Name: Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Lernen Sie die On-Membrane-Verdauungstechnik zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen mittels Massenspektrometrie. Diese Methode eliminiert die Gel-Elektrophorese und erhöht den Durchsatz in der Proteomanalyse.

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Diese Studie wurde teilweise von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 17K09869 (to AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), einem Forschungsstipendium der Kanehara Ichiro Medical Science Foundation, unterstützt. und ein Forschungsstipendium der Suzuken Memorial Foundation (alle an TM).

1. Immunitizipation
HINWEIS: Wir verwendeten Nicht-Natriumdodecylsulfat (SDS) Lysepuffer und Citrat-Elution, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben. Die Verwendung einer alternativen internen Immunpräzipitungstechnik kann jedoch auch für die Herstellung von LC-MS/MS-Proben geeignet sein.
<ol><li>Transfekte kultivierte Zellen mit Vektoren, die ein Epitop-Tag allein oder ein Fusionsprotein kodieren. Zur Erfassung repräsentativer Daten übertragen Sie J774-Zellen (1 x 106) mit Vektoren, die allein für grünes fluoreszierendes Protein (GFP) oder GFP-fused Capn6 (Calpain-6-Gen) mit kationischen Liposomen kodieren.</li>
	<li>Konjugieren Sie Antikörper gegen magnetische Perlen.<ol>
<li>Zu diesem Zweck anti-GFP-Antikörper (2 l/Reaktion) mit magnetischen Perlen (25 l/Reaktion) in 500 l Citratphosphatpuffer (24,5 mM Zitronensäure, 51,7 mM dibasisches Natriumphosphat; pH 5,0) in einem 1,5 ml-Reagenzglas mischen.</li>
		<li>Drehen Sie die Mischung bei 50 Umdrehungen für 1 h bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die IgG-konjugierten Perlen dreimal mit Citratphosphatpuffer, der 0,1% Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat enthält.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyse die transfizierten Zellen mit einem entsprechenden Lysepuffer. Zur Erfassung repräsentativer Daten lysieren Sie die transfizierten Zellen für 30 min auf Eis in 400 l Lysepuffer (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% Poly(Oxyethelene) Octylphenylether) mit 40 x Mol/L Phenylmethylsulfonylfluorid, 50 g/ml Leutin, 50g/ mL Aprotinin, 200-Mol/L-Natriumorthovanadate und 1 mM Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) in 1,5 ml-Reagenzgläsern 24 h nach Transfektion.</li>
	<li>Löschen Sie das Lysat durch Zentrifugieren bei 15.000 x g für 5 min und sammeln Sie den Überstand.</li>
	<li>Löschen Sie das Lysat. Fügen Sie unbeschriftete Magnetperlen (25 l/Reaktion) in ein 1,5 ml-Teströhrchen ein. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 500 l Citratphosphatpuffer. Nach der Entfernung des Citratphosphatpuffers in der Endwäsche, fügen Sie die Zelle Lysat über die magnetischen Perlen. Drehen Sie das Gemisch mit Rotator bei 50 Umdrehungen für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Legen Sie das Reagenzglas für 5 min für die magnetische Trennung auf einen magnetischen Ständer und sammeln Sie das Zelllysat. Die Verwendung des vom Hersteller bezeichneten Magnetständers wird empfohlen.</li>
	<li>Binden Sie die Zielproteine an die konjugierten Perlen. Das Immunglobulin (Ig)G-konjugierte Perlen für 5 min für die magnetische Trennung auf einen magnetischen Ständer legen, den Citratpuffer entsorgen und dann das Zelllysat zu den getrennten Perlen hinzufügen.</li>
	<li>Drehen Sie die Mischung bei 50 Umdrehungen für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Trennen Sie die Zielproteine von freien Nichtzielproteinen. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 500 l Citratphosphatpuffer, der 0,1% Polyoxyethylen (20) Sorbitan-Monolaurat enthält. Nach der letzten Wäsche 30 l Citratpuffer (pH 2–3) hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Zielproteine zu löschen. HINWEIS: Wenn die Erholung von der Immunpräzipitation unzureichend ist, kann die Verwendung alternativer Epitop-Tags, wie FLAG oder HIS, die Effizienz verbessern. Wenn die Effizienz der Elution nicht ausreicht, kann die Verwendung anderer Eluants, wie z. B. einer SDS-basierten Lösung, die Effizienz verbessern.</li>
</ol>2. On-Membran-Verdauung von Proteinen
HINWEIS: Die Verwendung von proteinfreien Materialien und Geräten ist notwendig, um eine Kontamination mit exogenen Proteinen zu vermeiden. Darüber hinaus wird empfohlen, dass der Bediener eine chirurgische Maske und Handschuhe trägt, um eine Kontamination durch menschliche Proteine zu vermeiden.
