Name: Injektion von Gryllus bimaculatus Eiern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Lernen Sie die Injektion von Gryllus bimaculatus Eiern für Entwicklungsbiologie und genomische Manipulation. Diese flexible Methode ermöglicht RNA-Interferenz-Studien und liefert zuverlässige Ergebnisse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die in diesem Projekt berichtete Forschung wurde durch einen Institutional Development Award (IDeA) des National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Fördernummer P20GM10342 bis HH3 und durch die NSF-Vergabenummer IOS-1257217 an Cge.

1. Hardware-Einrichtung und -Vorbereitung von Materialien
HINWEIS: Zur Vorbereitung von Lösungen, Reagenz und Ausstattungsdetails finden Sie in Tabelle 1 und Materialtabelle.
<ol><li>Richten Sie ein Sezieren des Mikroskops ein, um Eier zu sehen und die Injektionsnadel zu führen. (Abbildung1A zeigt ein mit Fluoreszenz ausgestattetes Sezierendes Mikroskop.) Fluoreszenzfähigkeit ist vorteilhaft, aber nicht notwendig.</li>
	<li>Positionieren Sie einen 3-Achsen-Mikromanipulator, um die Injektionsnadel an Ort und Stelle zu manövrieren (Abbildung 1A).</li>
	<li>Richten Sie einen Mikroinjektor mit Schläuchen und einem Nadelhalter ein, um kleine Mengen Material zu injizieren (Abbildung 1A). Verwenden Sie optional ein Fußpedal, das in der Abbildung nicht dargestellt ist.</li>
	<li>Entwerfen und erstellen Sie einen Stempel, um Bohrungen für Eier zu erstellen (Abbildung 1C), indem Sie die Umkehrung des gewünschten Musters drucken, entweder mit einem 3D-Drucker oder einem Lasergravierer. HINWEIS: Der gezeigte 3D-gedruckte Musterstempel ist 4,5 cm x 5 cm mit 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm Vorsprung zur Herstellung individueller Brunnen. Details, wie man eine Vielzahl von anpassbaren Formen zu machen wurden an anderer Stelle veröffentlicht16.</li>
	<li>10x Injektionspuffer, HEPES gepufferte Saline (HBS) und eine Stammlösung aus Tetramethylrhodamin Dextran Farbstoff vorbereiten und bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Vorbereiten sie experimentelle Lösungen, die injiziert werden sollen, wie dsRNA, CRISPR/Cas912, transponierbare Elemente, in vitro gekappte mRNA7,8, pharmakologische Wirkstoffe17, ZFNs oder TALENS9.</li>
	<li>Legen Sie Doppelklebeband auf mehrere Schichten Standard-Laborband auf einem Glasmikroskop-Dia, um eine Plattform 1 mm oder so über dem Glasschlitten zu erstellen, die zum Halten von Nadeln für die Bewertung verwendet wird.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Cricket-Behälter ca. 40 cm x 60 cm größe mit einem Deckel mit einer mesh-bedeckten Öffnung für die Luftzirkulation.</li>
	<li>Fügen Sie Lebensmittel, Wasser und schutzbeschützende Materialien hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie mehrere Dutzend gesunde männliche und weibliche erwachsene Grillen. Identifizieren Sie erwachsene Cricket durch die Anwesenheit von Flügeln. HINWEIS: Eine Reihe von post-imaginalen Alter kann die Eierträge erhöhen. Die Dichte der Grillen sollte relativ hoch sein, um genug Eier für ein Experiment sammeln zu können, aber nicht so überfüllt, dass Kannibalismus auftritt. Zum Beispiel sollten etwa zwei Dutzend gesunde Grillen, mit einem ungefähr gleichen Verhältnis von Mann zu Frau, in einem Behälter der oben genannten Größe ausreichen, um etwa 200 Eier in einem Ein- bis Zwei-Stunden-Zeitraum zu sammeln. Grillen können bei Raumtemperatur gehalten werden, aber Entwicklung und Verhalten sind optimal, wenn Grillen in einem warmen (23,5–26 °C), feuchten (40 - 60% relativen Luftfeuchtigkeit) Brutkasten gehalten werden.</li>
</ol>2. Herstellung von Nadeln für die Injektion
<ol><li>Verwenden Sie Borosilikatglaskapillaren mit Filament (siehe Tabelle der Materialien für Größendetails). Bereiten Sie die Zugnadeln am selben Tag oder bis zu einigen Tagen vor der Injektion vor.</li>
	<li>Legen Sie ein Kapillarglas in den Puller, zentrieren Sie das Glas auf das Filament, und ziehen Sie die Knöpfe, um das Glas an Ort und Stelle zu sichern.</li>
	<li>Stellen Sie die Abziehertemperatur in der Nähe der Glasrampentemperatur (-5 °C bis +10 °C) ein.</li>
	<li>Verwenden Sie ein einstufiges Hochwärmeprotokoll, um eine lange Verjüngung mit einer kleinen Öffnung zu ziehen, aber vermeiden Sie das Schmelzen der endenliegenden Enden geschlossen. HINWEIS: Verwenden Sie z. B. bei Verwendung des Mikropipette-Ziehers, der in der Tabelle der Materialien mit einem Kastenfilament ausgestattet ist, die folgenden Parameter für Glas mit einer Rampentemperatur von 478: Hitze 478; Ziehen 45; Vel 75; Del 120. Die optimalen Bedingungen für die Herstellung einer Nadel mit der in Abbildung 2B dargestellten Form sollten von jedem Anwender empirisch bestimmt werden.</li>
	<li>Nadelspitzen zur Vorbereitung auf die Injektionen abschrägen.</li>
	<li>Befeuchten Sie die Spinnschleiferebene des Kegels (Abbildung 2A) mit tropfendem Wasser. Verwenden Sie entweder Umkehrosmose (RO) oder Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltes destilliertes Wasser.</li>
	<li>Legen Sie die gezogene Nadel in den Verweser und drehen Sie sie in einen 20°-Winkel.</li>
	<li>Senken Sie die Nadel, bis sie nur die Schleifebene berührt und 2 bis 3 min abschrägen.</li>
	<li>Bewerten Sie die Abschrägung, indem Sie die abgeschrägte Nadel auf ein Doppelklebeband legen, das an einem Glasmikroskopschlitten verklebt wurde.</li>
	<li>Platzieren Sie das Dia, das die Nadel hält, auf die Bühne eines zusammengesetzten Mikroskops, das mit einer Kamera und einer Bildaufnahmesoftware ausgestattet ist.</li>
	<li>Erfassen Sie ein Bild der Nadelspitze mit einem 20-fachen Objektiv.</li>
	<li>Verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um den inneren Lumendurchmesser der Nadel zu messen, der nur proximal zur abgeschrägten Öffnung ist (Abbildung 2C). Die optimale Größe beträgt 10 m + 2 m.</li>
	<li>Entsorgen Sie Nadeln, die eine Öffnung unter 8 m und über 12 m haben.</li>
	<li>Bewahren Sie die Nadeln in einem Behälter mit Deckel auf, um zu vermeiden, dass sie staubig werden. Verwenden Sie einen Streifen Wachs oder ähnliches Material, um die Nadeln von der Unterseite des Behälters zu heben, um zu verhindern, dass die Spitzen brechen (Abbildung 2D).</li>
</ol>3. Eiersammlung und -zubereitung
<ol><li>Maximieren Sie die Anzahl der Eier, die gelegt werden, indem Sie Grillen jegliches feuchtes Ledermaterial (Wasserfläschchen, Eierschalen) über Nacht oder für mindestens 8–10 h vor dem Versuch, Eier zu sammeln, vorenthalten. HINWEIS: Da Weibchen die Fähigkeit haben, Spermien intern zu speichern, kann ein anders getimtes Verfahren erforderlich sein, wenn eine sorgfältig getimte Befruchtung experimentell wesentlich ist18.</li>
	<li>40 ml 1% Agarose in Wasser machen und in eine 10 cm Petrischale gießen.</li>
	<li>Legen Sie einen Eierbrunnenstempel auf die Oberfläche der Agarose, bevor sie erstarrt.</li>
	<li>Entfernen Sie den Stempel, sobald die Agarose verfestigt ist, um die Brunnen zu offenbaren (Abbildung 1C).</li>
	<li>Füllen Sie die Agarose-Wellplatte mit HBS, die 1% Penicillin/Streptomycin enthält.</li>
	<li>Den Deckel auf die Schale legen, in Parafilm wickeln und bei 4 °C lagern. HINWEIS: Geschirr kann für ein paar Tage bei 4 °C gelagert werden, sollte aber vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmt werden, um Kondensation zu vermeiden.</li>
	<li>Machen Sie eine Ei-SammlungSchale für Grillen Eier zu legen, indem Sie eine 35 mm Petrischale mit weißen Spielplatz Sand füllen (Abbildung1B). HINWEIS: Der in der Materialtabelle angegebene Sand hat die entsprechende Korngröße. Wenn die Sandkörner zu groß sind, wird der Sand die Eier beschädigen.</li>
	<li>Die Eierschale mit einem Quadrat papiertuch, das etwa 18 cm x 18 cm groß geschnitten ist, mit einem Quadrat papierenen Handtuchs bedecken und mit Sand auf die Oberseite legen. Durch dieses Papierhandtuch bedecken Sie die gefüllte Schale mit Leitungswasser.</li>
	<li>Neigen Sie die Petrischale und drücken Sie vorsichtig die Oberseite, um überschüssiges Wasser zu entfernen.</li>
	<li>Stecken Sie die Ecken des Papiertuchquadrats unter die Schale und legen Sie die Eierschale in den umgekehrten Deckel, der dazu beiträgt, die Papiertuchabdeckung an Ort und Stelle zu halten.</li>
	<li>Legen Sie die Eierschale in den Cricket-Behälter und lassen Sie die erwachsenen Weibchen Eier für ein bis zwei h oviposit. HINWEIS: Die relativ kurze Zeit hier stellt sicher, dass alle Eier im Entwicklungsstadium zum Zeitpunkt der Injektion ähnlich sein werden. Wenn eine Injektion vor der Zellzellisierung wichtig ist, sollten Injektionen innerhalb von 14 h von Eiablage19auftreten.</li>
	<li>In der Zwischenzeit die Agaroseschale (ab Schritt 3.6) auf die Raumtemperatur erwärmen lassen, um Eier zur Injektion zu halten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Eiersammelschale, die jetzt frisch gelegte Eier enthält, aus dem Cricket-Behälter, und entfernen Sie den Papiertuchdeckel. Legen Sie ein Sieb mit einer Porengröße von 0,5–1 mm über einen Becher mit einer Kapazität von mindestens 500 ml (Abbildung 1B).</li>
