td><td>Standardprobe für SCFA</td></tr><tr><td>Vitamin K1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3501</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>Vortex-Oszillator</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex.Genie2</td><td>Verwendung zum Vortexen</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td>Die Komponente des Mediums</td></tr></tbody></table>

analyse von wechselwirkungen zwischen endobiotika und human gut microbiota mit in-vitro-badfermentationssystemen

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Menschliche Darmmikroorganismen sind in letzter Zeit zu einem wichtigen Ziel der Forschung bei der Förderung der menschlichen Gesundheit und der Prävention von Krankheiten geworden. Daher sind Untersuchungen von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika (z.B. Medikamente und Präbiotika) und Darmmikrobiota zu einem wichtigen Forschungsthema geworden. In-vivo-Experimente mit menschlichen Freiwilligen sind jedoch aufgrund von Bioethik und wirtschaftlichen Zwängen nicht ideal für solche Studien. Als Ergebnis wurden Tiermodelle verwendet, um diese Wechselwirkungen in vivo zu bewerten. Dennoch sind Tiermodellstudien nach wie vor durch bioethische Überlegungen begrenzt, zusätzlich zu unterschiedlichen Zusammensetzungen und Diversitäten von Mikrobiota bei Tieren und Menschen. Eine alternative Forschungsstrategie ist der Einsatz von Batch-Fermentationsexperimenten, die eine Bewertung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Darmmikrobiota in vitro ermöglichen. Zur Bewertung dieser Strategie wurden bifidobakterielle (Bif) Exopolysaccharide (EPS) als repräsentatives Xenobiotikum verwendet. Anschließend wurden die Wechselwirkungen zwischen Bif EPS und humaner Darmmikrobiota mit verschiedenen Methoden wie dünnschichtige Chromatographie (TLC), kompositorische Analyse der bakteriengemeinschaft mit 16S rRNA-Gen-Hochdurchsatzsequenzierung und Gaschromatographie untersucht. von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs). Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssystemen vorgestellt. Wichtig ist, dieses Protokoll kann auch geändert werden, um allgemeine Wechselwirkungen zwischen anderen Endobiotika und Darmmikrobiota zu untersuchen.

Die Produktion von Schleimhaut EPS konnte in B. Longumkulturen auf PYG-Platten nach anaeroben Inkubation für 72 h beobachtet werden (Abbildung 1A). Die Zentrifugierung von Kulturkratzen, gefolgt von Ethanolfällung und Trocknung, führte zur Sammlung zelluloseähnlicher EPS (Abbildung 1B). Getrocknetes EPS und lösliche Stärke wurden dann als Kohlenstoffquellen für Fermentationskulturen verwendet. TLC wurde für die Oligosaccharid-Trennung und Reinheitsanaly...

Beschrieben ist hier ein Protokoll, um die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssysteme zu untersuchen.

Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...