<ol><li>SCHNEIDEN Sie PVDF-Membranen mit chirurgischer Schere in 3 mm x 3 mm Stücke, die unmittelbar vor der Verwendung mit Methanol abgewischt und getrocknet wurden.</li>
	<li>Fügen Sie 2–5 l Ethanol auf die Stücke der PVDF-Membran auf saubere Aluminiumfolie.</li>
	<li>Bevor sie vollständig trocknen, fügen Sie das Eluant (je 2–5 l, 4–6 Stück pro Probe) auf die hydrophilen PVDF-Membranen auf, und trocknen Sie dann die Membranen lufttrocken, bis die Membranoberfläche matt wird. Getrocknete Membranen können bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Übertragen Sie alle Membranen in 1,5 ml Kunststoffrohre, fügen Sie 20–30 l Ethanol hinzu, um die Membranen hydrophil zu machen, und entfernen Sie dann das Ethanol mit einer Pipette.</li>
	<li>Bevor die Membran vollständig austrocknet, fügen Sie 200 L Dithiothreitol (DTT)-basierte Reaktionslösung (80 mM NH4HCO3, 10 mM DTT und 20% Acetonitril) hinzu und inkubieren Sie sie bei 56 °C für 1 h.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Reaktionslösung durch 300 l Iodoacetamidlösung (80 mM NH4HCO3, 55 mM Iodoacetamid und 20% Acetonitril) und brüten 45 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Membranen zweimal mit 1 ml destilliertem Wasser und einmal mit 1 ml 2% Acetonitril durch Wirbelmischung für >10 s.</li>
	<li>Lyophilisiertes Trypsin(Materialtabelle) direkt in der Reaktionslösung auflösen (30 mM NH4HCO3 mit 70% Acetonitril). Fügen Sie 100 l der Reaktionslösung hinzu, die 1 g Trypsin (Materialtabelle) (30 mM NH4HCO3 mit 70 % Acetonitril) enthält, und über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Reaktionslösung, die die tryptischen Digests enthält, mit einer Pipette in ein sauberes 1,5 ml-Reagenzglas.</li>
	<li>100 l Waschlösung (70% Acetonitril/1% Trifluoressigsäure) in die Membran geben und bei 60 °C für 2 h inkubieren. Die Waschlösung sammeln und mit der Reaktionslösung vermischen. Fügen Sie der Membran weitere 100 L Waschlösung hinzu und beschallen Sie sie 10 min. Dann die Waschlösung sammeln und mit der Reaktionslösung mischen.</li>
	<li>Bedecken Sie das Reagenzglas mit einem Stück Laborfolie und machen Sie ein paar kleine Löcher mit einer Nadel. Trocknen Sie die Lösung mit einem Vakuumkonzentrator.</li>
	<li>Lösen Sie den Rückstand in 10 l 0,2% Ameisensäure. Nach der Zentrifugation (12.000 g, 3 min bei Raumtemperatur) den Überstand in ein Probenrohr geben. HINWEIS: Die Washes sind die kritischen Schritte dieses Abschnitts. Bei der Proteinverdauung auf der Membran ist das Waschen der Membranen, die die immobilisierten Proteine enthalten, nach Reduktion und Alkylierung mit destilliertem Wasser, gefolgt von 2% Acetonitril, jeweils mehr als 10 Sek., entscheidend für die Entfernung der Reagenzien.</li>
</ol>3. LC-Elektrospray-Ionisation (ESI)-MS/MS-Analyse
<ol><li>Aktivieren Sie ein ESI-MS/MS-Instrument (Materialtabelle) gekoppelt mit einem Nano-LC-HPLC-System (Materialtabelle). Verknüpfen Sie eine Vorspalte (Materialtabelle) und eine analytische Spalte (Materialtabelle).</li>
	<li>Kalibrieren Sie vor der Analyse das Massenspektrometer mit tryptischen Digests von Rinderserumalbumin, gelöst in 0,2% Ameisensäure, die Standardpeptide liefert.</li>