	<li>Spülen Sie den Inhalt der Eierlegende (Sand und Eier) in das Sieb unter sanft fließendem Leitungswasser, so dass die Sandkörner durch das Siebgitter in das Wasser im Becher unten fallen, aber die Cricket-Eier im Siebkorb zurücklassen.</li>
	<li>Füllen Sie einen Behälter mit RO-Wasser und legen Sie es in ein Tablett. Das Sieb über den Behälter umkehren und gegen die Schale anzapfen, um die Eier ins Wasser zu entwirn. Die Eier sinken auf den Boden des Behälters.</li>
	<li>Schneiden Sie die Spitze mit einer P1000 Pipettenspitze mit einer Schere ab, um eine Öffnung von ca. 3 mm Durchmesser zu machen. Legen Sie diese Spitze auf einen P1000 Pipettier und verwenden Sie ihn, um die Eier aus dem Behälter auf die Agarose-Ei-Formschale zu übertragen, so wenig Wasser wie möglich zu übertragen.</li>
	<li>Verwenden Sie Eine Kunststoff-Pinzette, um Eier in MitHBS gefüllten Agarosebrunnen plus 1% Penicillin/Streptomycin anzulegen. Jedes Ei sinkt auf den Boden eines einzelnen Brunnens. Mit dem Petrischalendeckel abdecken, bis er injiziert werden kann.</li>
</ol>4. Bereiten Sie den Mikroinjektor vor
<ol><li>Befestigen Sie den Mikroinjektor an einer Druckluft- oder Gasquelle (dieses Protokoll wurde entweder mit Druckluft oder N2optimiert). HINWEIS: Wenn Sie einen tragbaren Lufttank verwenden, füllen Sie ihn auf mindestens 75 psi. Der Tank verliert luftdruck während der Injektionen und muss möglicherweise wieder aufgefüllt werden; Injektionen werden schwierig unter 40psi.</li>
	<li>Schalten Sie den Mikroinjektor ein. Stellen Sie die Einspritzzeit auf 0,17 s und den Druck auf 10–15 psi ein. HINWEIS: Der genaue Druckbedarf hängt vom Öffnen der Nadel ab und muss empirisch für jede verwendete Injektionsrunde und/oder neue Nadel bestimmt werden.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der BALANCE-Regler des Mikroinjektors auf 0 (in der Regel vollständig gegen den Uhrzeigersinn) gedreht wird und dass der Mikroinjektor unter Druck steht und sich im Injektionsmodus befindet.</li>
</ol>5. Injektionen
<ol><li>Filtern Sie ca. 500 l 10x Injektionspuffer mit einer 1 ml Spritze und einem 0,45 m Spritzenfilter.</li>
	<li>Mischen Sie Injektionsreagenzien (die folgenden Details sind für die Injektion von dsRNA hergestellt, wie in12beschrieben ). HINWEIS: Es kann ratsam sein, mehrere Steuerelemente zu entwerfen und durchzuführen, vor allem, wenn man diese Technik zum ersten Mal lernt. Das Poking-Eier ohne Injektion, das Injizieren von Puffer + Farbstoff allein oder das Injizieren von Puffer + Farbstoff + ein Kontrollreagenz (wie eGFP dsRNA) sind gute Tests dafür, wie störend verschiedene Elemente des Injektionsprotokolls sein könnten. Siehe Abbildung 3 für die Überlebensfähigkeit einer Reihe verschiedener Steuerelemente.</li>
	<li>Beginnen Sie mit einem 4 ml dsRNA aliquot.</li>
	<li>0,5 ml des gefilterten 10x Injektionspuffers in die dsRNA aliquot geben.</li>
	<li>0,5 ml von 50 mg/ml Tetramethylrhodam Dextran Farbstofflösung hinzufügen. Wenn Sie an einem Sezieren von Bereichen ohne Fluoreszenz arbeiten, verwenden Sie stattdessen Phenol Red.</li>
	<li>Halten Sie alle Materialien für die Dauer der Injektionszeit auf Eis.</li>
	<li>Die Injektionslösung mit 20 ml Ladespitzen und einer p10 Pipette in eine Injektionsnadel geben.</li>
	<li>Ziehen Sie eine 1,5 ml Injektionslösung auf und legen Sie die Ladespitze in das breite Ende der Injektionsnadel ein.</li>
	<li>Auswerfen Der Lösung so weit wie möglich in die Nadel und beseitigen Luftblasen durch sanftes Streichen; Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu brechen.</li>
	<li>Legen Sie die Schale der Eier unter das Sezieren Mikroskop und wählen Sie eine niedrige Vergrößerung von etwa 10x (1x Vergrößerung durch 10x Augenobjektive betrachtet).</li>
	<li>Setzen Sie die Nadel in das Injektionsgehäuse ein und ziehen Sie sie fest. HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Nadel richtig und fest in das Gehäuse eingesetzt wird. Ziehen Sie dazu das breite Ende der Nadel wieder aus dem Metallgehäuse und bringen Sie die Siliziumschläuche in das Gehäuse. Stellen Sie die Siliziumschläuche so ein, dass das Glasende der Nadel direkt über das Silizium hinausragt. Wenn dies nicht geschieht, können die Siliziumschläuche zwischen dem Glas und dem Metallgehäuse eingeklemmt werden, wodurch das Ende der Nadel blockiert wird.</li>
	<li>Setzen Sie das Injektionsgehäuse vorsichtig mit einer befestigten Nadel in den Mikromanipulator ein. Achten Sie auf das scharfe Ende der Nadel und achten Sie darauf, dass sie nicht auf Oberflächen gestoßen und gebrochen wird.</li>
	<li>Wenn Sie sowohl die Eier als auch die Nadel durch das Mikroskop betrachten, bewegen Sie die Nadel in der Nähe der Eier in der oberen linken Ecke des Tellergitters.</li>
	<li>Senken Sie die Nadel, bis die Spitze in die HBS plus 1% Penicillin/Streptomycin gepufferte Lösung in der Schale.</li>
	<li>Zentrieren Sie die Nadel im Sichtfeld und bewegen Sie die Eierschale so, dass die Nadel ein paar Mm näher am Rand der Schale als die Eier ist.</li>
	<li>Versperren Sie nicht den Blick auf das Gitter von Eiern mit der Nadel.</li>
	<li>Stellen Sie das Mikroskop auf den Filter, der für Rhodamine geeignet ist, so dass es möglich ist, die Fluoreszenz in der Nadel zu beobachten und sich auf die Spitze der Nadel zu konzentrieren.</li>
	<li>Drehen Sie am Mikroinjektor den BALANCE-Regler langsam im Uhrzeigersinn, bis die Injektionslösung aus der Nadel in die Suspensionslösung austritt. Die Bilanznummer auf dem Bildschirm des Mikroinjektors beginnt zu steigen, obwohl der numerische Wert nicht wichtig ist. Als nächstes drehen Sie den Knopf gegen den Uhrzeigersinn leicht zurück, bis der Farbstoff nicht mehr aus der Nadel austritt. HINWEIS: Es ist wichtig, dieses Gleichgewicht jedes Mal festzulegen, wenn eine neue Nadel verwendet wird. Ohne das entsprechend eingestellte Gleichgewicht wird der Mikroinjektor noch einige Zeit nach dem Auslösen der Injektion injizieren. Es ist sogar möglich, dass ein einziger Druck des Injektionsknopfes mit einer unsymmetrischen Nadel zum Ausschluss des gesamten Inhalts der geladenen Nadel führt.</li>
	<li>Mit der Nadel im Sichtfeld zentriert, bewegen Sie die Eischale, so dass die Nadel auf das Ei gerichtet ist, das zuerst injiziert werden soll. Es wird empfohlen, dass Injektionen in einer Ecke des Gitters von angeordneten Eiern beginnen, zum Beispiel die obere linke Ecke.</li>
	<li>Stellen Sie die Vergrößerung auf ca. 50x ein; bei dieser Vergrößerung füllt ein einzelnes Ei den größten Teil des Sichtfeldes.</li>
	<li>Verwenden Sie sowohl den Mikromanipulator als auch die Hand auf der Eierschale, um die Nadel für die Injektion in Position zu bringen.</li>
	<li>Fördern Sie die Nadel mit dem Mikromanipulator und setzen Sie die Spitze der Nadel in das erste zu injizierende Ei ein.</li>
	<li>Legen Sie die Nadel bei 20–30% Eilänge vom hinteren (blunter) Ende des Eis (Abbildung 1E), senkrecht zur langen Achse des Eis.</li>
	<li>Injektionslösung entweder mit dem Injektionsfußpedal oder dem Injektionsknopf am Mikroinjektor. Ein kleiner Bolus aus fluoreszierendem Material im Ei zeigt eine erfolgreiche Injektion an (Abbildung 1D). HINWEIS: Es ist nicht ungewöhnlich, dass etwas Dotter während der Injektion aus dem Ei ausgeworfen wird (Abbildung 1F), und dies deutet nicht unbedingt darauf hin, dass das injizierte Ei unrentabel sein wird.</li>
	<li>Ziehen Sie die Nadel aus dem Ei. Wenn das Ei beim Zurückziehen der Nadel unbeabsichtigt aus seinem Brunnen gehoben wird, verwenden Sie kleine Zangen, um das Ei beim Zurückziehen der Nadel wieder in seinen Brunnen zu schieben.</li>
	<li>Wenn die Nadel während der Injektion verstopft, entfernen Sie die Nadel aus dem Ei und, halten Sie die Nadel in der HBS eingetaucht plus 1% Penicillin/Streptomycin-Lösung, die die Eier bedeckt, löschen Sie die verstopfte Nadel entweder mit der Clear-Funktion oder durch Drücken der Injektion knopf.</li>
	<li>Weiterhin die gleiche Nadel zu verwenden, wiederholen Sie das Injektionsverfahren für so viele Eier wie möglich. Zunächst können es nur etwa 20 oder 30 Eier sein, werden aber mit der Praxis auf über 100 anwachsen.</li>
	<li>Wenn die Nadel verstopft wird und nicht gelöscht werden kann, entsorgen Sie die Nadel, füllen Sie eine neue Nadel und beginnen Sie erneut (d. h. kehren Sie zu Schritt 5.7 zurück).</li>
	<li>Bewahren Sie die Schale der injizierten Eier in einem warmen Inkubator (23,5–26 °C) auf, der leicht feucht ist (um die Verdunstung zu minimieren), bis die Embryonen das gewünschte Entwicklungsstadium für die Analyse erreicht haben.</li>
	<li>Entfernen Sie mindestens alle 24 h Eier, die nicht mehr lebensfähig sind (Abbildung 3A,B), und ersetzen Sie die Suspensionslösung durch frische HBS plus 1% Penicillin/Streptomycin.</li>
	<li>Zwei bis drei Tage nach der Injektion die Eier durch sanftes Pipettieren oder mit Plastikzangen auf mit HBS befeuchtete Papiertücher plus 1% Penicillin/Streptomycin in einer verpfuschen Petrischale übertragen, um die Entwicklung im warmen, feuchten Inkubator fortzusetzen.</li>
	<li>Überwachen Sie die Eier und entfernen Sie Eier, die nicht mehr lebensfähig sind jeden Tag (Abbildung 3A,B).</li>
</ol>

