DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling
8. Oktober 2019
Proteinbindende Mikroarray -Experimente (PBM) in Kombination mit biochemischen Assays verknüpfen die Bindungs- und katalytischen Eigenschaften von DNA-Primase, einem Enzym, das RNA-Primer auf Vorlagen-DNA synthetisiert. Diese Methode, die als High-Throughput Primase Profiling (HTPP) bezeichnet wird, kann verwendet werden, um DNA-bindende Muster einer Vielzahl von Enzymen zu offenbaren.
Dieses Protokoll beschreibt die Sammlung massiver Daten aus protein-DNA-bindenden Mikroarrays für Primase, ein Enzym, das vorübergehend an bestimmte DNA-Sequenzen bindet und damit die Bildung von RNA-Primern katalysiert. In diesem Video wird beschrieben, wie die Mikroarray-Technologie dazu beitragen kann, Primase-Sequenzerkennungsstellen neu zu definieren und wie ein Ansatz mit hohem Durchsatz die klassische Biochemie ergänzen kann. Diese Technik kombiniert zwei Ansätze: Primase DNA-bindendes Mikroarray und Primase-Aktivitäts-Assay.
Das Mikroarray liefert massive Daten über die Primasebindung an DNA-Sequenzen, wobei der biochemische Assay Informationen über die RNA-Primerbildung durch DNA-Primase liefert. Die getestete enzymatische Aktivität hängt von der Einsicht aus dem Mikroarray-Experiment und seinem geringeren Durchsatz in seiner Natur ab. Der Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit der Bindung, der DNA-Sequenzauswahl und der Aktivität des Enzyms wird untersucht.
Die Identifizierung der Sequenzdeterminanz mit Mikroarray ermöglicht es uns, genaue Schlussfolgerungen auf der Grundlage massiver Daten des Mikroarrays zu ziehen. Dieser Ansatz wurde bisher verwendet, um DNA-Bindungssequenzen von Transkriptionsfaktoren zu beschreiben. Transkriptionsfaktoren sind statische Proteine, die eng an die DNA binden.
Das Verfahren wird Stefan Ilic demonstrieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, befeuchten Sie den Mikroarray-Dia, indem Sie ihn in ein Coplin-Glas mit 0,01%Triton-X 100 legen. Und drehen auf einem Laborrotator, fügen Sie 125 Rpm für fünf Minuten.
Die Sperrlösung in eine Kunststoffbox zersiekern. Entfernen Sie dann das Mikroarray-Dia aus dem Coplin-Glas. Verwenden Sie ein feines Wischen, um die Nicht-DNA-Seite und die Ränder des Dias zu fahren.
Legen Sie das Mikroarray langsam in die Kunststoffbox. Bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit langsamem Schütteln inkubieren. Danach die Rutsche einmal mit 0,01%Tween-20 in PBS waschen.
Auf einem Laborrotator bei 125 Rpm für fünf Minuten. Entfernen Sie den Tween-20 und spülen Sie das Dia einmal mit 0,01%Triton-X 100 in PBS auf einem Laborrotator bei 125 Rpm für zwei Minuten. Dann übertragen Sie die Folie schnell in ein Coplin-Glas, das PBS enthält.
Montieren Sie zunächst die PMB-Kammer, wie im Textprotokoll beschrieben. Platzieren Sie die Folie in den angegebenen Bereich. Verwenden Sie eine Pinzette, um sie nach unten und links zu drücken.
Legen Sie die Silikondichtung auf und stellen Sie sicher, dass sie gut mit dem unteren Teil der PBM-Kammer ausgerichtet ist. Schließen Sie dann die Kammer und ziehen Sie die Schrauben diagonal fest. Die Proteinbindungsmischung in jeden Brunnen der Dichtung geben.
Dann bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubieren. Zunächst pipette 0.05%Tween-20 in PBS in die PBM-Kammer, um die Rutsche kurz zu waschen. Entfernen Sie die Lösung mit einem Vakuumsauger aus den Brunnen der Kammer, da Sie darauf achten, die DNA-Spots nicht zu berühren.
Wiederholen Sie dies, waschen Sie die Folie kurz mit PBS. Und verwenden Sie das Vakuum, um die Lösung aus den Brunnen der Kammer zu entfernen, während Sie darauf achten, die DNA-Spots nicht zu berühren. Als nächstes fügen Sie Alexa 488 konjugierten Anti-His Antikörper zu jedem Brunnen der PBM-Kammer.
Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Danach waschen Sie die Rutsche in der PBM-Kammer kurz, indem Sie ein paar Tropfen von 0,05%Tween-20 in PBS in jeden Brunnen hinzufügen. Und verwenden Sie den Vakuum-Aspirator, um die Lösung aus den Brunnen der Kammer zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die DNA-Spots nicht zu berühren.
Zerlegen Sie die PBM-Kammer und entfernen Sie die Folie. Spülen Sie die Dias zweimal in 0,05%Tween-20 in PBS, wobei jede Spülung drei Minuten dauert. Spülen Sie dann die Dias zweimal in PBS, wobei jede Spülzeit jeweils drei Minuten dauert.
