Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Unser Protokoll beschreibt Methoden zur effizienten Expression und Reinigung von FAH-Domänen, die Proteine, aber auch Proteine im Allgemeinen enthalten. FHD-Protein-1 spielt eine regulierende Rolle im TCA-Zyklus und im Energiestoffwechsel von Mitochondrien. Wir waren in der Lage, FHD-1-Downregulation mit zellulärer Seneszenz in Verbindung zu bringen und Informationen über Enzymaktivität und Proteinstruktur sind in der Regel erforderlich, um molekulare Mechanismen hinter beobachteten Phänotypen zu verstehen.

Der Hauptvorteil der Exdinziption von Proteinen über IPTG induzierbare Vektorsysteme ist, dass alle Methoden relativ billig und einfach in jedem Labor zu etablieren sind. Durch die Verwendung von Polyhistidin-Proteinen in Kombination mit Nickel-NTA-Agaroseharzen kann die immense Selektivität der Affinitätschromatographie kostengünstig eingesetzt werden. Für die meisten Zwecke kann das bei dieser Qualität gewonnene Protein bereits ausreichen.

FPLC auf der anderen Seite, ist eine etablierte und allgemeine Methode mit mehreren Vorteilen im Vergleich zu anderen Methoden. Legen Sie zunächst fünf bis zehn Nanogramm Plasmid in 100 Mikroliter kompetenter BL21-DE3-PLysS E.coli-Bakterien auf Eis ein. Tippen Sie leicht auf die Röhre, um den Inhalt zu mischen.

Halten Sie die Bakterien 30 Minuten auf Eis und tippen Sie alle paar Minuten sanft auf die Röhre. Erhitzen Sie einen Thermo-Shaker auf 42 Grad Celsius. Legen Sie das Rohr, das die Bakterien enthält, in das Gerät und erhitzen Sie 90 Sekunden lang.

Dann legen Sie die Röhre sofort auf Eis. Nach fünf bis zehn Minuten auf Eis 600 Mikroliter NZCYM-Medium hinzufügen und die Röhre in einen Bakterien-Inkubator geben. Schütteln Sie das Rohr mit mittlerer Geschwindigkeit entlang der Schüttelrichtung bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.

Nach der Inkubation 200 Mikroliter der Bakterienkultur auf einer 10 Zentimeter großen LB-Agarplatte mit den Selektionsantibiotika der Wahl. Kultur die Bakterien auf der LB AgarPlatte im Bakterien-Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach erfolgreicher Koloniebildung eine einzelne Kolonie pflücken und in fünf Milliliter NZCYM mit den ausgewählten Antibiotika dispergieren.

Kultur im Bakterien-Inkubator bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach erfolgreichem Bakterienwachstum, verstärken Sie die Bakterien in 250 Milliliter, 500 Milliliter oder ein Liter Chargen von Medium je nach Bedarf an Proteinmenge. Dann, Kultur der Bakterien, im Bakterien-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zwei bis drei Stunden.

Zeichnen Sie nach der Inkubation eine Stichprobe für die photometrische Analyse. Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,4 erreicht hat, tragen Sie 200 Mikromolar bis zu einem Millimolar Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid auf. Nach drei bis fünf weiteren Stunden im Bakterien-Inkubator bei 37 Grad Celsius ist die Proteinexpression erschöpft.

Das bakterielle Pellet fünf Minuten lang über Zentrifugation bei 5 000 mal G ernten. Dann entsorgen Sie den Überstand und frieren Sie das Pellet bei minus 20 Grad Celsius für eine kurze Lagerung ein. Für jede 250 Milliliter original bakterielle Suspension fünf Milliliter des ausgewählten Puffers auf das bakterielle Pellet auftragen.

Fügen Sie 10 Mikroliter Beta-Mercaptoethanol pro fünf Milliliter aufgebrachten Puffer hinzu. Verwenden Sie eine 10 Milliliter Pasteur Pipet, um das Pellet durch Kratzen und Pipetieren mechanisch in die Suspension zu zwingen. Übertragen Sie die gesamte Suspension in ein 50-Milliliter-Rohr.

Dann beschallen Sie die Suspension. Als nächstes Zentrifuge für 30 Minuten bei hoher Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius. Filtern Sie den Überstand nacheinander mit Filtereinheiten auf Eis.

Bereiten Sie eine leere Kunststoff- oder Glassäule vor, indem Sie sie an einem stabilen Halter befestigen und mit Nickel NTA Laufpuffer waschen. Für je 10 Milliliter Proteinsuspension 500 Mikroliter Nickel NTA-Agarose-Gülle auf die Säule auftragen. Füllen Sie die Säule vollständig mit Nickel NTA Laufpuffer, um sicherzustellen, dass das Agaroseharz nicht gestört wird und der Puffer durch die Schwerkraft durchläuft.

Als Nächstes wenden Sie die Proteinsuspension auf die Säule an und lassen Sie die Probe durch die Schwerkraft laufen. Nachdem die Probe durchlaufen wurde, füllen Sie die Spalte mit einem Nickel-NTA-Laufpuffer. Legen Sie eine UV-transparente Küvette unter die Säule und sammeln Sie einen Milliliter Nickel NTA-Elutionspuffer.

