Name: Experimentelle Analyse des Apoptotic Thymozyte Engulfment durch Macrophagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Lernen Sie die Analyse der Efferocytose apoptotischer Thymozyten durch Makrophagen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Hemmstoffeffekten auf die Phagozytose und hat Anwendungen in Immunologie und Zellbiologie.

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Die Forschung im Shao Lab wird unterstützt durch den Research Innovative Award des College of Medicine und den Junior Faculty Pilot Award von der Abteilung für Innere Medizin der Universität Cincinnati und gewähren DK K01_095067 von NIDDK/NIH.

In unserer Mäusekolonie wurden experimentelle Mäuse gezüchtet und gepflegt. Alle Tierarbeiten wurden nach den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität von Cincinnati durchgeführt.
1. Zubereitung von CFSE mit Apoptotic Thymozyten gekennzeichnet
<ol><li>Zwei naive C57/B6-Mäuse mit CO2 -Inhalation für 10 min und Sekt, um die Brusthöhle zu öffnen, entfernen (ziehen) den Thymus mit gekrümmten Feinspitzen-Zangen in die Gewebekultur Petrischale mit 10 ml RPMI1640-Medium.</li>
	<li>Erhalten Sie eine Einzelzellaufhängung, indem Sie den gesamten Thymus an zwei gefrosteten Enden der Mikroskop-Dias schleifen und dann die Aufhängung durch 100 μm Zellstrainer filtern.</li>
	<li>Sammeln Sie die 10-mL-Thymianaufhängung in ein 50 mL Rohr und Zentrifuge mit 300 x g für 5 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Supernatant, erneuern Sie die Zahl der Supernatanten in 40 mL von 1x PBS und zählen Sie die Zellzahlen mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Zentrifuge bei 300 x g für 5 min und entfernen Sie den Supernatant.</li>
	<li>Wiederbelebung in 20 mL von 1x PBS in einem 50 mL-Rohr als Einzelzellaufhängung mit bis zu 2 x 108 Zellen (wenn mehr als 2 x 108 Zellen, den Rest der Zellen in weiteren 20 mL von 1 x PBS in einem anderen 50 mL-Rohr wiederbeleben).</li>
	<li>Machen Sie 5 μM CFSE in gleichem Volumen (20 mL) von 1x PBS in einem separaten 50 mL-Rohr, indem Sie 40 μL CFSE-Lager-Lösung (2,5 mM) in 20 mL von 1x PBS pipettieren und gut vermischen, indem Sie das Rohr 2-3 Mal umkehren.</li>
	<li>Fügen Sie die 20 mL CFSE von Schritt 1.7 in die 20 mL Zellaufhängung ab Schritt 1.6 (die Endkonzentration von CFSE beträgt jetzt 2,5 μM) hinzu. Hinweis: Für jede 20 mL-Zellaufhängung wird eine 20 mL CFSE-Röhre benötigt.</li>
	<li>Das Zell-und CFSE-Gemischrohr 2-3 Mal umdrehen und das Gemisch im Dunkeln bei Raumtemperatur für maximal 2 Minuten inkubieren, dann die Reaktion stoppen, indem man 10 ml wärmeinaktiviertes Pferdeserum hinzufügt.</li>
	<li>Zentrifuge das 50 mL Röhrengemisch bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Wenn die CFSE-Kennzeichnung erfolgreich ist, wird das Zellpellet hellgelb.</li>
	<li>Entfernen Sie das Supernatant und erneuern Sie das Zellpellet in 40 ml von 1x PBS und zählen Sie die Zellzahlen mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Die Zellaufhängung auf 300 x g für 5 min zentrifugen und das Supernatant abwerfen.</li>
	<li>Das Zellpellet wieder mit 40 ml RPMI1640-Medium waschen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Supernatant-und Wiederbelebungszellen mit RPMI1640 Gewebekulturmedium (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (Hitze inaktiviert), 20 mM-Glutamin und 1x Pen/Strep) bei einer Konzentration von 7 x 106 cells/mL in einer 100-mm-Gewebekulturschale. Achtung: Wenn mehr Zellen gewonnen werden, wird eine separate 100-mm-Gewebekulturschale benötigt.</li>
	<li>Mit einer Endkonzentration von 1 μM und einer 4 h igen Kultur bei 37 ° C in einem Gewebekultur-Inkubator, der mit 5% CO2geliefert wird, fügt man die alteineswörende Kultur in die Zellaufhängung ein.</li>
</ol>2. Zubereitung von Peritonealmakrophagen
<ol><li>Injektieren Sie zwei C57B6-Mäuse (oder alle genmanipulierten Mäuse im Labor) intraperitoneal mit 1 mL von 3% gealterter Thioglykollekate am Tag 0.</li>