Und einmal in doppelt destilliertem Wasser für drei Minuten. Trocknen Sie die Dias mit Druckluft. Und lagern Sie sie in einer dunklen Diabox, bis sie zum Scannen bereit ist.
Wenn Sie bereit sind, scannen Sie den Chip mit einem Mikroarray-Scanner mit einer Anregung von 495 Nanometern und einer Emission von 19 Nanometern. Und sammeln Sie die mittlere Fluoreszenzintensität. In dieser Studie wird pi durchsatz-Primase-Profiling verwendet, um die Primase-Bindungsstellen abzubilden, einschließlich derjenigen, die mit klassischen Werkzeugen schwer, wenn nicht gar nicht zu beobachten sind.
Wichtig ist, dass pi-Durchsatz-Primase-Profiling die Überprüfung des traditionellen Verständnisses von Primase-Bindungsstellen ermöglicht. Besonders pi-Durchsatz-Primase-Profiling zeigt neben bekannten 5'GTC3'Erkennungssequenzen auch Bindungsspezifitäten auf, was zu Veränderungen in den funktionellen Aktivitäten der T7-DNA-Primase führt. Nämlich werden zwei Gruppen von Sequenzen identifiziert.
Starke Bindungs-DNA-Sequenzen, die TG in den Flanken enthielten, und schwache Bindungs-DNA-Sequenzen, die AG in den Flanken enthielten. Es wurde keine Primasebindung an DNA-Vorlagen festgestellt, die 5'GTC3'in ihren Sequenzen fehlten. Die Primase-DNA-Erkennungsstellen, die spezifische Merkmale wie TG-reiche Flanken enthalten, erhöhen die Primase-DNA-Bindung bis zum 10-fachen.
Überraschenderweise erhöhen sie auch die Länge der neu gebildeten RNA. Wichtig ist, dass das Primse-Profiling mit hohem Durchsatz es uns ermöglicht, die Variabilität in der Grundlänge in Bezug auf die Sequenz der DNA-Vorlage zu beobachten und zu quantifizieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten die Waschschritte subtil sein.
Und Puffer sollten Komponenten enthalten, die den Primase auf der DNA protokolliert haben. Auch ein Schwellenwert für vergebliche Bindungsereignisse wird biochemisch bestimmt. Daher ist die Analyse des Mikroarrays unzureichend.
Methoden wie eine Oberflächenplasmaresonanz und Gelverschiebungstests können die Bindungsaffinität von Primase bestimmen, um die DNA-Sequenzen auszuwählen. Mein Labor implementiert Vorhersagemodelle für maschinelles Lernen, um Primatese-Sequenzdeterminanten zu erkennen, die produktive Primer liefern, die durch DNA-Polymerase erweitert werden können. Im Ära der Big Data, einer Implementierung statistischer Methoden zur Analyse von Big Data, wird die Technik definitiv dazu beitragen, bestimmte DNA-Sequenzen besser zu charakterisieren und die Sequenzerkennung mit der Aktivität von Primase zu verknüpfen.
Jeder, der mit Strahlung arbeitet, sollte ein gründliches Verständnis der Vorschriften und Gefahren im Zusammenhang mit der Verwendung ionisierender Strahlung haben. Sollte sich einer Schulung unterziehen und mit Sicherheitsausrüstung arbeiten.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Hochdurchsatzmethode zur Analyse der Bindungs- und katalytischen Eigenschaften von DNA-Primase unter Verwendung von Protein-DNA-Bindungsmikroarrays. Die Technik kombiniert Mikroarray-Technologie mit biochemischen Assays, um Einblicke in die Sequenzerkennung durch Primase und die Bildung von RNA-Primern zu erhalten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biochemie
- Molekularbiologie
- Genetik
Hintergrund
- Die DNA-Primase synthetisiert RNA-Primer an der Matrizen-DNA.
- Das Verständnis der Bindungsmuster der Primase ist entscheidend, um ihre Funktion aufzuklären.
- Hochdurchsatzmethoden können traditionelle biochemische Ansätze verbessern.
- Mikroarray-Technologie ermöglicht die umfassende Datensammlung zu Protein-DNA-Wechselwirkungen.
Zweck der Studie
- Um Erkennungsstellen der Primase-Sequenz neu zu definieren.
- Um die Bindungseffizienz mit der enzymatischen Aktivität zu verknüpfen.
- Um ein Hochdurchsatz-Profiling für eine umfassende Analyse zu nutzen.
Verwendete Methoden
- Protein-DNA-Bindungs-Mikroarray-Experimente.
- Biochemische Assays zur Messung der RNA-Primer-Bildung.
- Methodik des Hochdurchsatz-Primase-Profilings (HTPP).
- Datenanalyse zur Korrelation von Bindungsmustern mit Enzymaktivität.
Hauptergebnisse
- Identifizierung spezifischer DNA-Sequenzen, die von der Primase gebunden werden.
- Korrelation zwischen Bindungseffizienz und RNA-Primer-Synthese.
- Umfangreiche Datensammlung verbessert das Verständnis der Primasenfunktion.
- Erkenntnisse über die Beziehung zwischen der Auswahl der DNA-Sequenz und der Enzymaktivität.
