Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Diese Volumenelektronenmikroskopie wird verwendet, um biologische Studien durchzuführen, die die Beobachtung einer 3D-Struktur erfordern. Bietet eine Stab-, Felderansicht und Probenspeicherung, bevor das Bild wieder aufnimmt. Fx2 Asan entwickelte die Pfadstufen, die die Deabilation katalysieren, um den Elektronentest von Zielstrukturen zu erhöhen und kann verwendet werden, um ein bestimmtes Ziel von Interesse zu lokalisieren.

Diese Teilchen kombinieren den Einsatz von korrelativen Licht und 3-D-Elektronenmikroskopie-Technik, um die Wechselwirkungen zwischen membranösen Organellen und Wirtszellen zu untersuchen. 16 bis 24 Stunden nach der Transfektion die Kultur vorsichtig mit 250 Mikrolitern 30 bis 37 Grad Celsius Fixierungslösung waschen. Ersetzen Sie die Wäsche schnell durch 1,5 Milliliter frischer Fixierungslösung und legen Sie die Kultur 30 Minuten lang auf Eis.

Am Ende der Inkubation spülen Sie die Zellen mit drei zehnminütigen Waschungen in einem Milliliter eiskaltem 0,1 moligem Natriumkakodylatpuffer pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche einen Milliliter eiskalte 0 bis 4 Grad Celsius 20 Millimolar Glycin-Lösung in die Schale für eine zehnminütige Inkubation auf Eis gefolgt von drei fünfminütigen Wäschen mit einem Milliliter frischer, kalter 0,1 molar NatriumkakodylatPuffer pro Wäsche. Als nächstes beschriften Sie die Zellen mit 500 Mikroliter frisch zubereiteter DAB-Lösung.

Und die Zellen auf Eis für etwa fünf bis fünfundvierzig Minuten bebrüten. Wenn ein hellbrauner Fleck unter einem invertierten Lichtmikroskop sichtbar ist, spülen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter frischen, kalten 0,1 molaren Natriumkakodylatpuffer für zehn Minuten pro Wäsche ab. Verwenden Sie dann ein phasenkontrastinvertiertes Mikroskop, um die DAB-Färbung bei einer 100-fachen Vergrößerung oder höher zu visualisieren und den Boden des Glases zu markieren, in dem sich der Interessenbereich befindet.

Für die Probenvorbereitung des Elektronenmikroskops müssen die Zellen zunächst mit einem Milliliter 2% reduziertem Osmiumtetroxid für eine Stunde bei vier Grad Celsius nachfixiert werden. Am Ende der Fixierung spülen Sie die Zellen mit drei fünfminütigen Waschungen und einem Milliliter frischem destilliertem Wasser pro Wäsche ab. Vor der Behandlung der Zellen mit einem Milliliter gefilterter TCH-Lösung für 20 Minuten.

Am Ende der Inkubation die Zellen dreimal in destilliertem Wasser waschen, wie gerade gezeigt, und fixieren Sie die Zellen mit einer 30-minütigen Inkubation in 2% reduziertem Osmiumtetroxid. Am Ende der zweiten Fixierung die Zellen dreimal mit destilliertem Wasser waschen und die Kultur mit einem Milliliter wässrigem 1%uranylacetat über Nacht bei 4 Grad Celsius vor Licht geschützt bedecken. Am nächsten Morgen die Zellen dreimal mit destilliertem Wasser waschen, bevor sie mit einem Milliliter 60 Grad Celsius gefärbt werden, wärmte Waltons Blei-Aspartat-Lösung 30 Minuten lang in einem 60 Grad Celsius Ofen.

Am Ende der Inkubation die Zellen dreimal in destilliertem Wasser waschen. Und inkubieren Sie die Kultur in einer abgestuften Serie von 20-Minuten 2 Milliliter Ethanol Aliquots. Nach der letzten 100%ethanol Exposition, inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten in einem Milliliter von drei bis ein Ethanol zu niedrigviskosem Einbettungsmittel bei Raumtemperatur.

Am Ende der Inkubation das Medium durch ein Milliliter Eins-zu-Eins-Ethanol bis zu einem niedrigviskosen Einbettungsmischmedium für weitere 30 Minuten inkubationsmisch bei Raumtemperatur ersetzen. Als nächstes ersetzen Sie das Medium durch einen Millilter von ein bis drei Ethanol zu niedrigviskosem Einbettungsmischmedium für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie dann das Medium über Nacht durch einen Milliliter mit 100% niedriger Viskosität, gefolgt von der Einbettung der Probe in eine 100%niedrige Viskositäts-Einbettungsmischung für 24 Stunden bei 60 Grad Celsius.