Unser Protokoll kann weit verbreitet für hohe Durchsatz und schnelle Screening der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darm Mikrobiota verwendet werden. Niedrige Kosten und Vermeidung von Interferenzeffekten aus dem Stoffwechsel des Wirts. Dieses Verfahren hat das Potenzial, bei der Diagnose verwendet zu werden.Lösen Sie zunächst BIF EPS und Stärke einzeln in heißem Wasser auf einem magnetischen Rührer, um sowohl die Konzentration von acht Gramm pro Liter zu machen. Fügen Sie im vorbereiteten Basiskulturmedium VI 100 Milliliter der BIF EPS-Lösung hinzu, um Kultur VI BIF-Lösung zu machen. Fügen Sie 100 Milliliter der Stärkelösung hinzu, um eine Stärkelösung für Kultur VI zu machen.Autoklavieren Sie die beiden Medien mit Kohlenstoffquelle und das Medium ohne Kohlenstoffquelle als Steuerung, bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen und Haymen und Cystein hinzufügen. Übertragen Sie eine Unterprobe von fünf Millilitern jedes Mediums in Kulturröhren.Und in einem anaeroben Inkubator aufbewahren. Bewahren Sie die restlichen Medien bei vier Grad Celsius auf. Zur Vorbereitung einer menschlichen Fäkalienprobe ein Gramm frischer Fäkalienprobe in 10 Milliliter 0,1 molare anaerobe PBS bei pH-Sieben in einem Glasbecher übertragen.Dann verwenden Sie eine Glasstange, um es zu rühren, um eine Gülle zu erreichen. In einer anaeroben Kammer 500 Mikroliter der gefilterten Fäkalienschlämme einzeln in die drei vorbereiteten Fermentationsmedien geben. Dann bei 37 Grad Celsius inkubieren.Nach 24 Stunden und 48 Stunden zwei Milliliter fermentierte Proben in der anaeroben Kammer sammeln. Und dann Zentrifuge außerhalb der Kammer bei 6000 mal G, für drei Minuten. Übertragen Sie die Überschärfungsmittel sorgfältig auf neue Zentrifugenröhrchen, die für Polysaccharidabbauanalysen und kurzkettige Fettsäuremessungen verwendet werden.Bewahren Sie die Zentrifugationspellets bei 80 Grad Celsius auf. 0,2 Mikroliter der fermentierten Überstoffe auf jedes vorbeschichtete Kieselgel 60 TLC Aluminiumplatte laden und wirbeln, um sich zu verbreiten. Dann verwenden Sie einen Haartrockner mit heißer Luft zu trocknen.Ein Ende der beprobten Platten in 20 Milliliter Ameisensäure:n-Butanol:Wasserlösung für einige Minuten eintauchen, bis sich die Elektrophorese fast bis zum anderen Ende erstreckt. Dann nehmen Sie die Teller mit Zange, und trocknen Sie mit einem Fön. Dann die Teller im Orcinol-Reagenz für zwei Minuten einweichen, um zu färben.Und wieder trocken. Die Teller bei 120 Grad Celsius in einen Backofen geben, um drei Minuten zu erhitzen. Dann fotografieren Sie die Platte, um den Abbau von EPS zu bewerten, indem Sie TLC-Bänder messen.Um die Auswirkungen von EPS auf die SCFA-Produktion zu untersuchen, fügen Sie einen Milliliter der fermentierten Überstoffe zu zwei Milliliter Zentrifugenröhren hinzu und fügen Sie 0,2 Milliliter von 25 Gewicht/Volumenprozent Metaphosphorsäure zu jeder Probe hinzu. Wirbel, um die Lösungen gründlich zu mischen. Zentrifugieren Sie die Mischungen bei 13.000 mal G für 20 Minuten.In der Zwischenzeit, bereiten Lösungen von 120 Millimolar Essig, propionischen, butyric, isobutyric, Valeric, und isovalerSäuren in Denröhrchen. Dann fügen Sie einen Milliliter jeder vorbereiteten Säure in ein Rohr mit 1,2 Millilitern von 25 Gewicht/Volumen Prozent Metaphosphorsäure. Und als Standard-Cocktails in die Probenflasche des Gaschromatographie-Instruments laden.Nehmen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und übertragen Sie die Überräube in frische Schläuche. Verwenden Sie eine Spritze mit 0,22 Mikron Filter, um die Überräube in neue Röhren für die Gaschromatographie-Analyse zu filtern. In dieser Studie wurde die Produktion von Schleimhaut EPS in Bifidobacterium-Longum-Kulturen auf PYG-Platten nach anaeroben Inkubation für 72 Stunden beobachtet.Die Zentrifugierung von Kulturkratzen, gefolgt von Ethanolfällung und Trocknung, führte zur Sammlung zelluloseähnlicher EPS. Die TLC-Analyse ergab, dass die Abbaurate von Stärke durch humane Fäkalienmikrobiota schneller war als die von BIF EPS. Die Hauptkoordinatenanalyse zeigt Kultur-VI-BIF- und Kultur-VI-Stärkegruppen, die getrennt voneinander gruppiert sind, was darauf hinweist, dass EPS und Stärkeverfügbarkeit menschliche Fäkalienbakteriengemeinschaften differenziell prägen.Lineare Diskriminantanalyse der Effektgröße zeigt, dass die Gattungen collinsella, coprococcus, Parabacteroides und Rhodopseudomonas in den Kultur-VI-BIF-Proben deutlich häufiger waren als in den Kultur-VI-Stärkeproben. Darüber hinaus zeigen GC-Messungen SCFAs, die aus Fermentationskulturen gemessen wurden, einschließlich Essig-, Propion-, isobutyric-, butyrisch,isovaler und Baldriansäuren. Nach der Gärung für 24 Stunden und 48 Stunden waren fünf der sechs SCFA-Konzentrationen ähnlich und unterschieden sich statistisch nicht zwischen den Gruppen Kultur VI BIF, Kultur VI Stärke und Kultur VI.Die Proprionsäurekonzentrationen waren jedoch in der Kultur-VI-BIF-Gruppe signifikant höher als in der Stärkegruppe Kultur VI nach 48 Stunden Gärung. Führen Sie dieses Experiment unter anaeroben Bedingungen durch und übertragen Sie die festen Proben dann so schnell wie möglich in einen anaeroben Inkubator. Einige der TLC-Reagenzien sind gefährlich.Sie sollten vorsichtig sein, sie zu verwenden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Ahmadi, S., et al. Ein In-vitro-Batch-Kulturmodell zur Abschätzung der Auswirkungen interventioneller Regimes auf die menschliche Stuhlmikrobiota. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video demonstriert eine Methode zur Modellierung der Darmmikrobieller Fermentation, indem Fäkalproben mit fermentierbaren Ballaststoffen unter anaeroben Bedingungen inkubiert werden, um die Produktion von Metaboliten durch die Darmmikrobiota zu untersuchen.