	<li>Sterbebegleitung der Mäuse bei Tag 5 wie in Schritt 1.1, schneiden und schälen die Bauchhaut, aber lassen Sie das Peritoneum intakt. Spülen Sie die Peritonealhöhle, indem Sie schnell 10 ml Waschpuffer (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) in die Peritonealhöhle mit einer 10 mL-Spritze drücken, die mit einer 18-G-Nadel befestigt ist.</li>
	<li>Den Waschpuffer langsam mit der gleichen Nadle/Spritze abholen und den Waschpuffer in ein 50 mL-Rohr einsammeln (Details siehe Janssen Laborartikel 15).</li>
	<li>Waschen Sie die Peritonealgavage zweimal mit 1x PBS, erneuern Sie die peritonealen Makrophagen in RPMI1640 Gewebekulturmedium in einer Dichte von 2 x 10 6 cells/mL und Aliquot 500 μL in jeden Brunnen der 24-Well-Platte. Lassen Sie die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator für 2 Stunden.</li>
	<li>Entfernen Sie die schwimmenden Zellen, indem Sie die schwimmenden Zellen saugen und durch 500 μL frisches Kulturmedium ersetzen, zweimal.</li>
	<li>Optional wird der TAM-Rezeptor-Tyrosinkemhirus RXDX-106 in den in den Figurenlegenden angegebenen Konzentrationen in jeden Brunnen der Makrophage-Kultur und Inkubat für weitere 2 Stunden eingefügt.</li>
</ol>3. Ko-Kultur der peritonealen Makrophagen mit apoptotischen Thymozyten
<ol><li>Sammeln Sie apoptotische Thymozyten aus Schritt 1 und waschen Sie dreimal mit RPMI1640-Medium. Die Effizienz der apoptotischen Induktion lässt sich in dieser Phase mit dem Annexin V/7-AAD-Kit messen.</li>
	<li>Verteilen Sie 0-12 x 106 Zellen (im 500 μL-Medium) in jede StröAnhängschaft der Makrophage-Kulturen aus dem Protokoll #2 entsprechend der Versuchsanordnung (siehe Abbildung 1). Das macht das gesamte Kulturvolumen von 1 mL in jedem Brunnen der 24-Well-Platte aus. Den blockierenden Antikörper unmittelbar vor dem Zusatz von apoptotischen Thymozyten in die Kultur einfügen.</li>
	<li>Kultur die Zellmischung bei 37 ° C für 4 h in einer Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO2versorgt.</li>
	<li>Waschen Sie jeden Brunnen der Kultur mit 1x PBS (mit 500 μM EDTA) zweimal, um die frei schwebenden apoptotischen Zellen zu entfernen.</li>
	<li>In dieser Phase können Sie die plattengebundenen Makrophagen mit CD11b-PE festigen.<ol>
<li>Waschen Sie die plattengebundenen Makrophagen einmal mit dem Färbepuffer (1x PBS, 1% BSA).</li>
		<li>Fügen Sie 200 μL Fleckenpuffer hinzu, der 2 μL CD11b-PE enthält.</li>
		<li>Die Platte bei 4 ° C 20 min umbauen.</li>
		<li>Mit dem Färbepuffer den einzelnen Blechbrunnen dreimal waschen.</li>
		<li>Fügen Sie 200 μL Färbepuffer hinzu und fahren Sie die Platte für die Bildanalyse unter dem Leuchtstoffmikroskop fort.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativ können Sie die plattengebundenen Makrophagen abtrennen, indem Sie 1 mL mit 1 ml Lidocain in PBS hinzufügen und bei 37 ° C 10 Minuten inkubieren.</li>
	<li>Plattiert gebundene Makrophagen mit wiederholter Pipettierung lösen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Makrophage-Aufhängung in ein individuelles 5-mL-Rundboden-FACS-Rohr aus jedem Brunnen der 24-well-Platte.</li>
	<li>Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.</li>
	<li>Entfernen Sie das Supernatant und fügen Sie 200 μL Färspuffer hinzu, der 2 μL von CD11b-PE (1:200 Verdünnung im Färbepuffer) enthält.</li>
	<li>Die Zellaufhängung im Färbepuffer bei 4 ° C 20 min inspucken.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellaufhängung zweimal mit Färbepuffer.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL Färspuffer hinzu und gehen Sie mit einem Flow-Cytometer zur FACS-Analyse über und analysieren Sie den Anteil der CFSE-Positivitätsmakrophagen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Apoptose ist ein hochkonservierter Zelltod Prozess, der viele Signalkaskaden mit sich bringt und Proteinausdruck, Sekretion und Transport hervorruft. Die Apoptose wird oft mit den Veränderungen der Zellmorphologie 17 in Verbindung gebracht. Apoptotische Zellen setzen aktiv Zytokine und Chemokine frei, die Phagozyten anziehen, um auf die Website zu migrieren und den Prozess der Enge einzuleiten, ein extrem komplexer Pfad unter strenger Kontrolle18. Auf der anderen Seite setz...