<ol><li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+there+yet%3F+Tracking+the+development+of+new+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li>
<li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+August+Krogh+principle%3A+%E2%80%9CFor+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology+Part+B%3A+Molecular+and+Developmental+Evolution%22%5BJournal%5D)">The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li>
<li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Progress+of+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li>
<li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+F+%22Cricket+neurobiology+and+behavior%22">Cricket neurobiology and behavior</a>. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).</li>
<li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorch%2C+HW+%22The+Cricket+as+a+Model+Organism%3A+Development%2C+Regeneration%2C+and+Behavior%22">The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior</a>. , Springer. Tokyo. (2017).</li>
<li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017(2012).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li>
<li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory%3A+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885(2015).</li>
<li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+in+the+Cricket%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cricket+as+a+Model+Organism%3A+Development%2C+Regeneration%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li>
<li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+in+the+Cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Editing+in+Animals%22%5BJournal%5D)">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li>
<li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch%2FDelta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li>
<li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Wingless%2FArmadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus+%28Orthoptera%29%2C+as+revealed+by+RNAi+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li>
<li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260(2018).</li>
<li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li>
<li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202(2012).</li>
<li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li>
<li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li>
<li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heads+and+tails%3A+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li>
<li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomical+Techniques%3A+Insect+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die beiden größten Herausforderungen bei dieser Technik sind die damit verbundenen Fragen der optimalen Nadelgröße und Überlebensfähigkeit. Obwohl kleinere Nadeln die Überlebensfähigkeit verbessern, haben Nadeln mit schmaleren Lumen ein höheres Maß an Kapillarkräften bei der Arbeit, was es wahrscheinlicher macht, dass sich Dasgelb in die Nadel bewegt, wodurch es verstopft wird. Im besten Fall können Verstopfungen einfach durch Injektion eines anderen Eis oder durch Löschen der Nadel wie oben beschrieben beseitigt werden....