	<li>Analysieren Sie die Proben im positiven Ionenmodus und einem Massenbereich von 400–1.250 m/z; dann erreichen Sie bis zu 10 MS/MS-Spektren (je 100 ms) mit einem Massenbereich von 100–1.600 m/z und einem linearen Gradienten von 2%–80% Acetonitril und 0,2% Ameisensäure für 80 min bei einer Durchflussrate von 300 nL/min.</li>
	<li>Analysieren Sie die Ausgabedaten mithilfe einer Software zur Proteinidentifikation (Materialtabelle), um die zugeordneten Proteine zu identifizieren. Für die positive Identifizierung eines Kandidatenproteins ist der Nachweis von mindestens einem Hochtreue-Peptidfragment (> 95% Treue) erforderlich.</li>
	<li>Lassen Sie die Proteine, die in GFP-exzipierten Lysaten (Transfektion von Vektoren, die ein GFP-Tag allein exzessiieren) aus der Liste der Kandidatenproteine ausgefällt werden. HINWEIS: Wenn in der Datenbankanalyse nur wenige Proteine identifiziert werden, kann die Änderung der MS/MS-Erfassungsbedingungen (z. B. Änderung der Zeit von jeweils 100 ms auf 50 ms) die Anzahl der identifizierten Proteine erhöhen.</li>
</ol>

<ol><li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+protein+folding%3A+progress+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Atherosclerosis+and+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li>
<li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li>
<li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li>
<li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li>
<li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li>
<li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6%2C+a+microtubule-stabilizing+protein%2C+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li>
<li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+elongation%2C+co-translational+folding+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li>
<li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%25+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir haben zuvor eine Analyse der oxidativen Modifikationen von Apolipoprotein B-100 in oxidiertem Low-Density-Lipoprotein mit LC-MS/MS beschrieben, der eine On-Membran-Verdauungstechnik vorausgegangen ist6. In der vorliegenden Studie haben wir diese Technik mit Immunpräzipitation kombiniert und mehrere Calpain-6-assoziierte Proteine identifiziert. Diese neuartige Technik stellt eine bequeme Methode zum Screening auf Kandidaten-assoziierte Proteine dar. Calpain-6 ist ein nicht-proteolytisches Mitgl...

Obwohl Proteine in lebenden Organismen eine konstitutive Rolle spielen, werden sie in der intrazellulären Umgebung kontinuierlich synthetisiert, verarbeitet und abgebaut. Darüber hinaus interagieren intrazelluläre Proteine häufig physikalisch und biochemisch, was die Funktion eines oder beider1,2,3. Beispielsweise ist die direkte Bindung des spliceosomenassoziierten Proteinhomologs CWC22 mit dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 4A3 (eIF4A3) für die Montage des exon-Junction-Komplexes4erforderlich. In Übereinstimmung damit, eine eIF4A3 Mutante, die Affinität für CWC22 fehlt nicht exon Junction komplexe mRNA spleißen4zu erleichtern. Daher ist die Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen entscheidend für das genaue Verständnis der physiologischen Regulation sowie der zellulären Funktionen.