Unser Körper erzeugt 1-10 Milliarden apoptotische Zellen täglich. Eine so große Anzahl apoptotischer Zellen muss so geklärt werden, dass die Immunreaktionen ruhig bleiben. Um die rechtzeitige Freigabe von apoptotischen Zellen zu gewährleisten, entwickeln zahlreiche Arten von Gewebezellen und zirkulierenden Zellen Mechanismen, um apoptotische Zellenzu verschlingen. Die Dysfunktionale Regulierung der Apoptose wurde in den Beginn und das Fortschreiten verschiedener entzündlicher Erkrankungen und der Autoimmunität2 in den Körper verwickelt. Die Apoptose spielt auch eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Krebsentwicklung und ihrer anschließenden Resistenz gegen konventionelle Behandlungen3,4. Das Entfernen von apoptotischen Zellen fördert in der Regel eine entzündungshemmende Reaktion, die mit der immunologischen Toleranz in Verbindung gebracht werden kann 5. Die Störung der apoptotischen Zellfreiheit treibt die Selbstironie voran und trägt zur Entwicklung systemischer Autoimmunerkrankungen sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen bei.
Wenn sich die Zellen einer Apoptose unterziehen, setzen sie das Phosphatidylserin (PtdSer) vom inneren Flugblatt zum äußeren Merkblatt der Membran aus. PtdSer wird dann durch Oberflächenrezeptoren durch Phagozyten erkannt. Mehr als ein Dutzend Rezeptoren wurden identifiziert, um die Verengung von apoptotischen Zellen zu erkennen und zu erleichtern. In der Regel sind mindestens drei Arten von Oberflächenrezeptoren in den apoptotischen Zellabstand involviert: Tethering-Rezeptoren, Apoptotikzellen erkennen; Tickling-Rezeptoren, Auflösung auslösen; Begleitrezeptoren, erleichtern den gesamtenProzess 7. TAM-Rezeptor-Tyrosinkinasen (TAM RTKs) bestehen aus T yro-3, Axl und M er und werdenvor allem durch myeloide Zellen des Immunsystems8 ausgedrückt. Die primäre Funktion von TAM RTKs ist es, als innimmende Rezeptoren zu dienen, was die phagozytische Entfernung von apoptotischen Zellen und Schutt erleichtert. Unsere Fraktion hat seit vielen Jahren die Behandlung von TAM vermittelter apoptotischer Zellfreiheit im Rahmen der Autoimmunität untersucht. Das Vitamin K-abhängige Proteinwachstum verhaftet spezifisches Protein 6 (Gas6) und Protein S (ProS) bindetundaktiviert TAM-Rezeptoren 9,10. Gas6 wird im Herzen, in den Nieren und in der Lunge produziert. ProS wird hauptsächlich in der Leber 11produziert. TAM erkennt die apoptotischen Zellen so, dass das N-Terminal von Gas6/ProS auf einer apoptotischen Zelle an den PtdSer bindet und das C-Terminal von Gas6/ProS an TAM-Rezeptoren bindet, die auf der Oberfläche von Phagozyten verankert sind. Zusammen mit den anderen Rezeptoren erfolgt die Verengung der apoptotischen Zellen 12. Obwohl Mer sowohl an die Liganden ProS als auch Gas6 binden kann, haben wir festgestellt, dass Gas6 der einzige Ligand für die von der Mer-vermittelten Makrophage-Phagozytosederapoptotischen Zellen zu sein scheint, die durch den Anti-Mer-Antikörper 13 blockiert werden kann. Makrophagen sind professionelle Phagozyten. Die schnelle Räumung von apoptotischen Zellen durch Makrophagen ist wichtig für die Hemmung von Entzündungen und Autoimmunreaktionen gegen intrazelluläre Antigene. Die Mer-Rezeptor-Tyrosinkinase ist entscheidend für die Makrophage-Gravur und die effiziente Räumung der apoptotischen Zellen 14. In der Maus-Milz drückt Mer vor allem auf die Randzoneundgreifbare Körpermakrophagen 13.
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine grundlegende Methode, um die Zellapoptose zu induzieren und Wege aufzuzeigen, wie der Prozess und die Effizienz der Eskrozytose gemessen werden können. Diese Protokolle können leicht angepasst werden, um die Eerozytose durch andere Zelltypen in der Verengung von apoptotischen Zellen unterschiedlicher Herkunft zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Ack lysing buffer</td><td>GIBCO</td><td>A10492</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mer Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>BAF591</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PE (Klon M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553311</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 mM)</td><td>GIBCO</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>FACS Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352017</td><td></td></tr><tr><td>Frosted</td><td>Slides Fisher Scientific</td><td>12-552-343</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum (hitzeinaktiviert)</td><td>Invitrogen</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Lidocain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5647</td><td>Bereiten Sie 1% Puffer in 1x PBS</td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Corning</td><td>10040CV</td><td></td></tr><tr><td>RXDX-106</td><td>Selleck Chemicals</td><td>CEP-40783</td><td></td></tr> <tr><td>vorStaurosprine (100 mg)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2541-100</td><td>Fügen Sie 214,3 ml DMSO in 100 mg hinzu, um 1 mM Strumpflösung</td></tr> herzustellen <tr><td>Thioglycolat Medium Brewer Modified</td><td>BD Biosciences</td><td>243010</td><td>Bereiten Sie 3% Thioglycolatpuffer in 1&akut vor; PBS, autoklaviert und 3 Monate im Dunkeln lagern.</td></tr></tbody></table>