Die Fähigkeit, das Genom zu modifizieren oder die Genexpression in Organismen zu beeinflussen, ist die Grundlage für die Entwicklung vieler Arten von Experimenten, die funktionelle Kausalität testen. Entscheidend für die vergleichende und evolutionär relevante Arbeit ist auch, dass genomische und nicht-genomische Modifikationstechniken in Organismen außerhalb traditioneller genetischer Labortiermodellsysteme (z. B. Mus musculus, Danio) verfügbar sind. rerio, Drosophila melanogasterund Caenorhabditis elegans). Ob es der Wunsch ist, die Vielfalt des Organismus zu verstehen1 oder die Einhaltung des Krogh-Prinzips, dass es für jede biologische Frage einen Organismus gibt, der am besten zu seinerLösung2,3, der Fähigkeit, Genome zu modifizieren oder Einfluss auf die Genexpression ist für moderne Experimentelle Designs unerlässlich.
Der Cricket Gryllus bimaculatus ist ein aufstrebendes Modellsystem. Verwendet für das letzte Jahrhundert in neuroethologischen Experimenten4, die letzten zwei Jahrzehnte haben ein erhöhtes experimentelles Interesse an der Cricket erlebt, vor allem auf die Entwicklung und Entwicklung dieses Organismuskonzentriert 5. Die Cricket ist ein hemimetabolous Insekt, das basal zu gut untersuchten holometabolen Insekten, wie D. melanogaster und Tribolium castaneum6. Aufgrund seiner nützlichen Position auf dem Evolutionsbaum sind Wissenschaftler daran interessiert, moderne, anspruchsvolle experimentelle Fragen an diesem Insekt zu stellen, was zu einem wachsenden Interesse an der Anpassung molekularer Werkzeuge für den Einsatz in G. bimaculatusgeführt hat.
Injektionen molekularer Reagenzien in Cricket-Eier können für genomische Modifikationsexperimente sowie nicht-genomische Manipulationen der Genexpression in Embryonen verwendet werden. Zum Beispiel wurden transgene G. bimaculatus tragen degfP Insertionen wurden mit der Transposase piggyBac7,8erstellt. Die Forscher haben erfolgreich Knockout G. bimaculatus mit Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-ähnlichen (TAL) Effektornukleasen (TALENs) erstellt, um doppelsträngige Brüche in bestimmten Genomregionen einzuführen9. Obwohl ZFNs und TALENs ortsspezifisches Targeting bei Tieren über die großen vier Modellsysteme hinaus ermöglichen, wurden diese Reagenzien schnell durch das CRISPR/Cas9-System übertroffen, das einfacher zu bedienen, effizienter und hochflexiblerist 10. CRISPR wurde in G. bimaculatus zur Herstellung von Knock-out11 sowie Knock-in-Linien12,13 Zusätzlich zur genomischen Modifikation kann dsRNA in Eier injiziert werden, um die mRNA-Expression bei der Entwicklung Embryonen, so dass die Forscher die Rolle der spezifischen Transkripte während der Entwicklung verstehen14,15. Einige begrenzte Details über die Injektion von Cricket-Eiern wurden bereits veröffentlicht12.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Injektion früher G. bimaculatus Eier. Dieses Protokoll ist effektiv und leicht an verschiedene Laboreinstellungen, Injektionsmaterialien und möglicherweise an andere Insekten anpassbar. Während zusätzliche Details für die Gestaltung und Umsetzung von Genommodifikations- und Knockdown-Experimenten an anderer Stelle veröffentlicht wurden12,13, werden diese Ansätze letztlich auf das hier beschriebene Injektionsprotokoll angewiesen sein.

