Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen
23. August 2019
Beschrieben ist hier ein Protokoll, um die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssysteme zu untersuchen.
Unser Protokoll kann weit verbreitet für hohe Durchsatz und schnelle Screening der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darm Mikrobiota verwendet werden. Niedrige Kosten und Vermeidung von Interferenzeffekten aus dem Stoffwechsel des Wirts. Dieses Verfahren hat das Potenzial, bei der Diagnose verwendet zu werden.
Lösen Sie zunächst BIF EPS und Stärke einzeln in heißem Wasser auf einem magnetischen Rührer, um sowohl die Konzentration von acht Gramm pro Liter zu machen. Fügen Sie im vorbereiteten Basiskulturmedium VI 100 Milliliter der BIF EPS-Lösung hinzu, um Kultur VI BIF-Lösung zu machen. Fügen Sie 100 Milliliter der Stärkelösung hinzu, um eine Stärkelösung für Kultur VI zu machen.
Autoklavieren Sie die beiden Medien mit Kohlenstoffquelle und das Medium ohne Kohlenstoffquelle als Steuerung, bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen und Haymen und Cystein hinzufügen. Übertragen Sie eine Unterprobe von fünf Millilitern jedes Mediums in Kulturröhren.
Und in einem anaeroben Inkubator aufbewahren. Bewahren Sie die restlichen Medien bei vier Grad Celsius auf. Zur Vorbereitung einer menschlichen Fäkalienprobe ein Gramm frischer Fäkalienprobe in 10 Milliliter 0,1 molare anaerobe PBS bei pH-Sieben in einem Glasbecher übertragen.
Dann verwenden Sie eine Glasstange, um es zu rühren, um eine Gülle zu erreichen. In einer anaeroben Kammer 500 Mikroliter der gefilterten Fäkalienschlämme einzeln in die drei vorbereiteten Fermentationsmedien geben. Dann bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Nach 24 Stunden und 48 Stunden zwei Milliliter fermentierte Proben in der anaeroben Kammer sammeln. Und dann Zentrifuge außerhalb der Kammer bei 6000 mal G, für drei Minuten. Übertragen Sie die Überschärfungsmittel sorgfältig auf neue Zentrifugenröhrchen, die für Polysaccharidabbauanalysen und kurzkettige Fettsäuremessungen verwendet werden.
Bewahren Sie die Zentrifugationspellets bei 80 Grad Celsius auf. 0,2 Mikroliter der fermentierten Überstoffe auf jedes vorbeschichtete Kieselgel 60 TLC Aluminiumplatte laden und wirbeln, um sich zu verbreiten. Dann verwenden Sie einen Haartrockner mit heißer Luft zu trocknen.
Ein Ende der beprobten Platten in 20 Milliliter Ameisensäure:n-Butanol:Wasserlösung für einige Minuten eintauchen, bis sich die Elektrophorese fast bis zum anderen Ende erstreckt. Dann nehmen Sie die Teller mit Zange, und trocknen Sie mit einem Fön. Dann die Teller im Orcinol-Reagenz für zwei Minuten einweichen, um zu färben.
Und wieder trocken. Die Teller bei 120 Grad Celsius in einen Backofen geben, um drei Minuten zu erhitzen. Dann fotografieren Sie die Platte, um den Abbau von EPS zu bewerten, indem Sie TLC-Bänder messen.
Um die Auswirkungen von EPS auf die SCFA-Produktion zu untersuchen, fügen Sie einen Milliliter der fermentierten Überstoffe zu zwei Milliliter Zentrifugenröhren hinzu und fügen Sie 0,2 Milliliter von 25 Gewicht/Volumenprozent Metaphosphorsäure zu jeder Probe hinzu. Wirbel, um die Lösungen gründlich zu mischen. Zentrifugieren Sie die Mischungen bei 13.000 mal G für 20 Minuten.
In der Zwischenzeit, bereiten Lösungen von 120 Millimolar Essig, propionischen, butyric, isobutyric, Valeric, und isovalerSäuren in Denröhrchen. Dann fügen Sie einen Milliliter jeder vorbereiteten Säure in ein Rohr mit 1,2 Millilitern von 25 Gewicht/Volumen Prozent Metaphosphorsäure. Und als Standard-Cocktails in die Probenflasche des Gaschromatographie-Instruments laden.
Nehmen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und übertragen Sie die Überräube in frische Schläuche. Verwenden Sie eine Spritze mit 0,22 Mikron Filter, um die Überräube in neue Röhren für die Gaschromatographie-Analyse zu filtern. In dieser Studie wurde die Produktion von Schleimhaut EPS in Bifidobacterium-Longum-Kulturen auf PYG-Platten nach anaeroben Inkubation für 72 Stunden beobachtet.