experimentelle analyse des apoptotic thymozyte engulfment durch macrophagen

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Die Zellapoptose ist ein natürlicher Prozess und spielt eine entscheidende Rolle bei der embryonalen Entwicklung, der homöostatischen Regulierung, der Immuntoleranzinduktion und der Auflösung von Entzündungen. Die Ansammlung von apoptotischen Schutt im Körper kann chronisch entzündliche Reaktionen auslösen, die im Laufe der Zeit zu systemischen Autoimmunerkrankungen führen. Die gestörte Apoptotikzellfreiheit wurde in eine Vielzahl von Autoimmunerkrankungen verwickelt. Die Apoptotikabstände sind ein komplexer Prozess, der selten unter physiologischen Bedingungen entdeckt wird. Es handelt sich um reichlich Oberflächenrezeptoren und Signalmoleküle. Die Untersuchung des Prozesses der apoptotischen Zellfreiheit bietet aufschlussreiche molekulare Mechanismen und anschließende biologische Reaktionen, die zur Entwicklung neuer Therapeutika führen können. Hier beschreiben wir Protokolle zur Induktion von apoptotischen Thymozyten, zur Herstellung von peritonealen Makrophagen und zur Analyse der apoptotischen Zellfreiheit durch Strömungszytometrie und Mikroskopie. Alle Zellen werden sich in einem bestimmten Stadium einer Apoptose unterziehen, und viele Wohn-und Umlaufzellen können apoptotische Trümmer aufnehmen. Daher kann das hier beschriebene Protokoll in vielen Anwendungen verwendet werden, um die apoptotische Zellbindung und-einnahme durch viele andere Zelltypen zu charakterisieren.