<table><tbody><tr><td>Fluoreszenz-Präpariermikroskop</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>Stereomikroskop mit Fluoreszenz</td></tr><tr><td>Externe Lichtquelle für Fluoreszenz</td><td>Leica</td><td>EL 6000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Narishige</td><td>IM-300-Zubehör</td> <td>kann enthalten Injektionsnadelhalter, Eingangsschlauch (mit Schlauchanschluss), Netzkabel, Fußschalter, Silikonkautschukdichtung-mCherry</td></tr> <tr><td>Filterwürfel</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td>Filterwürfel für mCherry oder einen ähnlichen roten Farbstoff funktioniert</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td>Verwendet mit magnetischem Ständer (Narishige, Typ GJ-8)</td></tr><tr><td>Magnetischer Ständer</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhalter (Nadelhalter)</td><td>Narishige</td><td>HD-21</td><td></td></tr><tr><td>Schlauch zum Verbinden der Luftquelle mit dem Mikroinjektor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eibehälterstempel</td><td>3D-gedruckter</td><td>benutzerdefinierter</td><td>3D-Druck auf einem Lulzbot Taz 5 unter Verwendung von Polymilchsäure-Thermoplast</td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td>verschiedene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubatoren oder klimatisierte Räume</td><td>verschiedene</td><td></td><td>Temperaturen von 23,5-26 &°; C benötigt werden.</td></tr><tr><td>Grillenfutter</td>, <td>verschiedenes</td><td></td><td>Katzenfutter oder Fischflocken sind geeignete Lebensmittel.</td></tr><tr><td>Grillenwasser</td><td>Wasser</td><td></td><td>kann in Fläschchen aufbewahrt und den Grillen durch Wattebäusche präsentiert werden</td></tr><tr><td>Grillenschutz</td><td>arious</td><td></td><td>Shelter-Materialien können zerknüllte Papiertücher oder Eierkartons sein</td></tr><tr><td>Kapillarrohre aus Glas Kapillarrohre</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>Artikelnr.: 1B100F-4</td><td>Kwik-Fil&trade; Borosilikatglas Kapillaren, 100 mm Länge, 0,58 mm Innendurchmesser, 1,0 mm Außendurchmesser, mit Filament</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Flaming/Braun</td><td>Modell P-97</td><td>Vertrieben von Sutter Instrument Co.</td></tr><tr><td>Anfas-/Mikroschleifer</td><td>Narishige</td><td>Modell EG-45/EG-400</td><td>EG-400 enthält einen Mikroskopkopf</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>CellTreat</td><td>Produktcode 229693</td><td>90 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Play Sand</td><td>Sandtastik Products Ltd.</td><td>B003U6QLVS</td><td>Weißer Spielsand</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB000972</td><td>Agarose GPG/LE ultrareines</td></tr><tr><td>Eiersieb: Extra feines Köpernetz aus konischem Edelstahl Konische Siebe</td> US <td>Kitchen Supply</td><td>Modell SS-C123</td><td>Die Porengröße sollte zwischen 0,5 und 1,0 mm</td></tr><tr><td>liegen Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco von Life Technologies</td><td>Ref 15070-063</td><td>Pen Strep</td></tr><tr><td>Kunststoffpinzette</td><td>Sipel Electronic SA</td><td>P3C-STD</td><td>Schwarz Statisch ableitend, 118 mm</td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter, 25 mm Durchmesser, 0,45 & Mikro; m</td><td>Nalgene</td><td>725-2545</td><td>Zur Verwendung mit einer 1-ml-Spritze</td></tr><tr><td>1 ml-Spritze mit Tuberkulin-Aufsteckspitze</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>Zur Verwendung mit einem Spritzenfilter zum Filtern von Injektionspuffer, Luer-Lok-Spitzenspritzen funktionieren auch</td></tr><tr><td>Lufttank (optional)</td><td>Midwest Products</td><td>Air Works&reg;</td><td>Tragbarer Lufttank</td></tr><tr><td>Rhodamin Farbstoff</td><td>Thermofisher</td><td>D-1817</td><td>dextran, Tetramethylrhodamin 10.000MW,20</td></tr> <tr><td>mL Ladespitzen</td><td>Eppendorf</td><td>Best.-Nr. 5242 956.003</td><td>epT.I.P.S. 20 &mu; L Microloader</td></tr><tr><td>Zusammengesetztes Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axioskope 2 plus</td><td></td></tr><tr><td>20x Objektiv</td><td>Ziess</td><td>Plan-Apochromat 20x/0,75 M27</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Leica</td><td>DMC 5400</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite&nbsp; Software</td><td>Leica</td><td>LAS</td><td>Version 4.6.2 hier verwendet</td></tr></tbody></table>

