Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen
August 23rd, 2019
Beschrieben ist hier ein Protokoll, um die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darmmikrobiota mit In-vitro-Batch-Fermentationssysteme zu untersuchen.
Unser Protokoll kann weit verbreitet für hohe Durchsatz und schnelle Screening der Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und menschlichen Darm Mikrobiota verwendet werden. Niedrige Kosten und Vermeidung von Interferenzeffekten aus dem Stoffwechsel des Wirts. Dieses Verfahren hat das Potenzial, bei der Diagnose verwendet zu werden.
Lösen Sie zunächst BIF EPS und Stärke einzeln in heißem Wasser auf einem magnetischen Rührer, um sowohl die Konzentration von acht Gramm pro Liter zu machen. Fügen Sie im vorbereiteten Basiskulturmedium VI 100 Milliliter der BIF EPS-Lösung hinzu, um Kultur VI BIF-Lösung zu machen. Fügen Sie 100 Milliliter der Stärkelösung hinzu, um eine Stärkelösung für Kultur VI zu machen.
Autoklavieren Sie die beiden Medien mit Kohlenstoffquelle und das Medium ohne Kohlenstoffquelle als Steuerung, bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen und Haymen und Cystein hinzufügen. Übertragen Sie eine Unterprobe von fünf Millilitern jedes Mediums in Kulturröhren.
Und in einem anaeroben Inkubator aufbewahren. Bewahren Sie die restlichen Medien bei vier Grad Celsius auf. Zur Vorbereitung einer menschlichen Fäkalienprobe ein Gramm frischer Fäkalienprobe in 10 Milliliter 0,1 molare anaerobe PBS bei pH-Sieben in einem Glasbecher übertragen.
Dann verwenden Sie eine Glasstange, um es zu rühren, um eine Gülle zu erreichen. In einer anaeroben Kammer 500 Mikroliter der gefilterten Fäkalienschlämme einzeln in die drei vorbereiteten Fermentationsmedien geben. Dann bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Nach 24 Stunden und 48 Stunden zwei Milliliter fermentierte Proben in der anaeroben Kammer sammeln. Und dann Zentrifuge außerhalb der Kammer bei 6000 mal G, für drei Minuten. Übertragen Sie die Überschärfungsmittel sorgfältig auf neue Zentrifugenröhrchen, die für Polysaccharidabbauanalysen und kurzkettige Fettsäuremessungen verwendet werden.
Bewahren Sie die Zentrifugationspellets bei 80 Grad Celsius auf. 0,2 Mikroliter der fermentierten Überstoffe auf jedes vorbeschichtete Kieselgel 60 TLC Aluminiumplatte laden und wirbeln, um sich zu verbreiten. Dann verwenden Sie einen Haartrockner mit heißer Luft zu trocknen.
Ein Ende der beprobten Platten in 20 Milliliter Ameisensäure:n-Butanol:Wasserlösung für einige Minuten eintauchen, bis sich die Elektrophorese fast bis zum anderen Ende erstreckt. Dann nehmen Sie die Teller mit Zange, und trocknen Sie mit einem Fön. Dann die Teller im Orcinol-Reagenz für zwei Minuten einweichen, um zu färben.
Und wieder trocken. Die Teller bei 120 Grad Celsius in einen Backofen geben, um drei Minuten zu erhitzen. Dann fotografieren Sie die Platte, um den Abbau von EPS zu bewerten, indem Sie TLC-Bänder messen.
Um die Auswirkungen von EPS auf die SCFA-Produktion zu untersuchen, fügen Sie einen Milliliter der fermentierten Überstoffe zu zwei Milliliter Zentrifugenröhren hinzu und fügen Sie 0,2 Milliliter von 25 Gewicht/Volumenprozent Metaphosphorsäure zu jeder Probe hinzu. Wirbel, um die Lösungen gründlich zu mischen. Zentrifugieren Sie die Mischungen bei 13.000 mal G für 20 Minuten.