Analyse der peritonealen makrophage-vermittelten Verengung von apoptotischen Thymozyten. Peritoneale Makrophagen und apoptotische Zellen wurden wie im Protokoll beschrieben vorbereitet und mitkultiviert. Macrophagen wurden abgetrennt und mit PE-konjugierten Anti-CD11b-Antikörper für 20 Minuten auf Eis befleckt. Makrophagen wurden dann gewaschen und in einem Strömungszytometer verarbeitet. Wie man sieht, gibt es kein positives Makrophage in der unteren rechten Seite, wenn keine apoptotischen Zellen in die...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung von apoptotischen Thymozyten und peritonealen Makrophagen vor und analysieren die Effizienz der Eskrozytose und die spezifische hemmungsvermittelte Blockierung apoptotischer Thymozyten-Verengungen. Dieses Protokoll hat eine breite Anwendung in der zellvermittelten Räumung anderer Partikel, einschließlich künstlicher Perlen und Bakterien.

Experimentelle Analyse des Apoptotic Thymozyte Engulfment durch Macrophagen

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Unser Körper erzeugt täglich ein bis zehn Milliarden apoptotische Zellen. Die effiziente Clearance dieser Zellen hilft bei der Beseitigung von Zellablagerungen und der Aufrechterhaltung von Lagerbeständen. Diese Methode kann in vielen Anwendungen verwendet werden, um die apoptotische Zellbindung und -aufnahme durch viele andere phagozytische Zelltypen zu charakterisieren.Demonstriert dieses Verfahren wird Yuxuan Zhen, ein leitender Techniker in meinem Labor. Um Thymosyten zu ernten, verwenden Sie nach dem Öffnen der Brusthöhle einer naiven C57 black 6 Maus gekrümmte feine Spitzenzange, um den Thymus herauszuziehen. Legen Sie das Organ in eine Gewebekulturschale mit 10 Milliliter rpMI 1640 Medium.Schleifen Sie den ganzen Thymus gegen die gefrosteten Enden zweier Mikroskopschlitten und filtern Sie die resultierende Gewebesuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr. Sammeln Sie die Thymosyten durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 40 Millilitern wieder auf. Nach dem Zählen zentrieren Sie die Zellen wieder und setzen Sie bis zu zwei Mal 10 bis zu den acht Zellen in 20 Millilitern frischer PBS pro 50 Milliliter Tube wieder ab.Beschriften Sie die Zellen mit fünf mikromolaren CFSE in 20 Milliliter PBS pro Tube. Invertieren Sie die Rohre zwei bis drei Mal, um sie zu mischen, bevor Sie die Thymosyten für nicht mehr als zwei Minuten bei Lichtschutz inkubieren. Am Ende der Inkubation stoppen Sie die Reaktion mit 10 Millilitern Hitze inaktiviertes Pferdeserum und sammeln die Zellen durch Zentrifugation.Setzen Sie die beschrifteten Zellen in 40 Millilitern frischer PBS für Zählen und Zentrifugieren wieder auf, gefolgt von einer zusätzlichen Wäsche mit 40 Millilitern Medium. Nach der mittleren Wäsche die Thymosyten siebenmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter Gewebekultur mittlere Rinnskonzentration aussetzen und die Zellen in einer 100-Millimeter-Gewebekulturschale säen. Dann staurosporin in die Zellkultur in einer mikromolaren Endkonzentration hinzufügen und die Platte vier Stunden lang in einen Gewebekultur-Inkubator geben.Zur peritonealen Makrophagenisolierung, injizieren Sie zwei C57 schwarze 6 Mäuse intraperitoneal mit einem Milliliter von 3% im Alter von Thioglycolat am Tag Null, bevor Sie die Bauchhaut öffnen, ohne das Peritoneum am fünften Tag zu stören. Um die Peritonealhöhle zu spülen, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 18-Spur-Nadel, um schnell 10 Milliliter Waschpuffer in den Hohlraum zu schieben, bevor Sie langsam den