injektion von gryllus bimaculatus eiern

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Die Veränderung der Genfunktion in einem sich entwickelnden Organismus ist für verschiedene Arten von Experimenten von zentraler Bedeutung. Während in traditionellen Modellsystemen enorm leistungsfähige genetische Werkzeuge entwickelt wurden, ist es in den meisten anderen Organismen schwierig, Gene oder Boten-RNA (mRNA) zu manipulieren. Gleichzeitig basieren evolutionäre und vergleichende Ansätze auf einer Erforschung der Genfunktion bei vielen verschiedenen Arten, was die Entwicklung und Anpassung von Techniken zur Manipulation von Expressionen außerhalb der derzeit genetisch behördlichen Spezies. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Injektion von Reagenzien in Cricket-Eier, um die Auswirkungen einer bestimmten Manipulation auf die embryonale oder Larvenentwicklung zu testen. Anweisungen zum Sammeln und Injizieren von Eiern mit abgeschrägten Nadeln werden beschrieben. Diese relativ einfache Technik ist flexibel und potenziell an andere Insekten anpassbar. Man kann Dutzende von Eiern in einem einzigen Experiment sammeln und injizieren, und die Überlebensraten für Pufferinjektionen verbessern sich mit der Praxis und können bis zu 80% betragen. Diese Technik unterstützt verschiedene Arten von experimentellen Ansätzen, einschließlich der Injektion von pharmakologischen Wirkstoffen, in vitro capped mRNA, um Gene von Interesse auszudrücken, doppelsträngige RNA (dsRNA), um RNA-Interferenzen zu erreichen, die Verwendung von clusterierten regelmäßig kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) in Abstimmung mit CRISPR-assoziierten Protein-9 (Cas9)-Reagenzien zur genomischen Modifikation und transposierbaren Elementen zur Erzeugung transienter oder stabiler transgener Linien.

Grillen legen leicht Eier in das feuchte Material, und die Bereitstellung von ausreichendem Material, wie feuchter Sand oder Schmutz, veranlasst sie, eine große Anzahl von Eiern zu legen. Dies ist besonders wirksam, wenn Grillen zuerst eilegendes Material für 8–10 h vorenthalten werden. Eier, die in sauberen Sand gelegt werden, können leicht getrennt, gesammelt (Abbildung 1B) und in maßgeschneiderte Eibrunnen zur Injektion gelegt werden (...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Injektion von Cricket-Eiern vor, eine Technik, die als grundlegende Methode in vielen Experimenten im Cricket dient, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, RNA-Interferenz und genomische Manipulation.