Schlussfolgerungen
- Hochdurchsatzmethoden liefern wertvolle Einblicke in das Verhalten von Enzymen.
- Die Verknüpfung von Bindungsdaten mit katalytischer Aktivität ist entscheidend für das Verständnis der Primase.
- Dieser Ansatz kann auf andere Enzyme zur Durchführung ähnlicher Analysen angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Hochdurchsatz-Primase-Profilierung (HTPP) ermöglicht eine skalierbare Charakterisierung der DNA-Sequenzerkennung durch Primasen und verknüpft die Bindungsspezifität mit dem funktionellen Ergebnis in der RNA-Primer-Synthese. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung in der Nukleinsäure-Enzymologie, indem er quantitative und reproduzierbare Daten zu Enzym-DNA-Interaktionen liefert, die zur mechanistischen Ent-Risikobewertung in der frühen Entdeckung beitragen. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Leitstrukturfestlegung, indem sie die Bindungsstärke mit der enzymatischen Prozessivität korreliert und somit die Portfolio-Priorisierung für replikationszielgerichtete Therapeutika unterstützt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem primäre Erkennungssequenzen und flankierende Kontexteffekte auf die Bindungsstärke definiert werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung durch quantitative Korrelation der Bindungseffizienz mit der Länge des RNA-Primers und der Prozessivität des Enzyms.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Vorhersagesicherheit, indem Sequenzdeterminanten identifiziert werden, die produktive, durch DNA-Polymerase verlängerbare Primer ergeben.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Workflows vor, indem Primase-Bindungsstellen über Tausende von DNA-Sequenzen kartiert werden.
- Operativer Wert: Löst Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch mikroarraybasierte Bindungsdaten und gleichzeitige Aktivitätsmessungen.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht die Eignung für Hochdurchsatz-Screenings und die Wiederverwendung der Plattform, indem PBM und Primase-Aktivitätsassay in einem skalierbaren HTPP-Workflow kombiniert werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem die Erkennung der Primase-Sequenz mit funktionellen Ergebnissen bei der Bildung von Okazaki-Fragmenten verknüpft wird.
- Übereinstimmung mit präklinischen Modellen: Beschreibt den kontinuierlichen Übergang von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die Spezifität der DNA-Bindung mit der Aktivität der RNA-Primer-Synthese verknüpft wird.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Berücksichtigt die mechanistische Risikominderung, indem Bindungs- und Aktivitätsdaten zur Entscheidungsfindung (Go/No-Go) bei Programmen mit Replikationsziel herangezogen werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
HTPP ist in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Forschung integriert, indem es skalierbare, quantitative Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Primase und DNA liefert, die die enzymatische Funktion beeinflussen.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung, die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Entwederisikominimierung durch umfangreiche Daten zur Bindung von Primasen an DNA-Sequenzen unterstützt.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays, die Reproduzierbarkeit sowie quantitative Ergebnisse, indem Bindungsdaten aus Mikroarrays mit Messungen zur RNA-Primer-Bildung korreliert werden.
- Analytik: Hebt Messgrößen, Nachweismethoden und statistische Auswertungen hervor, die Teams dabei helfen, die Bindungsstärke zwischen verschiedenen Sequenzvarianten zu vergleichen und mit enzymatischer Aktivität in Beziehung zu setzen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem gezeigt wird, wie die sequenzspezifische Bindung die funktionelle Synthese von Primern bei der DNA-Replikation beeinflusst.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbares Verfahren dar, nicht als Einmalanwendung, und ermöglicht deren Einsatz in mehreren Projekten innerhalb der Nukleinsäure-Enzymologie.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung und Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei der Erkennung von DNA durch Primasen.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Bindungs- und Aktivitätsmessungen über verschiedene DNA-Sequenzen hinweg.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz und geringeres biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen der entdeckungsorientierten Wirkstoffforschung, die auf der DNA-Replikation abzielt.
- Portfolio-Implikationen: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf der quantitativen Verknüpfung von Bindungseffizienz mit der Primer-Synthese-Aktivität.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in Protein-DNA-Wechselwirkungsassays, Mikroarray-Handhabung und Fluoreszenznachweis.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich Mikroarrayscanner, PBM-Kammer und Vakuum-Aspirationssystem.
- Standardisierungsanforderungen über Teamgrenzen hinweg hinsichtlich Pufferzusammensetzung, Waschstringenz und Einstellung der Fluoreszenzschwellwerte.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, insbesondere für Primasen aus unterschiedlichen Organismen oder gentechnisch veränderte Varianten.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind: Die Waschschritte müssen schonend erfolgen, um die Bindungssignale zu erhalten, und die Puffer müssen Komponenten enthalten, die die Primase-DNA-Wechselwirkung während des Assays aufrechterhalten.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:29
Primase DNA Binding Experiment: Blocking Procedure
2:44
Primase DNA Binding Experiment: Protein Binding
3:22
Primase DNA Binding Experiment: Fluorescent Antibody Attachment
5:15
Results: Analysis of High-Throughput Primase Profiling
6:42
Conclusion