Waschpuffer zur Abholung in ein 50-Milliliter-Rohr anzapfen. Waschen Sie die Peritonealspülung zweimal mit PBS.Setzen Sie die peritonealen Makrophagen bei zwei mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter Gewebekultur mittlere Konzentration aus. Nächster Samen 500 Mikroliter Makrophagen in jeden Brunnen einer 24 Brunnenplatte und legen Sie die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation, aspirieren Sie den Überstand, um die schwimmenden Zellen zu entfernen und fügen Sie 500 Mikroliter Gewebekultur Medium zu jedem Brunnen.Fügen Sie sofort Null bis 12 mal 10 zu den sechs Thymosyten in 500 Mikroliter n. Medium zu jedem Brunnen der Kultur hinzu und legen Sie die Platte vier Stunden lang im Inkubator der Gewebekultur auf. Am Ende der Inkubation, waschen Sie jeden Brunnen zwei Mal mit frischen PBS, um alle frei schwebenden apoptotischen Zellen gefolgt von einer einzigen Wäsche mit Färbepuffer zu entfernen. Als nächstes beschriften Sie die plattengebundenen Makrophagen mit 200 Mikrolitern Färbepuffer, ergänzt durch einen geeigneten Anti-CD11b-Antikörper pro Brunnen, und legen Sie die Platte 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius ab.In diesem repräsentativen Experiment zeigten bis zu 30% der thioglyolat stimulierten peritonealen Makrophagen ein positives Signal im CFSE-Kanal, das darauf hindeutet, dass diese Phagozyten CFSE-markierte apoptotische Zellen aufgenommen hatten. Die mikroskopische Beobachtung der Makrophagenverschluckung von apoptotischen Zellen ist für die Untersuchung der Fähigkeit von Makrophagen, apoptotische Zellen aufzunehmen, als CFSE-positive Makrophagen sich im unteren rechten Quadranten ausbreiten, da verschiedene Intensitäten darauf hindeuten, dass die Anzahl der apoptotischen Zellen innerhalb einzelner Makrophagen unterschiedlich ist. Ein höheres Verhältnis von apoptotischen Zellen zu Makrophagen erhöht nicht nur die Anzahl der Makrophagen, die apoptotische Zellen aufnehmen, sondern verbessert auch die Fähigkeit der Makrophagen, mehr apoptotische Zellen aufzunehmen.In einer anderen Reihe von Experimenten wurden etwa 15% der Makrophagen CFSE-positiv, als CFSE-beschriftete apoptotische Thymozyten vier Stunden lang der Makrophagenkultur hinzugefügt wurden, was darauf hindeutet, dass diese Makrophagen die phagozytischen Makrophagen waren. Mer-Antikörper blockiert die Makrophagen-Efferozytose dosisabhängig und die Gesamtblockade kann etwa 30 % der Efferozytose-Effizienz in der aktuellen Einstellung ausmachen. Darüber hinaus dämt ein neu zugelassener TAM-Rezeptor-Inhibitor die Makrophagen-Efferozytose dosisabhängig bis zu einer Nanomolarkonzentration ab.Denken Sie immer daran, den Prozentsatz der apoptotischen Zellen zu überprüfen, da diese Zahl direkt die Effizienz der Efferozytose beeinflusst. Die phagozytischen Makrophagen können von Western Blot weiter analysiert werden, um die Signalmoleküle zu untersuchen, die durch verschlungenen Prozess und mikroskopische Simulation reguliert werden, um die Dynamik der Verschlingen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir den Efferozytose-Assay, um die Clearance apoptotischer Zellen mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen. Die Efferozytose ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem apoptotische Zellen von Fresszellen verschlungen und in Vesikel, den sogenannten Efferosomen, abgebaut werden. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Visualisierung internalisierter und nicht-internalisierter Teile einzelner apoptotischer Zellen und zur Quantifizierung der Efferozytose.