Injektion von Gryllus bimaculatus Eiern

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Diese Technik dient als grundlegende Methode für Experimente, die entwickelt wurden, um die embryonale oder Larvenentwicklung des Cricket zu assayen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie flexibel ist und verschiedene Arten von experimentellen Ansätzen unterstützt, wie z. B. solche, die RNA-Interferenz oder genomische Manipulation nutzen. Demonstriert wird das Verfahren von Hadley Wilson Horch, dem Hauptermittler des Labors.Um dieses Verfahren zu beginnen, nass die Spinnschleiferebene des Kegels mit tropfendem Wasser. Legen Sie die gezogene Nadel in den Kegel und drehen Sie sie in einen 20-Grad-Winkel. Senken Sie die Nadel, bis sie nur die Schleifplatte berührt und zwei bis drei Minuten abschrägen.Bewerten Sie die Abschrägung, indem Sie die abgeschrägte Nadel auf ein Doppelklebeband legen, das an einem Glasmikroskopschlitten verklebt wurde. Platzieren Sie das Dia auf der Bühne eines zusammengesetzten Mikroskops, das mit einer Kamera- und Bildaufnahmesoftware ausgestattet ist. Erfassen Sie ein Bild der Nadel mit einem 20-fachen Objektiv.Verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um den inneren Lumendurchmesser der Nadel zu messen, der nur proximal zur abgeschrägten Öffnung ist. Entsorgen Sie alle Nadeln mit einer Öffnung kleiner als acht Mikrometer oder größer als 12 Mikrometer. Zuerst machen Sie 40 Milliliter 1%Agarose in Wasser und gießen Sie es in eine 10 Zentimeter Petrischale.Legen Sie einen Eierbrunnenstempel auf die Oberfläche der Agarose, bevor sie erstarrt. Sobald die Agarose verfestigt ist, entfernen Sie den Stempel, um die Brunnen zu offenbaren. Als nächstes füllen Sie die Agarose-Gutplatte mit HBS, die 1%Penicillin-Streptomycin enthält.Legen Sie den Deckel auf die Schale, wickeln Sie ihn in Parafilm und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius. Danach füllen Sie eine 35 Millimeter Petrischale mit weißem Spielplatzsand, um eine Eiersammelschale für die Grillen zu machen, in die sie Eier legen können. Bedecken Sie die Eierschale mit einem Papiertuch Quadrat geschnitten auf etwa 18 mal 18 Zentimeter.Mit Leitungswasser durch das Papiertuch füllen. Dann kippen Sie die Petrischale und drücken Sie vorsichtig die Oberseite, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Stecken Sie die Ecken des Papiertuchquadrats unter die Schale und legen Sie die Eierschale in einen umgekehrten Deckel, der hilft, das Papiertuch an Ort und Stelle zu halten.Legen Sie die Eierschale in den Cricket-Behälter und lassen Sie die erwachsenen Weibchen die Eier für ein bis zwei Stunden oviposit. In der Zwischenzeit lassen Sie die Agarose Schale auf Raumtemperatur zu erwärmen, in Vorbereitung auf das Halten der Eier für die Injektion. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Eiersammelschale, die jetzt frisch gelegte Eier enthält, aus dem Cricket-Behälter.Entfernen Sie das Papiertuch und legen Sie ein Sieb mit einer Porengröße zwischen 0,5 und einem Millimeter über einem Becher. Spülen Sie den Inhalt der Eilegeschale unter sanft fließendem Leitungswasser in das Sieb. Die Sandkörner fallen durch das Siebnetz in den Becher unten, während die Cricket-Eier im Siebkorb bleiben.Füllen Sie einen Behälter mit Umkehrosmosewasser und legen Sie ihn in ein Tablett. Das Sieb über den Behälter umkehren und gegen die Schale anzapfen, um die Eier ins Wasser zu entwirn. Die Eier sinken auf den Boden des Behälters.Als nächstes schneiden Sie die Spitze einer P1000 Pipettenspitze mit einer Schere ab, um eine Öffnung mit einem Durchmesser von etwa drei Millimetern zu erzielen. Legen Sie diese Spitze auf einen P1000 Pipetter, und verwenden Sie ihn, um die Eier aus dem Behälter auf die Agarose-Ei-Formen-Schale zu übertragen. Mit einer Kunststoff-Pinzette die Eier in den Agarosebrunnen aufstellen.Jedes Ei sinkt auf den Boden eines einzelnen Brunnens. Bedecken Sie die Petrischale mit einem Deckel, bis sie injiziert werden kann. Um zu beginnen, legen Sie die Schale der Eier unter das Sezieren Mikroskop und wählen Sie eine niedrige Vergrößerung von etwa 10x.Mit 20 Mikroliter Ladespitzen und einer P10-Pipette 1,5 Mikroliter Injektionslösung aufziehen und die Ladespitze in das breite Ende der Injektionsnadel einlegen. Die Injektionslösung in die Injektionsnadel austreiben. Setzen Sie die Nadel in das Injektionsgehäuse ein und ziehen Sie sie fest, um sicherzustellen, dass die Nadel richtig und fest in das Gehäuse eingeführt ist.Dann legen Sie das Injektionsgehäuse vorsichtig in den Mikromanipulator ein, wobei Sie darauf achten, nicht zu brechen oder durch die Nadel verletzt zu werden. Wenn Sie sowohl die Eier als auch die Nadel durch das Mikroskop betrachten, bewegen Sie die Nadel in der Nähe des X in der oberen linken Ecke des Tellergitters. Senken Sie die Nadel, bis die Spitze in die HBS plus Penicillin Streptomycin gepufferte Lösung in der Schale.Zentrieren Sie die Nadel im Sichtfeld und bewegen Sie die Eierschale so, dass die Nadel ein paar Millimeter näher am Rand der Schale als die Eier ist. Danach stellen Sie das Mikroskop auf den Filter für Rhodamine, um die Fluoreszenz in der Nadel zu beobachten und sich auf ihre Spitze zu konzentrieren. Drehen Sie den Ausgleichsknopf langsam im Uhrzeigersinn, bis die Injektionslösung aus der Nadel in die Suspensionslösung austritt.Drehen Sie dann den Knopf gegen den Uhrzeigersinn leicht zurück, bis der Farbstoff einfach nicht mehr aus der Nadel austritt. Mit der Nadel noch im Sichtfeld zentriert, bewegen Sie die Eischale, so dass die Nadel auf das Ei gerichtet ist, um zuerst injiziert werden. Passen Sie die Vergrößerung auf etwa 50x an, so dass ein einzelnes Ei den größten Teil des Sichtfeldes füllt.Verwenden Sie sowohl den Mikromanipulator als auch die Hand auf der Eierschale, um die Nadel für die Injektion in Position zu bringen. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel zu fördern und legen Sie die Spitze in das erste eizuspritzende Ei ein, und stellen Sie sicher, dass die Nadel bei 20 bis 30% der Eilänge vom hinteren Ende des Eis senkrecht zur langen Achse des Eis eingesetzt wird. Injizieren Sie die Lösung entweder mit dem Injektionsfußpedal oder dem Injektionsknopf am Mikroinjektor.Ein kleiner Bolus aus fluoreszierendem Material im Ei deutet auf eine erfolgreiche Injektion hin. Danach die Nadel aus dem Ei nehmen. Wenn das Ei beim Zurückziehen der Nadel unbeabsichtigt aus seinem Brunnen gehoben wird, verwenden Sie kleine Zangen, um das Ei beim Zurückziehen der Nadel wieder in den Brunnen zu schieben.In dieser Studie werden Cricket-Eier mit einer Technik injiziert, die als grundlegende Methode in vielen Experimenten dient, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, RNA-Interferenz und genomische Manipulation. Die Überlebensrate ist ein wichtiger Parameter für die Bewertung des Erfolgs dieses Experiments. Die meisten toten Eier können leicht durch Das Sehen identifiziert werden, da das Eigelb und das embryonale Gewebe im Ei beginnen, ungleichmäßig zu verklumpen, und schließlich wird der größte Teil des Dotters auf eine Seite des Eis wandern.Nach vier bis sechs Tagen überlebten mehr als 85 % der nicht injizierten Eier, während Eier, die mit experimentellen Reagenzien injiziert wurden, im Allgemeinen eine niedrigere Überlebensrate aufwiesen. Die Kontrolle aller Aspekte der Injektion selbst, einschließlich der Nadelpunktion, der Einführung von Farbstoff und Puffer oder des Vorhandenseins von Fahrzeug- oder Doppelsträngigen-RNA, ist erforderlich, um die wahren Auswirkungen der experimentellen Manipulation zu verstehen. Die Art und Weise, wie man die phänotypischen Ergebnisse der Injektion beurteilt, hängt davon ab, was injiziert wurde.Zum Beispiel können phänotypische Veränderungen als Folge spezifischer mRNA-Knockdowns auf der Bruttoanatomieebene offensichtlich sein. Wenn andererseits eine cDNA, die ein EGFP-gekennzeichnetes Histon-2B-Gen unter der Kontrolle eines G.bimaculatus Actin-Promotors kodiert, mittels Huckepacktransposase in das Cricket-Genom eingeführt wird, wird es möglich, jeden Kern im Ei mit Fluoreszenz zu visualisieren, um das EGFP-markierte hist 2B-Protein zu erregen. Die Waage so einzustellen, dass die Nadeln nicht verstopfen, ist ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren.Möglicherweise müssen Sie nach nachfolgenden Injektionen mehrere Anpassungen vornehmen, da Dasgelb manchmal die Nadelspitze verstopft. Die Cricket ist ein hemimetabolous Insekt, das basal zu gut untersuchten holometabolen Insekten wie Drosophila zweigt. Das Studium der Cricket-Entwicklung wird uns helfen, mehr über Evolution und Entwicklung im gesamten Tierreich zu verstehen.Diese Technik erfordert etwas Übung. Wir empfehlen, Kontrollinjektionen zu praktizieren, bis die Überlebensrate vier oder fünf Tage nach der Injektion mindestens 80% beträgt.

