DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling
October 8th, 2019
Proteinbindende Mikroarray -Experimente (PBM) in Kombination mit biochemischen Assays verknüpfen die Bindungs- und katalytischen Eigenschaften von DNA-Primase, einem Enzym, das RNA-Primer auf Vorlagen-DNA synthetisiert. Diese Methode, die als High-Throughput Primase Profiling (HTPP) bezeichnet wird, kann verwendet werden, um DNA-bindende Muster einer Vielzahl von Enzymen zu offenbaren.
Dieses Protokoll beschreibt die Sammlung massiver Daten aus protein-DNA-bindenden Mikroarrays für Primase, ein Enzym, das vorübergehend an bestimmte DNA-Sequenzen bindet und damit die Bildung von RNA-Primern katalysiert. In diesem Video wird beschrieben, wie die Mikroarray-Technologie dazu beitragen kann, Primase-Sequenzerkennungsstellen neu zu definieren und wie ein Ansatz mit hohem Durchsatz die klassische Biochemie ergänzen kann. Diese Technik kombiniert zwei Ansätze: Primase DNA-bindendes Mikroarray und Primase-Aktivitäts-Assay.
Das Mikroarray liefert massive Daten über die Primasebindung an DNA-Sequenzen, wobei der biochemische Assay Informationen über die RNA-Primerbildung durch DNA-Primase liefert. Die getestete enzymatische Aktivität hängt von der Einsicht aus dem Mikroarray-Experiment und seinem geringeren Durchsatz in seiner Natur ab. Der Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit der Bindung, der DNA-Sequenzauswahl und der Aktivität des Enzyms wird untersucht.
Die Identifizierung der Sequenzdeterminanz mit Mikroarray ermöglicht es uns, genaue Schlussfolgerungen auf der Grundlage massiver Daten des Mikroarrays zu ziehen. Dieser Ansatz wurde bisher verwendet, um DNA-Bindungssequenzen von Transkriptionsfaktoren zu beschreiben. Transkriptionsfaktoren sind statische Proteine, die eng an die DNA binden.
Das Verfahren wird Stefan Ilic demonstrieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, befeuchten Sie den Mikroarray-Dia, indem Sie ihn in ein Coplin-Glas mit 0,01%Triton-X 100 legen. Und drehen auf einem Laborrotator, fügen Sie 125 Rpm für fünf Minuten.
Die Sperrlösung in eine Kunststoffbox zersiekern. Entfernen Sie dann das Mikroarray-Dia aus dem Coplin-Glas. Verwenden Sie ein feines Wischen, um die Nicht-DNA-Seite und die Ränder des Dias zu fahren.
Legen Sie das Mikroarray langsam in die Kunststoffbox. Bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit langsamem Schütteln inkubieren. Danach die Rutsche einmal mit 0,01%Tween-20 in PBS waschen.
Auf einem Laborrotator bei 125 Rpm für fünf Minuten. Entfernen Sie den Tween-20 und spülen Sie das Dia einmal mit 0,01%Triton-X 100 in PBS auf einem Laborrotator bei 125 Rpm für zwei Minuten. Dann übertragen Sie die Folie schnell in ein Coplin-Glas, das PBS enthält.
Montieren Sie zunächst die PMB-Kammer, wie im Textprotokoll beschrieben. Platzieren Sie die Folie in den angegebenen Bereich. Verwenden Sie eine Pinzette, um sie nach unten und links zu drücken.
Legen Sie die Silikondichtung auf und stellen Sie sicher, dass sie gut mit dem unteren Teil der PBM-Kammer ausgerichtet ist. Schließen Sie dann die Kammer und ziehen Sie die Schrauben diagonal fest. Die Proteinbindungsmischung in jeden Brunnen der Dichtung geben.
Dann bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubieren. Zunächst pipette 0.05%Tween-20 in PBS in die PBM-Kammer, um die Rutsche kurz zu waschen. Entfernen Sie die Lösung mit einem Vakuumsauger aus den Brunnen der Kammer, da Sie darauf achten, die DNA-Spots nicht zu berühren.
Wiederholen Sie dies, waschen Sie die Folie kurz mit PBS. Und verwenden Sie das Vakuum, um die Lösung aus den Brunnen der Kammer zu entfernen, während Sie darauf achten, die DNA-Spots nicht zu berühren. Als nächstes fügen Sie Alexa 488 konjugierten Anti-His Antikörper zu jedem Brunnen der PBM-Kammer.
Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Danach waschen Sie die Rutsche in der PBM-Kammer kurz, indem Sie ein paar Tropfen von 0,05%Tween-20 in PBS in jeden Brunnen hinzufügen. Und verwenden Sie den Vakuum-Aspirator, um die Lösung aus den Brunnen der Kammer zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die DNA-Spots nicht zu berühren.
Zerlegen Sie die PBM-Kammer und entfernen Sie die Folie. Spülen Sie die Dias zweimal in 0,05%Tween-20 in PBS, wobei jede Spülung drei Minuten dauert. Spülen Sie dann die Dias zweimal in PBS, wobei jede Spülzeit jeweils drei Minuten dauert.
Und einmal in doppelt destilliertem Wasser für drei Minuten. Trocknen Sie die Dias mit Druckluft. Und lagern Sie sie in einer dunklen Diabox, bis sie zum Scannen bereit ist.
Wenn Sie bereit sind, scannen Sie den Chip mit einem Mikroarray-Scanner mit einer Anregung von 495 Nanometern und einer Emission von 19 Nanometern. Und sammeln Sie die mittlere Fluoreszenzintensität. In dieser Studie wird pi durchsatz-Primase-Profiling verwendet, um die Primase-Bindungsstellen abzubilden, einschließlich derjenigen, die mit klassischen Werkzeugen schwer, wenn nicht gar nicht zu beobachten sind.
Wichtig ist, dass pi-Durchsatz-Primase-Profiling die Überprüfung des traditionellen Verständnisses von Primase-Bindungsstellen ermöglicht. Besonders pi-Durchsatz-Primase-Profiling zeigt neben bekannten 5'GTC3'Erkennungssequenzen auch Bindungsspezifitäten auf, was zu Veränderungen in den funktionellen Aktivitäten der T7-DNA-Primase führt. Nämlich werden zwei Gruppen von Sequenzen identifiziert.
Starke Bindungs-DNA-Sequenzen, die TG in den Flanken enthielten, und schwache Bindungs-DNA-Sequenzen, die AG in den Flanken enthielten. Es wurde keine Primasebindung an DNA-Vorlagen festgestellt, die 5'GTC3'in ihren Sequenzen fehlten. Die Primase-DNA-Erkennungsstellen, die spezifische Merkmale wie TG-reiche Flanken enthalten, erhöhen die Primase-DNA-Bindung bis zum 10-fachen.
Überraschenderweise erhöhen sie auch die Länge der neu gebildeten RNA. Wichtig ist, dass das Primse-Profiling mit hohem Durchsatz es uns ermöglicht, die Variabilität in der Grundlänge in Bezug auf die Sequenz der DNA-Vorlage zu beobachten und zu quantifizieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten die Waschschritte subtil sein.
Und Puffer sollten Komponenten enthalten, die den Primase auf der DNA protokolliert haben. Auch ein Schwellenwert für vergebliche Bindungsereignisse wird biochemisch bestimmt. Daher ist die Analyse des Mikroarrays unzureichend.
Methoden wie eine Oberflächenplasmaresonanz und Gelverschiebungstests können die Bindungsaffinität von Primase bestimmen, um die DNA-Sequenzen auszuwählen. Mein Labor implementiert Vorhersagemodelle für maschinelles Lernen, um Primatese-Sequenzdeterminanten zu erkennen, die produktive Primer liefern, die durch DNA-Polymerase erweitert werden können. Im Ära der Big Data, einer Implementierung statistischer Methoden zur Analyse von Big Data, wird die Technik definitiv dazu beitragen, bestimmte DNA-Sequenzen besser zu charakterisieren und die Sequenzerkennung mit der Aktivität von Primase zu verknüpfen.
Jeder, der mit Strahlung arbeitet, sollte ein gründliches Verständnis der Vorschriften und Gefahren im Zusammenhang mit der Verwendung ionisierender Strahlung haben. Sollte sich einer Schulung unterziehen und mit Sicherheitsausrüstung arbeiten.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt eine Hochdurchsatzmethode zur Analyse der Bindungs- und katalytischen Eigenschaften von DNA-Primase unter Verwendung von Protein-DNA-Bindungs-Microarrays. Die Technik kombiniert Microarray-Technologie mit biochemischen Assays, um Einblicke in die Sequenzerkennung der Primase und die Bildung von RNA-Primern zu liefern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Biochemie
- Molekularbiologie
- Genetik
Hintergrund
- DNA-Primase synthetisiert RNA-Primer auf der Matrizen-DNA.