Überprüfen Sie die optische Dichte der Probe mit 280 Nanometern im Vergleich zu einer leeren Probe. Optimalerweise zeigt die Probe eine optische Dichte von mehr als 2,5 an. Da FAHD-Proteine und Nickel-NTA-Elutionspuffer beim Einfrieren und Auftauen ausfällt, dialysieren Sie das Protein über Nacht mit einem Mikroliter DTT pro 100 Milliliter Dialysepuffer gegen einen anderen Puffer auf Demeis.

Richten Sie ein FPLC-System ein und waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumen von 20% Ethanol, gefolgt von fünf Säulenvolumen Wasser. Nachdem Sie die Spalte ausgeglichen haben, wenden Sie die dialyzierte Probe auf die Spalte an, und sammeln Sie den Durchfluss durch. Richten Sie eine Gradientenelution ein.

Führen Sie nach Abschluss des Farbverlaufs mit hohem Salzpuffer aus, bis keine weiteren Spitzen über den Bereich eines Spaltenvolumens erkannt werden. Starten Sie einen Mikroplattenleser und equilibrate für 30 Minuten bei 25 Grad Celsius. Bereiten Sie einen Milliliter einer 20 Millimolaren Lösung eines Substrats vor, das im Enzym-Assay-Puffer getestet werden soll.

Nach dem Pipettierschema im Textprotokoll bereiten Sie das Enzym Leer- und Probenbrunnen vor, indem Sie 90 Mikroliter Enzym-Assay-Puffer mit fünf MikroliterEnzymlösung in die Brunnen pfeifen. Dann bereiten Sie das Substrat leer und Probe Brunnen durch Pipettier95 Mikroliter Enzym Assay Puffer in die Brunnen. Unmittelbar vor der Messung fünf Mikroliter Enzym-Assay-Puffer auf die sechs leeren Brunnen auftragen.

Fünf Mikroliter der 20 Millimolaren Substratlösung auf die Probenbrunnen auftragen. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette bei 50 Mikroliter Einstellung, um die Brunnen sanft zu mischen. Legen Sie dann die Platte in den Mikroplattenleser ein und messen Sie jeden Brunnen mit 255 Nanometern.

Führen Sie schließlich die Analyse in einer Kalkulationstabelle aus. Zwei Beispiele LB Agarplatten nach optimaler und nicht optimaler Transformation sind hier dargestellt. Zu viele Bakterienkolonien deuten darauf hin, dass entweder zwei viele Bakterien plattiert wurden oder dass die Antibiotika abgelaufen sein können.

Zu wenige Bakterienkolonien können darauf hindeuten, dass entweder nicht genügend Plasmid für die Transformation verwendet wurde oder dass zu viele Antibiotika verwendet wurden, um die Bakterien auszuwählen. Das bakterielle Pellet, das das exprimierte Protein in Milligrammmengen enthält, wird geerntet und die Expression wird über die SDS-Seite überprüft. Einige Probleme können während dieses ansonsten einfachen Prozesses auftreten, einschließlich der Proteine, die Einschlusskörper bilden oder das Protein nicht exprimiert wird.

Wenn ein His-Tag verwendet wird, um das Protein zu markieren, ist die Affinitätschromatographie mit Nickel-NTA-Agarose eine einfache und kostengünstige Erfassungsmethode, die die Meisten Kontaminationen eliminiert. Wenn kein Tag verwendet wird, kann eine Kombination aus Ammoniumsulfat-Ausfällung und einer aufeinanderfolgenden hydrophoben Austauschchromatographie auch das Protein von der Mehrheit anderer Proteine trennen. Das Protein wird durch Ionenaustauschchromatographie weiter von Restkontaminationen getrennt, gefolgt von der Größenausschlusschromatographie, um ein ausreichend reines Protein zu erhalten.

Keine der beschriebenen Methoden ist besonders schwierig. Aber alle Methoden erfordern Eine Ausbildung. Erste Versuche können fehlschlagen, aber die Experimente werden nach einigen zusätzlichen Anpassungen erfolgreich sein.

Alle hier vorgestellten Methoden sind allgemeine Methoden der Proteinreinigung. Obwohl das Protokoll auf FAHD-Proteine spezialisiert ist, kann es an jedes Protein angepasst werden, das man reinigen möchte. Rekombinantes menschliches FAHD-1 wurde durch die beschriebenen Methoden gewonnen und hochauflösende Röntgenstrukturen trugen massiv zu unserem Verständnis von FAHD-1 bei, indem sie sowohl als Decarboxylase als auch als Hydrolase fungierten.

Bakterien, die bei dieser Arbeit verwendet werden, sind Sicherheitsstämme und nicht gefährlich. Allgemeine Sicherheitshinweise gelten für alle Chemikalien und FPLC-Säulen sollten mit Vorsicht behandelt werden.