Die Zentrifugierung von Kulturkratzen, gefolgt von Ethanolfällung und Trocknung, führte zur Sammlung zelluloseähnlicher EPS. Die TLC-Analyse ergab, dass die Abbaurate von Stärke durch humane Fäkalienmikrobiota schneller war als die von BIF EPS. Die Hauptkoordinatenanalyse zeigt Kultur-VI-BIF- und Kultur-VI-Stärkegruppen, die getrennt voneinander gruppiert sind, was darauf hinweist, dass EPS und Stärkeverfügbarkeit menschliche Fäkalienbakteriengemeinschaften differenziell prägen.
Lineare Diskriminantanalyse der Effektgröße zeigt, dass die Gattungen collinsella, coprococcus, Parabacteroides und Rhodopseudomonas in den Kultur-VI-BIF-Proben deutlich häufiger waren als in den Kultur-VI-Stärkeproben. Darüber hinaus zeigen GC-Messungen SCFAs, die aus Fermentationskulturen gemessen wurden, einschließlich Essig-, Propion-, isobutyric-, butyrisch,isovaler und Baldriansäuren. Nach der Gärung für 24 Stunden und 48 Stunden waren fünf der sechs SCFA-Konzentrationen ähnlich und unterschieden sich statistisch nicht zwischen den Gruppen Kultur VI BIF, Kultur VI Stärke und Kultur VI.
Die Proprionsäurekonzentrationen waren jedoch in der Kultur-VI-BIF-Gruppe signifikant höher als in der Stärkegruppe Kultur VI nach 48 Stunden Gärung. Führen Sie dieses Experiment unter anaeroben Bedingungen durch und übertragen Sie die festen Proben dann so schnell wie möglich in einen anaeroben Inkubator. Einige der TLC-Reagenzien sind gefährlich.
Sie sollten vorsichtig sein, sie zu verwenden.
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Übersicht
Dieses Protokoll untersucht die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und der menschlichen Darmmikrobiota unter Verwendung von in-vitro-Partiellfermentationssystemen. Es ist für eine Hochdurchsatz- und schnelle Untersuchung konzipiert und minimiert Störungen durch den Wirtsstoffwechsel.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Darmgesundheit
- Metabolomik
Hintergrund
- Endobiotika spielen eine entscheidende Rolle für die menschliche Gesundheit.
- Die Darmmikrobiota beeinflusst maßgeblich die Stoffwechselprozesse.
- Das Verständnis dieser Wechselwirkungen kann bei der Diagnostik helfen.
- Aktuelle Methoden können durch Störungen des Wirtsstoffwechsels eingeschränkt sein.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Untersuchung von Endobiotika-Mikrobiota-Wechselwirkungen.
- Ermöglichung eines Hochdurchsatz-Screenings dieser Wechselwirkungen.
- Bereitstellung einer kostengünstigen Alternative für die Forschung.
Verwendete Methoden
- Lösen von BIF-EPS und Stärke in heißem Wasser.
- Herstellung von Kulturmedien für die Fermentation.
- Verwendung von Batch-Fermentationssystemen für Interaktionsstudien.
- Überwachung der Wirkungen von Endobiotika auf die Darmmikrobiota.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung von BIF-EPS- und Stärkelösungen.
- Einrichtung eines zuverlässigen Fermentationsprotokolls.
- Nachweis des diagnostischen Potenzials des Protokolls.
- Erkenntnisse zu den Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Mikrobiota.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet ein wertvolles Werkzeug für die Mikrobiota-Forschung.
- Es kann das Verständnis metabolischer Interaktionen erleichtern.
- Zukünftige Anwendungen könnten die diagnostischen Möglichkeiten verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht ein hochdurchsatzfähiges, kostengünstiges In-vitro-Screening von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und dem Mikrobiom des Darms, wodurch die Abhängigkeit von Tierversuchen verringert und Störungen durch den Wirtsstoffwechsel minimiert werden. Es unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsphasen, indem es quantitative Daten zu Veränderungen der mikrobiellen Gemeinschaft und zur Metabolitproduktion liefert, die entscheidend sind, um mikrobiommodulierende Therapeutika risikoärmer zu gestalten. Der Ansatz ist direkt auf präklinische Entdeckungsworkflows anwendbar, bei denen das mechanistische Verständnis der Wirkstoff-Mikrobiota-Effekte die Auswahl der Leitverbindungen und Portfolioentscheidungen beeinflusst.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung, wie Endobiotika wie Präbiotika oder Arzneimittel menschliche Darmbakteriengemeinschaften beeinflussen, und unterstützt die Überprüfung gezielter Hypothesen.
- Operationaler Wert: Verwendet zugängliche Methoden wie die 16S-rRNA-Sequenzierung und die Quantifizierung kurzkettiger Fettsäuren (SCFA), um reproduzierbare, mechanistisch aussagekräftige Daten zu generieren.