- Das Verständnis der Bindungsmuster der Primase ist entscheidend für die Aufklärung ihrer Funktion.
- Hochdurchsatzmethoden können traditionelle biochemische Ansätze verbessern.
- Die Microarray-Technologie ermöglicht die massive Datenerfassung über Protein-DNA-Interaktionen.
Zweck der Studie
- Um die Erkennungsstellen der Primase-Sequenz neu zu definieren.
- Um die Bindungseffizienz mit der enzymatischen Aktivität zu verknüpfen.
- Um Hochdurchsatz-Profiling für eine umfassende Analyse zu nutzen.
Verwendete Methoden
- Protein-DNA-Bindungs-Microarray-Experimente.
- Biochemische Assays zur Messung der RNA-Primer-Bildung.
- Hochdurchsatz-Primase-Profiling (HTPP) Methodik.
- Datenanalyse zur Korrelation von Bindungsmustern mit der Enzymaktivität.
Hauptergebnisse
- Identifizierung spezifischer DNA-Sequenzen, die von der Primase gebunden werden.
- Korrelation zwischen Bindungseffizienz und RNA-Primer-Synthese.
- Massive Datenerfassung verbessert das Verständnis der Primase-Funktion.
- Einblicke in die Beziehung zwischen DNA-Sequenzauswahl und Enzymaktivität.
Schlussfolgerungen
- Hochdurchsatzmethoden liefern wertvolle Einblicke in das Enzymverhalten.
- Die Verknüpfung von Bindungsdaten mit katalytischer Aktivität ist wesentlich für das Verständnis der Primase.
- Dieser Ansatz kann auf andere Enzyme für ähnliche Analysen angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
High-throughput primase profiling (HTPP) enables scalable characterization of DNA sequence recognition by primase, linking binding specificity to functional output in RNA primer synthesis. This approach supports target validation in nucleic acid enzymology by providing quantitative, reproducible data on enzyme-DNA interactions that inform mechanistic de-risking in early discovery. The method enhances predictive confidence in lead identification by correlating binding strength with enzymatic processivity, aiding portfolio triage for replication-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by defining primase recognition sequences and flanking context effects on binding strength.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative correlation of binding efficiency with RNA primer length and enzyme processivity.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by identifying sequence determinants that yield productive primers extendable by DNA polymerase.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by mapping primase binding sites across thousands of DNA sequences.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through microarray-based binding data and concurrent activity measurements.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse by combining PBM and primase activity assay in a scalable HTPP workflow.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by linking primase sequence recognition to functional outcomes in Okazaki fragment formation.
- Preclinical Model Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by connecting DNA binding specificity to RNA primer synthesis activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by using binding and activity data to inform go/no-go decisions in replication-targeted programs.
Pipeline & Workflow Integration
HTPP integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical work by providing scalable, quantitative insights into primase-DNA interactions that inform enzymatic function.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through massive data on primase binding to DNA sequences.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs by correlating microarray binding data with RNA primer formation measurements.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, and statistical outputs that help teams compare binding strength across sequence variants and link to enzymatic activity.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating how sequence-specific binding influences functional primer synthesis in DNA replication.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, enabling cross-project application in nucleic acid enzymology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in primase-DNA recognition.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of binding and activity measurements across diverse DNA sequences.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in replication-targeted drug discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative linking of binding efficiency to primer synthesis activity.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in protein-DNA interaction assays, microarray handling, and fluorescence detection.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microarray scanner, PBM chamber, and vacuum aspiration system.
- Cross-team standardization requirements for buffer composition, washing stringency, and fluorescence threshold setting.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for primases from different organisms or engineered variants.
- Practical limitations supported by source material: washing steps must be subtle to preserve binding signals, and buffers must contain components that maintain primase-DNA interaction during assay.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:29
Primase DNA Binding Experiment: Blocking Procedure
2:44
Primase DNA Binding Experiment: Protein Binding
3:22
Primase DNA Binding Experiment: Fluorescent Antibody Attachment
5:15
Results: Analysis of High-Throughput Primase Profiling
6:42
Conclusion