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Schistosoma mansoni Eier sind potente Stimulatoren der T-Helferzellen vom Typ 2 (Th2) Immunantwort, die charakteristisch für Parasitenbefall, Asthma und allergische Entzündung. Dieses Protokoll nutzt S. mansoni Ei Injektion an einen CD4 Th2-Zytokin-induzierte Entzündungsreaktion in der Lunge, Lunge durch Granulombildung um das Ei gekennzeichnet, Eosinophilie und Makrophagen-Aktivierung Alternative zu generieren.

Mit den Eizellen<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Als ein<em&gt; In vivo</em&gt; Modell von Helminthen-induzierten Lungenentzündung

Die hier beschriebene Methode nutzt Direkteinspritzung entomopathogener Bakterien in die Hämocoel...

Aufzucht und Injektion von<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larven zu bakteriellen Virulenz beurteilen

Mikroinjektion ist eine übliche Technik zur Herstellung von DNA-Konstrukten, mRNAs, Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden oder anderen Behandlungen in Eier, Embryonen und Zellen verschiedener Spezies liefern.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Die Mittelmeerfruchtfliege Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) ist ein weltweiter Schädling der Landwirtschaft. Ein tieferes Verständnis ihrer Biologie ist der Schlüssel, um die Populationen der Medfly zu kontrollieren und so die wirtschaftlichen Auswirkungen zu reduzieren. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein grundlegendes Instrument, das sowohl die Transformation der Keimbahn als auch umgekehrte genetische Studien bei dieser Spezies ermöglicht.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

Mikroinjektion von Nasonia Vitripennis Embryonen ist eine wesentliche Methode zur Erzeugung von erblichen Genom Modifikationen. Hier beschrieben, ist eine detaillierte Anleitung für die Mikroinjektion und Transplantation von Nasonia Vitripennis Embryonen, die zukünftige Genom Manipulation in diesem Organismus erheblich erleichtern wird.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

Hier präsentieren wir Protokolle für sammeln und microinjecting precellular westlichen Mais Maiswurzelbohrer Embryonen zum Zwecke der Ausführung der funktionellen Genomik Assays wie Keimbahn Transformation und CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung.

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

Wir beschreiben Ansätze für die Manipulation von Genen im evolutionären Modellsystem Astyanax Mexicanus. Drei verschiedene Techniken beschrieben: Tol2-vermittelte Transgenese, gezielte Manipulation des Genoms mit CRISPR/Cas9 und Zuschlag des Ausdrucks mit Morpholinos. Diese Tools sollten die direkte Untersuchung von Genen zugrunde liegen die Unterschiede zwischen Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen erleichtern.

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

Ei-Mikroinjektion und effiziente Mating für die Genombearbeitung im Firebrat Thermobia domestica

Hierin werden Protokolle zur Entnahme und Mikroinjektion von präzellulären Maiszikadenembryonen zum Zwecke der Modifikation ihres Genoms durch CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editierung oder zur Zugabe markierter transponierbarer Elemente durch Keimbahntransformation vorgestellt.

Mikroinjektion von Maiszikade, Peregrinus maidis, Embryonen für die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung

Dieses Papier beschreibt grundlegende Methoden zur Standardisierung wichtiger Faktoren wie Dichte, Futterverfügbarkeit, Hydratationsquelle und Umweltkontrollen für die langfristige Aufzucht von Laborkulturen der essbaren Grille Gryllus bimaculatus.

Erhaltung von Laborkulturen von Gryllus bimaculatus, einem vielseitigen Orthopteran-Modell für die Insektenzucht und die Physiologie wirbelloser Tiere

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Injektion von Zeckenembryonen. Die Embryoinjektion ist die bevorzugte Technik zur genetischen Manipulation, um transgene Linien zu erzeugen.

Embryo-Injektionstechnik zur Gen-Editierung bei der Schwarzbeinigen Zecke (Ixodes scapularis)

Lernen Sie die Injektion von Gryllus bimaculatus Eiern für Entwicklungsbiologie und genomische Manipulation. Diese flexible Methode ermöglicht RNA-Interferenz-Studien und liefert zuverlässige Ergebnisse.

Injektion von Gryllus bimaculatus Eiern

Weitere Videos entdecken