In vitro Batch-Culture-Modell zur Nachahmung der Colon-Fermentation durch die menschliche Darmmikrobiota

Quelle: Hu, Y. et al. Analyse der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota mittels In-vitro-Badefermentationssystemen. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert den Einsatz der Dünnschichtchromatographie (TLC) zur Bewertung des Abbaus von Exopolysacchariden (EPS) durch die menschliche Kokalmikrobiota. EPS-Fragmente in Fermentationssupernatanten werden anhand von Größe und Polarität mittels TLC getrennt und dann nach kohlenhydratspezifischer Färbung als farbige...

Durchführung von Dünnschichtchromatographie zur Beurteilung des bakteriellen Exopolysaccharidabbaus

Quelle: Hu, Y. et.al., Analyse der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlicher Darmmikrobiota mittels In-vitro-Badefermentationssystemen. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert die Analyse der kurzkettigen Fettsäureproduktion durch die menschliche Darmmikrobiota als Reaktion auf Exopolysaccharide. Dies unterstreicht die Trennung und Quantifizierung mikrobieller Fermentationsprodukte mittels Gaschromatographie. Die Ergebnisse zeigen, dass Exopolysaccharide mikrobielle Metabolite...

Untersuchung der mikrobiellen Aktivität des menschlichen Darms an Exopolysaccharide

In diesem Video beschreiben wir die Methodik für den Aufbau eines ex vivo Darmorgankultursystems, um die Wechselwirkungen zwischen Darmgewebefragmenten von Mäusen und spezifischen Darmbakterien zu untersuchen. Die Vorrichtung besteht aus zwei Paaren von Eingangs-Ausgangs-Anschlüssen, wobei das erste das Darmgewebelumen verbindet und die spezifische Bakteriensuspension in dieses zuführt, und das zweite kontinuierlich Medien zu den Vertiefungen  der Vorrichtung zuführt, um die Lebensfähigkeit des...

Ein ex vivo Darmorgankultursystem zur Untersuchung von Wirt-Mikrobiota-Interaktionen

Wir beschreiben ein in vitro - Protokoll zur Zusammenarbeit Kultur gut microbiome und Darmzotten für einen längeren Zeitraum einen menschlichen Darm-on-a-Chip - microphysiological System.

Co-Kultur des Lebens Microbiome mit mikro humanen intestinalen Villi in ein Gut-on-a-Chip-Mikrofluidik-Vorrichtung

Darm-Host-Mikroben-Interaktionen wurden bewertet, mit einem neuartigen Ansatz kombiniert eine synthetische mündliche Gemeinschaft, in-vitro- Magen-Darm-Verdauung und ein Modell der Dünndarm Epithel. Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die auszuwertende ZELLINVASION von Krankheitserregern und Multi-Spezies-Biofilmen oder sogar probiotischen Formulierungen Überlebensfähigkeit getestet angepasst werden kann.

Beurteilung der Lebensfähigkeit eines synthetischen bakterielle Konsortiums auf der In-vitro- Darm Host-Mikrobe Oberfläche

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Kultivierung der Darm Microbiota des Dickdarms in-vitro-, mit einer Reihe von Bioreaktoren, die die physiologischen Bedingungen des Magen-Darm-Trakt zu simulieren.

In-vitro-Kultivierung von Technologie, um den menschlichen Darm Microbiota studieren fortgeschrittene Anwendung

Dieses Protokoll beschreibt ein In-vitro-Batchkultur-Fermentationssystem menschlicher Fäkalienmikrobiota unter Verwendung von Inulin (einem bekannten Präbiotikum und einem der am häufigsten untersuchten Mikrobiotamodulatoren), um die Verwendung dieses Systems bei der Abschätzung der Interventionen auf fäkale Mikrobiota Zusammensetzung und metabolische Aktivitäten.

Ein In-Vitro-Batch-Kulturmodell zur Abschätzung der Auswirkungen interventionaler Regimen auf humane fäkale Mikrobiota

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Bioreaktor-Assemblierung für die kontinuierliche Kultivierung komplexer Stuhlgemeinschaften

Das Minibioreactor Array (MBRA) ist ein anpassbares Hochdurchsatz-Kultursystem mit kontinuierlichem Durchfluss, das die Kultivierung komplexer mikrobieller Gemeinschaften ermöglicht und parallele Experimente zur Untersuchung der Mikrobiomdynamik, therapeutischer Wechselwirkungen und mikrobieller Reaktionen auf Umweltfaktoren unterstützt.

Aktualisiertes Protokoll für den Aufbau und die Verwendung des Minibioreaktor-Arrays (MBRA)

Erfahren Sie die Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und humaner Darmmikrobiota mit In-Vitro-Batchfermentationssystemen. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-Screening und diagnostische Anwendungen.

Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen

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