Für die Transmissionselektronenmikroskopie-Analyse verwenden Sie am nächsten Tag ein Ultramikrotome, um 90 Nanometer dicke Abschnitte zu erhalten und das Raster unter der Transmissionselektronenmikroskopie bei 200 Kilovolt zu beobachten. Vor Beginn der Probenvorbereitung, reinigen Indium Zinn oxidbeschichtete Glasabdeckungenmitlipsmitlips mit sanfter Rührung in Isopropanol für 30 bis 60 Sekunden. Am Ende der Agitation den überschüssigen Alkohol abtropfen lassen und die Deckelinen in eine staubfreie Umgebung stellen.

Wenn die Abdeckungen trocken sind, verwenden Sie einen Plasma-Coater, um die Abdeckungen für eine Minute zu glühen. Dann legen Sie die Abdeckungen in den Substrathalter und legen Sie den Substrathalter in das Messerboot. Um Proben für die Rasterelektronenmikroskopie zu erhalten, legen Sie den eingebetteten Probenblock in den Probenhalter des Ultramikrotomeins ein.

Und stellen Sie den Halter in den Trimmblock. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das überschüssige Harz um die Zielposition zu schneiden, so dass die Fläche des Blocks eine Trapez- oder rechteckige Form erhält. Die führenden und nachfolgenden Kanten sollten strikt parallel zueinander sein.

Es ist nicht einfach, eine große Anzahl von seriellen Abschnitten zu erwerben. Allerdings müssen die vorderen Kanten und hinteren Kanten vollständig parallel sein. Als nächstes legen Sie den Probenhalter in den Arm des Ultramikrotom ein.

Legen Sie das Diamantmesser in den Messerhalter und füllen Sie das Messerboot mit gefiltertem destilliertem Wasser. Drücken Sie dann vorsichtig den Griff des Halters, um die Trägerposition so einzustellen, dass die Kante der Abdeckungen in der Nähe des Messers liegt. Nach Dem Erhalt der Probe, stoppen Sie den Schnittprozess, öffnen Sie langsam die Spannschraube des Rohres und entleeren Sie das Wasserboot.

Wenn der Bandsammelvorgang abgeschlossen ist, entfernen Sie das Substrat mit dem Griff der Spannvorrichtung und trocknen Sie das Band. Die Verwendung von genetisch markierten Plasmiden, die Proteine von Interesse ausdrücken, ermöglicht die Identifizierung der transfizierten Zielzellen nach der Färbung der markierten Proteine. Die korrelative Lichtelektronenmikroskopie kann dann verwendet werden, um die beschriftete Zellkultur weiter zu visualisieren.

Beispielsweise wird der durch SCO1-APEX2 erzeugte dunkle Fleck ausschließlich im mitochondrialen Intermembranraum und nicht im Matrixraum der Mitochondrien beobachtet. Codetransfikierte Zellen mit SCO1-APEX2- und HRP-KDEL-Plasmiden drücken ein hochdichtes Elektronensignal im mitochondrialen Intermembranraum und im endoplasmatischen Retikulum aus. Allerdings wird keine endoplasmatische Retikulumfärbung in Zellen beobachtet, die nur mit SCO1-APEX2 transfiziert werden.

Für die serielle Bildgebung mittels Rasterelektronenmikroskopie wird mit einem Rückstreuelektronendetektor über eine große Fläche ein Überblick über das gesamte Arraybild erstellt. Als nächstes wird der Interessenbereich im ersten Abschnitt platziert und an alle anderen Abschnitte weitergegeben. Schließlich wird der Interessenbereich mit fünf Zielzellen mit fünf nanometer abgebildeten Pixeln abgebildet.

Die Vergrößerung zeigt detaillierte subzelluläre Strukturen wie den Golgi-Apparat, Mitochondrien und das endpolasmische Retikulum. Die serielle Bildgebung zeigt deutlich, dass endoplasmatische Retikulum-Mitochondrien-Kontakte auf verschiedenen Z-Ebenen auftreten. Sie sollten ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine bestimmte Zielstruktur mithilfe der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie lokalisieren können, um die Auswirkungen einer bestimmten Identitätsänderung zu untersuchen.

Diese Färbetechniken in Kombination mit volumenelektronenmikroskopischem Volumen könnten für größere EM verwendet werden, um zelluläre Wechselwirkungen insbesondere im Eurovirus zu untersuchen. Denken Sie daran, das Glutaraldehyd, auch Enteterocide und TCH sind sehr giftig, so achten Sie darauf, Schutzkleidung zu tragen und in einer Rauchhaube zu arbeiten, wenn Sie diese Materialien verwenden.