Fixierter Zell-Efferozytose-Assay: Eine Methode zur Untersuchung der efferozytären Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen mittels Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Analyse der peritonealen Makrophagen-vermittelten Efferozytose von apoptotischen Mausthymozyten mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Analyse der Efferozytose apoptotischer Thymozyten mittels Peritonealmakrophagen

Dieses Video zeigt einen Apoptose-Assay in Krebszellen, der durch voraktivierte Effektor-T-Zellen induziert wurde. Durch die Co-Kultivierung dieser Zellen mit Krebszellen, die mit fluoreszierenden Zellkernen markiert sind, wird ein Caspase-spaltbares fluorogenes Substrat hinzugefügt. Apoptotische Krebszellen zeigen in ihren Zellkernen eine andere Farbe, was zu einer dualen Fluoreszenz führt. Diese duale Fluoreszenz ist ein Hinweis darauf, dass Krebszellen eine Apoptose durchlaufen.

Ein in vitro Assay zur Untersuchung der Zytotoxizität von präaktivierten CD8+ T-Zellen gegen Krebszellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bestimmung intrazellulärer Signalereignisse, die in lebensfähigen Zellen durch physikalische Interaktion mit benachbarten toten oder sterbenden Zellen induziert werden. Das Protokoll konzentriert sich auf Signalereignisse, die durch Rezeptor-vermittelte Erkennung der toten Zellen induziert werden, im Gegensatz zu ihrer phagozytären Aufnahme oder Freisetzung löslicher Mediatoren.

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Wir beschreiben hier einen Phagozytose-Assay unter Verwendung der dispergierten embryonalen Zellen von Drosophila . Es ermöglicht uns, in vivo Phagozytose Ebenen einfach und präzise zu quantifizieren und neue Moleküle zu identifizieren, die für die Phagozytose von apoptotischen Zellen erforderlich sind.

Phagozytose - Assay für apoptotische Zellen in Drosophila Embryonen

Hier beschreiben wir Methoden mit Spinning Disk konfokalen Mikroskopie zu Bild phagocytic Einzelveranstaltungen durch Maus resident peritonealen Makrophagen. Die Protokolle können auf andere phagocytic Zellen ausgedehnt werden.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Zytotoxizität von pre-activated CD8 untersuchen+ T-Zellen gegen Krebszellen durch das Erkennen von apoptotischen Krebs Zellen über Echtzeit-Mikroskopie. Dieses Protokoll kann Mechanismen hinter myeloische Zellen-induzierte T-Zell-Unterdrückung untersuchen und zu bewerten Verbindungen auffüllen T Zellen durch Blockade von Immunzellen suppressive myeloische abzielen.

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Neurodegenerative Erkrankungen sind mit dysregulierten Mikrogliafunktionen verbunden. Dieser Artikel beschreibt einen In-vitro-Assay der Phagozytose von Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen. Quantitative Mikroskopie-Auslesungen werden sowohl für die Zeitraffer-Bildgebung mit lebenden Zellen als auch für die High-Content-Bildgebung mit festen Zellen beschrieben.

In vitro Quantitative Imaging Assay für Phagozytose toter Neuroblastomzellen durch iPSC-Makrophagen

Dieses Protokoll basiert auf LPS und ATP-induziertem Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen. Wir verwenden die Durchflusszytometrie zur Analyse von Annexin V und 7-AAD-Doppelfärbung, um den Zelltod zu erkennen, wobei wir die gesamte Zelle verwenden und Rasterelektronenmikroskopie einsetzen, um die Zellmembranmorphologie zu beobachten.

LPS und ATP-induzierter Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen und deren Validierung

Lernen Sie die Analyse der Efferocytose apoptotischer Thymozyten durch Makrophagen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Hemmstoffeffekten auf die Phagozytose und hat Anwendungen in Immunologie und Zellbiologie.

Experimentelle Analyse des Apoptotic Thymozyte Engulfment durch Macrophagen

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