Jüngste Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) wurden auf die umfassende Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet. Zum Beispiel ermöglicht die Ko-Ausfällung von endogenen Proteinen oder exogen eingeführten markierten Proteinen mit ihren zugehörigen Proteinen, gefolgt von einer MS-Analyse, die Identifizierung neuartiger Proteinwechselwirkungen5. Ein großer Engpass bei der MS/MS-Analyse ist jedoch die schlechte Erholung von tryptischen Digests von Proteinproben. Zur Durchführung proteomischer Analysen an Zelllysaten werden in der Regel In-Gel- und On-Membran-Verdauungstechniken zur Vorbereitung von MS/MS-Proben eingesetzt. Wir haben zuvor ein In-Gel-Verdauungsverfahren mit einer On-Membran-Verdauungstechnik6verglichen und gezeigt, dass letztere mit einer besseren Sequenzabdeckung verbunden war. Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran kann für diesen Zweck geeignet sein, weil es mechanisch robust und beständig gegen hohe Konzentrationen von organischen Lösungsmitteln7,8, ermöglicht die enzymatische Verdauung von immobilisierten Proteine in Gegenwart von 80% Acetonitril9. Darüber hinaus kann die Immobilisierung auf einer Membran konformationale Veränderungen in Denkproteinen auslösen, was zu Verbesserungen der tryptischen Verdauungseffizienz10führt. Dementsprechend haben wir in diesem Artikel die Verwendung von Immunpräzipitation-LC/MS/MS-Analysen von Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membran-Verdauungstechnik beschrieben. Diese einfache Methode erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auch in nicht spezialisierten Laboratorien.

<table><tbody><tr><td>Acetonitril</td><td>Wako</td><td>014-00386</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Wako</td><td>030-05525</td><td></td></tr><tr><td>DiNA</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>nanoflow Hochleistungsflüssigkeitschromatographie</td></tr><tr><td>DiNa AI</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>Nanoflow, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, ausgestattet mit Autosampler,</td></tr><tr><td>DTT</td>, <td>Nacalai Tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr>, <tr><td>Dynabeads, Protein G</td>, <td>Thermo, Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr>, <tr><td>Ameisensäure</td>, <td>Wako</td><td>066-00461</td><td></td></tr>, <tr><td>HiQ, Sil, C18W-3</td>, <td>KYA Tech Co.</td><td>E03-100-100</td><td>0,10 mmID * 100 mmL</td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>Wako</td><td>095-02151</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors A.v. Monoklonaler Antikörper (JL-8)</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Wako</td><td>018-21742</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Sigma</td><td>N6507</td><td>Poly(oxyethelen)-octylphenylether (n=9)</td></tr><tr><td>peptid standard</td><td>KYA Tech Co.</td><td>tBSA-04</td><td>tryptische Verdaue von Rinderserumalbumin</td></tr><tr><td>PP-Fläschchen</td><td>KYA Tech Co.</td><td>03100S</td><td>Probenröhrchen aus Kunststoff</td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor Cooctail</td><td>Sigma</td><td>P8465</td><td></td></tr><tr><td>ProteinPilot-Software</td><td>Sciex</td><td>5034057</td><td>Software zur Proteinidentifizierung</td></tr><tr><td>Modifiziertes Trypsin in Sequenzierungsqualität</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>Trypsin</td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Wako</td><td>206-10731</td><td></td></tr><tr><td>Fallensäule</td><td>KYA Tech Co.</td><td>A03-05-001</td><td>0,5 mmID * 1 mmL</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600 System</td><td>Sciex</td><td>4466015</td><td>Hybrid-Quadrupol-Flugzeit-Tandem-Massenspektrometer</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Wako</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Wako</td><td>160-21211</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung von protein-protein-wechselwirkungen mit einer on-membrane-verdauungstechnik

