Coincubation Assay zur Quantifizierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen Vibrio fischeri Isolaten

Unser Protokoll bietet einen einfachen, aber robusten Ansatz zur Identifizierung und Charakterisierung von Wettbewerbsmechanismen zwischen verschiedenen Stämmen von Vibrio fischeri Bakterien. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die verschiedene Antibiotikaresistenzgene und fluoreszierende Proteine kodieren, die eine differenzierte Auswahl und visuelle Diskriminierung jedes Bakterienstamms in einer gemischten Kultur ermöglichen. Um zu beginnen, verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um die Zellen von der Agarplatte in der Größe eines Reiskorns zu kratzen.

Setzen Sie die Zellen in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit einem Milliliter LBS-Brühe wieder aus. Um die Zellklumpen aufzubrechen, drücken Sie sie in die Seite des Rohres und dann Pipette nach oben und unten kräftig. Schließen Sie die Röhre und den Wirbel für ein bis zwei Sekunden, und wiederholen Sie, wenn die Zellklumpen noch sichtbar sind, bis die Probe visuell einheitlich ist.

Wiederholen Sie diese Vorbereitungsschritte vom Zellabkratzen bis zum Wirbeln für alle Proben. Messen und erfassen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern für alle Proben. Um eine genaue OD-Messung zu erhalten, verdünnen Sie die Proben bis zu 10-fach mit LBS-Brühe.

Normalisieren Sie dann jede Probe auf den gewünschten OD 600. Um die Referenzdehnung und die Konkurrenzdehnung in einem Verhältnis von eins zu eins zu mischen, fügen Sie 100 Mikroliter jeder zu OD 1.0 normalisierten Sorte zu einem beschrifteten 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr und Wirbel für ein bis zwei Sekunden hinzu. Mischen Sie als Steuerung die Referenzdehnung mit einer differenziell getaggten Version von sich selbst und Wirbel.

Es ist entscheidend, das richtige Startverhältnis zu erreichen, da es das Ergebnis des Experiments erheblich verändern kann. Um den Erfolg zu gewährleisten, kann dieser Schritt eine Optimierung für eine bestimmte Bakterienart erfordern. Nach der Wiederholung dieses Schritts für jede biologische Replikation sollte es vier biologische Replikationen mit differenziell getaggten Referenzstämmen als Kontrollen und vier biologische Replikationen mit differenziell getaggten Referenz- und Mitbewerberstämmen geben.

Um Kulturflecken zu schaffen, die nach der Inkubation für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, fügen Sie 10 Mikroliter jeder Kontroll- und Versuchsmischung auf eine Petriplatte mit LBS-Agar ein. Nachdem die Flecken auf der Bank vollständig getrocknet sind, bebrüten die Teller 24 Stunden lang bei 24 Grad Celsius. Um Kulturflecken zu schaffen, die verwendet werden, um die Koloniebildenden Einheiten für jeden Stamm am Ende des Experiments zu quantifizieren, fügen Sie 10 Mikroliter jeder Steuerung und experimentelle Mischungen in 24 Brunnenplatten ein, die einen Milliliter LBS-Agar pro Brunnen enthalten.

Nachdem die Flecken vollständig getrocknet sind, bebrüten die Teller bei 24 Grad Celsius für fünf Stunden. Um eine serielle Verdünnung von Beginnen coinkubationsmischungen durchzuführen, drehen Sie eine 96 Wellplatte um 90 Grad, so dass es acht Spalten und 12 Reihen gibt. Beschriften Sie jede Zeile mit der Stamm-ID, der Replikationsnummer und der Zeit, die mit t Null beginnt.

Etikettieren Sie die LBS-Agarplatten, die mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt werden, um die Verdünnungsserie zu erkennen, und stellen Sie sicher, dass sie feststellen, für welchen Stamm jede Antibiotikaplatte ausgewählt wird. Mit einer Mehrkanalpipette 180 Mikroliter LBS-Brühe zu jedem Brunnen hinzufügen und die erste Säule für die unverdünnte Coinkubationsmischung leer lassen. Mit einer 200-Mikroliter-Einkanalpipette 100 Mikroliter des Coinkubationsgemisches vom Rohr auf den ersten Brunnen der ersten Kolonne übertragen, dann die Spitze entsorgen und für alle Coinkubationsmischungen wiederholen.

Mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter von Spalte eins auf Spalte zwei und Pipette nach oben und unten übertragen, um sie zu mischen. Verwerfen Sie die Spitzen, und wiederholen Sie für jede Spalte, während sie mit der Anzahl der Pipetten nach oben und unten für jede Verdünnung konsistent ist. Am Ende enthält jede Zeile eine 10-fache serielle Verdünnung der ursprünglichen Mischung.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette mit acht Spitzen, um fünf Mikroliter aus jedem Brunnen in einer Verdünnungsserie zu aspirieren und auf die Kanamycin ergänzte LBS Agarplatte zu erkennen, die für die Referenzdehnung ausgewählt wird. Wiederholen Sie diesen Schritt, um für die Konkurrenz-Dehnungssuche auf der Chloramphenicol-Ergänzungsplatte auszuwählen. Nachdem die Flecken vollständig getrocknet sind, legen Sie die Teller bei 24 Grad Celsius in den Brutkasten.

Nachdem die Coinkubationsstellen und die 24 Brunnenplatten fünf Stunden lang bei 24 Grad Celsius inkubiert wurden, fügen Sie jedem Brunnen jeweils einen Milliliter LBS-Brühe hinzu. Resuspendieren Sie durch Pipettieren nach oben und unten, bis alle Zellen resuspendiert wurden, da sie mit der Kraft übereinstimmen, in der die Zellen über alle Replikationen resuspendiert werden. Sobald jeder Coinkubationspunkt resuspendiert ist, bereiten Sie eine 96-Well-Platte für eine serielle Verdünnung und LBS-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika vor, auf denen die Verdünnung auf die gleiche Weise wie zuvor zu erkennen ist.

Um die serielle Verdünnung für t-Endmessungen in den 24 Wellplatten abzuschließen, führen Sie Schritte zur seriellen Verdünnung des Startinokulums durch und erkennen Sie jede Verdünnung auf LBS-Agarplatten wie bisher. Fahren Sie mit der Abbildung der Coinkubationsflecken auf den Petriplatten und der Datenanalyse fort, wie im Manuskript beschrieben. Bei der experimentellen Behandlung sind der Referenzstamm und der Konkurrenzstamm 1 zu Beginn und am Ende des Experiments im Einklang mit der Kontrollbehandlung bei einem Anteil von 0,5 vorhanden.

Die Log-RCI-Werte unterschieden sich statistisch nicht von Null für die Kontrollbehandlung oder wenn der Referenzstamm mit Demierstamm eins inkubiert wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass es keinen Wettbewerb zwischen der Referenzbelastung und der Konkurrenzbelastung gab. Im Gegensatz dazu verringerte sich der Referenzstamm von einem Anteil von 0,5 zu Beginn auf einen Anteil von weniger als 0,01 am Ende des Experiments, als der Referenzstamm mit dem Wettbewerberstamm zwei inkubiert wurde.

Darüber hinaus waren die Log-RCI-Werte deutlich größer als Null, wenn der Referenzstamm mit dem Konkurrenzstamm zwei inkubiert wurde. Zusammen deuten diese Daten darauf hin, dass der Anteil der Referenzspannung in Gegenwart von Wettbewerberstamm zwei abnahm, was auf einen Wettbewerb zwischen den Stämmen hindeutet. Als der Referenzstamm mit der Konkurrenzsorte 1 inkubiert wurde, nahmen die KBE beider Stämme im Laufe von fünf Stunden zu und unterschieden sich nicht wesentlich, was darauf hindeutet, dass es zu keinem Wettbewerb kam.

Außerdem wurde eine Erholung von ca. 3200% beobachtet, die sich statistisch nicht von der Kontrolle unterscheidet. Wenn jedoch der Referenzstamm mit dem Konkurrenzstamm zwei inkubiert wurde, waren die Referenzstamm-KBE mit fünf Stunden deutlich niedriger als die Vonspannung zwei KBE in der Kontrolle. Außerdem wurde eine Erholung von ca. 4% deutlich niedriger beobachtet als die Kontrolle.

Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass Stamm zwei den Referenzstamm durch Dasabtöten seiner Zellen konkurrierten. Der wichtigste Schritt in diesem Verfahren ist das Erreichen des richtigen Startverhältnisses, da es die Ergebnisse erheblich beeinflussen kann.