- Prädiktiver Wert: Unterscheidet mikrobielle Reaktionen auf strukturell unterschiedliche Kohlenhydrate (z. B. EPS vs. Stärke) und unterstützt so die Beurteilung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet standardisierte anaerobe Fermentationsbedingungen zur konsistenten Bewertung der mikrobiotamediierten Abbauleistung von Verbindungen.
- Operativer Wert: Aufgrund der einfachen Probenvorbereitung und skalierbarer Nachweismethoden wie Dünnschichtchromatographie und Gaschromatographie kompatibel mit Hochdurchsatzformaten.
- Einsatzbereitschaft des Assays: Erzeugt quantifizierbare Ergebnisse (SCFA-Profile, Veränderungen der Mikrobiota-Zusammensetzung), die zum Vergleich der Wirkung von Verbindungen über verschiedene Screening-Kampagnen hinweg verwendet werden können.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Relevanz: Verwendet humanes fäkales Inokulum, wodurch die Relevanz für die menschliche Physiologie im Vergleich zu Tiermodellen erhöht wird.
- Mechanistische Ent风险bewertung: Identifiziert spezifische mikrobielle Reagierende (z. B. Collinsella, Coprococcus) auf Endobiotika und unterstützt so einen biomarkergekoppelten Wirkmechanismus.
- Vorklinische Kontinuität: Ermöglicht die dosis- und zeitabhängige Profilierung (24 h/48 h) zur Ableitung von Sicherheits- und Wirksamkeitsfenstern in späteren Modellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein, insbesondere für mikrobiomaktive Verbindungen, bei denen das Verständnis der mikrobiotamediierten Metabolisierung entscheidend für die Vorhersage des in-vivo-Verhaltens ist.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die hypothesengetriebene Untersuchung von Endobiotika, indem die Exposition gegenüber Verbindungen mit messbaren Veränderungen in der mikrobiellen Zusammensetzung und Funktion verknüpft wird.
- Screening: Ermöglicht eine schnelle Beurteilung von Mikrobiota-Interaktionen mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) zur Analyse des Polysaccharidabbaus und Gaschromatographie (GC) zur Quantifizierung kurzkettiger Fettsäuren (SCFA) als voneinander unabhängige Messgrößen.
- Analytik: Erzeugt multivariate Daten (16S-Sequenzierung, SCFA-Konzentrationen), die statistische Vergleiche der Behandlungseffekte und die Identifizierung signifikanter Verschiebungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verwendet aus menschlichem Ursprung stammende Mikrobiota, wodurch die Vorhersagekraft für die klinische Übertragung im Vergleich zu Mausmodellen verbessert wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Protokoll ist auf verschiedene Endobiotika (Arzneistoffe, Präbiotika, Polysaccharide) übertragbar und stellt somit eine wiederverwendbare Plattform über verschiedene therapeutische Bereiche hinweg dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen bei Wechselwirkungen zwischen Mikrobiota und Endobiotika durch direkte Beobachtung von Abbaumustern und der reagierenden Mikroben.
- Operativer Wert: Geringe Kosten, anaerobes Arbeitsverfahren und standardisierte Probennahme verbessern die Reproduzierbarkeit und den Vergleich zwischen verschiedenen Laboren.
- Strategischer Wert: Ermöglicht frühere Go/No-Go-Entscheidungen, indem mikrobiota-vermittelte Stoffwechselvorgänge erkannt werden, die die Wirksamkeit oder Toxizität eines Wirkstoffs verändern könnten.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf deren Auswirkungen auf nützliche Mikrobiota und SCFA-Profile.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in anaerober Mikrobiologie und steriler Technik, um die Probenechtheit zu gewährleisten.
- Benötigt Zugang zu Dünnschichtchromatographie-Platten, Gaschromatographie und Infrastruktur für die 16S-rRNA-Sequenzierung zur vollständigen Analyse.
- Die Standardisierung zwischen verschiedenen Laboren setzt eine konsistente Aufbereitung von Stuhlproben und gleichbleibende anaerobe Inkubationsbedingungen voraus.
- Die Anpassung an andere Endobiotika erfordert Löslichkeits- und Stabilitätsprüfungen unter Fermentationsbedingungen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Variabilität der Mikrobiota von Spendern sowie die sorgfältige Handhabung gefährlicher Reagenzien für die Dünnschichtchromatographie (z. B. Orcinol, Ameisensäure).
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Preparation of Fermentation Medium and Human Fecal Sample
1:48
In Vitro Batch Fermentation
2:33
EPS Degradation by Human Fecal Microbiota
3:29
Effects of EPS on SCFA (Short-chain Fatty Acids) Production by Human Intestinal Microbiota
4:41
Results: Degradation by Fermentation
6:24
Conclusion