In der Zwischenzeit, bereiten Lösungen von 120 Millimolar Essig, propionischen, butyric, isobutyric, Valeric, und isovalerSäuren in Denröhrchen. Dann fügen Sie einen Milliliter jeder vorbereiteten Säure in ein Rohr mit 1,2 Millilitern von 25 Gewicht/Volumen Prozent Metaphosphorsäure. Und als Standard-Cocktails in die Probenflasche des Gaschromatographie-Instruments laden.
Nehmen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und übertragen Sie die Überräube in frische Schläuche. Verwenden Sie eine Spritze mit 0,22 Mikron Filter, um die Überräube in neue Röhren für die Gaschromatographie-Analyse zu filtern. In dieser Studie wurde die Produktion von Schleimhaut EPS in Bifidobacterium-Longum-Kulturen auf PYG-Platten nach anaeroben Inkubation für 72 Stunden beobachtet.
Die Zentrifugierung von Kulturkratzen, gefolgt von Ethanolfällung und Trocknung, führte zur Sammlung zelluloseähnlicher EPS. Die TLC-Analyse ergab, dass die Abbaurate von Stärke durch humane Fäkalienmikrobiota schneller war als die von BIF EPS. Die Hauptkoordinatenanalyse zeigt Kultur-VI-BIF- und Kultur-VI-Stärkegruppen, die getrennt voneinander gruppiert sind, was darauf hinweist, dass EPS und Stärkeverfügbarkeit menschliche Fäkalienbakteriengemeinschaften differenziell prägen.
Lineare Diskriminantanalyse der Effektgröße zeigt, dass die Gattungen collinsella, coprococcus, Parabacteroides und Rhodopseudomonas in den Kultur-VI-BIF-Proben deutlich häufiger waren als in den Kultur-VI-Stärkeproben. Darüber hinaus zeigen GC-Messungen SCFAs, die aus Fermentationskulturen gemessen wurden, einschließlich Essig-, Propion-, isobutyric-, butyrisch,isovaler und Baldriansäuren. Nach der Gärung für 24 Stunden und 48 Stunden waren fünf der sechs SCFA-Konzentrationen ähnlich und unterschieden sich statistisch nicht zwischen den Gruppen Kultur VI BIF, Kultur VI Stärke und Kultur VI.
Die Proprionsäurekonzentrationen waren jedoch in der Kultur-VI-BIF-Gruppe signifikant höher als in der Stärkegruppe Kultur VI nach 48 Stunden Gärung. Führen Sie dieses Experiment unter anaeroben Bedingungen durch und übertragen Sie die festen Proben dann so schnell wie möglich in einen anaeroben Inkubator. Einige der TLC-Reagenzien sind gefährlich.
Sie sollten vorsichtig sein, sie zu verwenden.
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Überblick
Dieses Protokoll untersucht die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und der menschlichen Darmmikrobiota unter Verwendung von in-vitro-Batch-Fermentationssystemen. Es ist für ein Hochdurchsatz- und schnelles Screening konzipiert und minimiert dabei die Interferenz durch den Wirtsstoffwechsel.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrobiologie
- Darmgesundheit
- Metabolomik
Hintergrund
- Endobiotika spielen eine entscheidende Rolle für die menschliche Gesundheit.
- Die Darmmikrobiota beeinflusst Stoffwechselprozesse erheblich.
- Das Verständnis dieser Wechselwirkungen kann bei der Diagnostik helfen.
- Aktuelle Methoden können durch Interferenzen des Wirtsstoffwechsels eingeschränkt sein.
Zweck der Studie
- Ein Protokoll für die Untersuchung von Endobiotika-Mikrobiota-Wechselwirkungen zu entwickeln.
- Ein Hochdurchsatz-Screening dieser Wechselwirkungen zu ermöglichen.
- Eine kostengünstige Alternative für die Forschung bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Auflösen von BIF EPS und Stärke in heißem Wasser.
- Herstellung von Kulturmedien für die Fermentation.