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Zahlreiche intrazelluläre Proteine interagieren physisch in Übereinstimmung mit ihren intrazellulären und extrazellulären Umständen. Tatsächlich hängen die zellulären Funktionen weitgehend von intrazellulären Protein-Protein-Wechselwirkungen ab. Daher ist die Forschung über diese Wechselwirkungen unerlässlich, um das Verständnis physiologischer Prozesse zu erleichtern. Die Ko-Ausfällung assoziierter Proteine, gefolgt von einer Massenspektrometrie-Analyse (MS), ermöglicht die Identifizierung neuartiger Proteinwechselwirkungen. In dieser Studie haben wir Details der neuartigen Technik der Immunpräzipitations-Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS-Analyse in Kombination mit der On-Membran-Verdauung für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen bereitgestellt. Diese Technik eignet sich für rohe Immunpräzipitantien und kann den Durchsatz proteomischer Analysen verbessern. Tagged rekombinante Proteine wurden mit spezifischen Antikörpern gefällt; als nächstes wurden Immunpräzipitanten, die auf Polyvinylidendifluorid-Membranstücke gefleckt wurden, einer reduktiven Alkylierung unterzogen. Nach der Trypsinisierung wurden die verdauten Proteinrückstände mit LC-MS/MS analysiert. Mit dieser Technik konnten wir mehrere kandidatenassoziierte Proteine identifizieren. Daher ist diese Methode praktisch und nützlich für die Charakterisierung neuartiger Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens wurden Immunpräzipitantien mit LC-MS/MS analysiert (Abbildung 1). Nach dem Ausschluss exogen abgeleiteter Proteine (Proteine anderer Arten und IgGs) wurden 17 Proteine in Calpain-6-assoziierten Immunpräcipitantien (Tabelle 1) und 15 Proteinen in GFP-assoziierten Immunpräcipitantien ( Tabelle 2). Von den Calpain-6- und GFP-assoziierten Proteinen wurden 11 in beiden Immunpräcipitantie...

Hier stellen wir ein Protokoll für eine On-Membran-Verdauungstechnik zur Vorbereitung von Proben für die Massenspektrometrie vor. Diese Technik erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Die Erforschung der Protein-Protein-Interaktion ist für das Verständnis physiologischer Prozesse in mehreren Bereichen unerlässlich. In diesem Video stellen wir die On-Membran-Verdauungstechnik vor, die es den Forschern ermöglicht, eine umfassende Analyse von Bindungsproteinen durch MS auf bequeme Weise durchzuführen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir den Durchsatz der proteomischen Analyse für rohe Immunpräzipitantien verbessern können, da eine Trennung von Proteinen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese nicht erforderlich ist.Beginnen Sie, den Antikörper mit den magnetischen Perlen zu konjugieren, indem Sie den Anti-GFP-Antikörper mit den Perlen in 500 Mikroliter Citratphosphatpuffer mischen. Drehen Sie das Gemisch bei 50 Umdrehungen für eine Stunde bei Raumtemperatur. Und dann die konjugierten Perlen dreimal mit Citratphosphatpuffer mit 1%Polysorbat 20 waschen.Lyse transfizierte Zellen nach Manuskriptrichtungen. Die Schale zerkleinern und in das 1,5-Milliliter-Reagenzglas geben. Dann das Lysat durch Zentrifugieren bei 15.000 x g für fünf Minuten löschen und den Überstand sammeln.Bereiten Sie unbeschriftete Magnetperlen vor, indem Sie sie dreimal mit 500 Mikroliter Citratphosphatpuffer waschen. Nach der letzten Wäsche den Puffer entfernen und den Perlen Zelllysat hinzufügen. Drehen Sie das Gemisch bei 50 Umdrehungen 30 Minuten bei Raumtemperatur.Führen Sie die magnetische Trennung auf dem magnetischen Ständer durch und sammeln Sie das Zelllysat. Um die Zielproteine an die immunglobulin konjugierten Perlen zu binden, legen Sie die Perlen fünf Minuten lang auf den magnetischen Ständer. Entsorgen Sie den Citratpuffer, und fügen Sie