- Verwendung von Batch-Fermentationssystemen für Wechselwirkungsstudien.
- Überwachung der Auswirkungen von Endobiotika auf die Darmmikrobiota.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Herstellung von BIF EPS- und Stärkelösungen.
- Aufbau eines zuverlässigen Fermentationsprotokolls.
- Demonstration des Potenzials des Protokolls für diagnostische Zwecke.
- Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Mikrobiota.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet ein wertvolles Werkzeug für die Mikrobiota-Forschung.
- Es kann das Verständnis von Stoffwechselwechselwirkungen erleichtern.
- Zukünftige Anwendungen können die diagnostischen Fähigkeiten verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput, low-cost in vitro screening of endobiotic-gut microbiota interactions, reducing reliance on animal models and minimizing host metabolism interference. It supports early-stage target validation by providing quantitative data on microbial community shifts and metabolite production, which are critical for de-risking microbiome-modulating therapeutics. The approach is directly applicable to preclinical discovery workflows where mechanistic understanding of compound-microbiota effects informs lead selection and portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how endobiotics like prebiotics or drugs modulate human gut bacterial communities, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Uses accessible methods such as 16S rRNA sequencing and SCFA quantification to generate reproducible, mechanistically informative data.
- Predictive Value: Differentiates microbial responses to structurally distinct carbohydrates (e.g., EPS vs. starch), aiding in structure-activity relationship assessments.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized anaerobic fermentation conditions for consistent evaluation of microbiota-mediated compound degradation.
- Operational Value: Compatible with high-throughput formats due to simple sample preparation and scalable readouts like TLC and GC.
- Assay Readiness: Generates quantifiable outputs (SCFA profiles, community shifts) that can be used to compare compound effects across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses human fecal inoculum, enhancing relevance to human physiology compared to animal models.
- Mechanistic De-risking: Identifies specific microbial responders (e.g., Collinsella, Coprococcus) to endobiotics, supporting biomarker-linked mechanism of action.
- Preclinical Continuity: Enables dose- and time-dependent profiling (24h/48h) to inform safety and efficacy windows in later models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for microbiome-active compounds where understanding microbiota-mediated metabolism is essential for predicting in vivo behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of endobiotics by linking compound exposure to measurable changes in microbial composition and function.
- Screening: Enables rapid assessment of microbiota interactions using TLC for polysaccharide degradation and GC for SCFA quantification as orthogonal readouts.
- Analytics: Generates multivariate data (16S sequencing, SCFA concentrations) that allow statistical comparison of treatment effects and identification of significant shifts.
- Translational Research: Uses human-derived microbiota, improving predictive confidence for clinical translation over murine models.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to various endobiotics (drugs, prebiotics, polysaccharides), making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in microbiota-endobiotic interactions through direct observation of degradation patterns and microbial responders.
- Operational Value: Low cost, anaerobic workflow, and standardized sampling improve reproducibility and cross-lab comparability.
- Strategic Value: Enables earlier go/no-go decisions by flagging microbiota-mediated metabolism that could alter drug efficacy or toxicity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their impact on beneficial microbiota and SCFA profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in anaerobic microbiology and sterile technique to maintain sample integrity.
- Needs access to TLC plates, gas chromatography, and 16S rRNA sequencing infrastructure for full readout panel.
- Standardization across labs requires consistent fecal donor processing and anaerobic incubation conditions.
- Adaptation to other endobiotics necessitates solubility and stability testing under fermentation conditions.
- Practical limitations include variability in donor microbiota and the need for careful handling of hazardous TLC reagents (e.g., orcinol, formic acid).
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Preparation of Fermentation Medium and Human Fecal Sample
1:48
In Vitro Batch Fermentation
2:33
EPS Degradation by Human Fecal Microbiota
3:29
Effects of EPS on SCFA (Short-chain Fatty Acids) Production by Human Intestinal Microbiota
4:41
Results: Degradation by Fermentation
6:24
Conclusion