das Zelllysat zu den Perlen hinzu.Drehen Sie die Mischung für eine Stunde bei 50 RPM. Um Zielproteine von den freien Nichtzielproteinen zu trennen, waschen Sie die Perlen dreimal mit 500 Mikroliter Citratphosphatpuffer, der 1%Polysorbat 20 enthält. Nach der letzten Wäsche 30 Mikroliter Citratpuffer hinzufügen und die Perlen fünf Minuten bei Raumtemperatur sitzen lassen, um die Zielproteine zu löschen.Zur Vorbereitung der Membran schneiden Sie PVDF-Membranen mit einer chirurgischen Schere in 3-Millimeter-Stücke, die unmittelbar vor dem Gebrauch gereinigt wurden. Legen Sie die Membranstücke auf Aluminiumfolie und fügen Sie zwei bis fünf Mikroliter Ethanol zu jedem Stück hinzu. Bevor die Membranen vollständig trocken sind, fügen Sie jedem Stück zwei bis fünf Mikroliter des Proteins eluent hinzu und trocknen Sie es an der Luft, bis die Membranoberfläche matt wird.Dann Membranen in 1,5 Milliliter-Rohre übertragen und bei vier Grad Celsius lagern. Wenn Sie sofort verwenden, fügen Sie zwei bis 30 Mikroliter Ethanol hinzu, was sie hydrophil macht. Entfernen Sie das Ethanol mit einer Pipette, aber bevor die Membranen trocknen, fügen Sie 200 Mikroliter DTT-basierte Reaktionslösung zu jeder Röhre vollständig hinzu und inkubieren Sie sie bei 56 Grad Celsius für eine Stunde.Nach der Inkubation die Reaktionslösung durch 300 Mikroliter Iodoacetamid-Lösung ersetzen und 45 Minuten im Dunkeln brüten. Dann waschen Sie die Membranen zweimal mit destilliertem Wasser und einmal mit 2%Acetonitril durch Wirbeln für mindestens zehn Sekunden. Die Arbeit mit diaphanem astonititrillösen kann extrem gefährlich sein.Eine Maske, eine Brille und Handschuhe sollten immer getragen werden, wenn die On-Membran-Verdauung durchführen. Bereiten Sie Trypsin nach Manuskriptanweisungen vor und fügen Sie jeder Membran 100 Mikroliter Trypsin-Reaktionslösung hinzu. Über Nacht bei 37 Grad Celsius zur Verdauung inkubieren.Übertragen Sie am nächsten Tag die Reaktionslösung in ein sauberes 1,5-Milliliter-Rohr und fügen Sie der Membran 100 Mikroliter Waschlösungen hinzu. Die Membran zwei Stunden lang bei 60 Grad Celsius inkubieren, dann die Waschlösung sammeln und mit der Reaktionslösung mischen. Fügen Sie der Membran weitere 100 Mikroliter Waschlösung hinzu und beschallen Sie sie 10 Minuten lang.Dann die Waschlösung sammeln und mit der Reaktionslösung mischen. Bedecken Sie das Reagenzglas mit einem Stück Laborfolie und machen Sie kleine Löcher in der Folie mit einer Nadel. Trocknen Sie die Lösung mit einem Vakuumkonzentrator, und lösen Sie den Rückstand in 10 Mikroliter 2%Ameisensäure auf.Zentrifugieren Sie das Rohr drei Minuten lang bei 12.000 x g und übertragen Sie den Überstand in ein Probenrohr. Analysieren Sie die Probe mit einem Massenspektrometer, das mit einem Nano-LC/HPLC-System verbunden ist. Mit diesem Protokoll wurden 17 Proteine im Calpain-6-assoziierten Immunpräcipitant identifiziert, 15 im GFP-assoziierten Immunpräcipitant und 11 in beiden.Es ist wichtig zu beachten, dass der Nachweis von mindestens einem High-Fidelity-Peptid-Fragment für die positive Identifizierung eines Kandidatenproteins erforderlich ist. Proteine, die im GFP-exzessigraphischen Lysat ausfielen, sowie Histonen, exogene und ribosomale Proteine wurden von der Liste gestrichen. Das Waschen der Membranen vor der tryptischen Verdauung mit destilliertem Wasser und 2%Acetonitril ist der wichtigste Schritt bei der Behandlung der On-Membran-Verdauung über Proteine.Nach dieser Methode ist es möglich, die Ko-Ausfällung des Zielproteins durch andere Experimente wie Immunpräzipitation und Western Blot-Analyse zu bestätigen. Diese einfache Methode ermöglicht es den Forschern, die neuartigen Protein-Protein-Wechselwirkungen mit bequemen und hochempfindlichen Analysen zu erforschen.

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Biochemistry

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