Name: Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit Alu-Element-Minigenen zirkuläre RNAs generieren und deren Funktion sowie Krankheitsrelevanz analysieren. Diese Methode ermöglicht alternative Splicing-Studien in der Molekularbiologie.

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Diese Arbeit wurde vom DoD-Zuschuss des Verteidigungsministeriums AZ180075 unterstützt. Stefan Stamm dankt Jacqueline Noonan Endowment. Unterstützt wurde Anna Pawluchin vom DAAD, dem deutschen akademischen Austauschprogramm, Justin R. Welden erhielt den Max Steckler Award der University of Kentucky.

1. Konstruktion der Konstrukte
<ol><li>Verwenden Sie den UCSC-Genombrowser24, um sich wiederholende Elemente zu identifizieren, die für die kreisförmige RNA-Bildung erforderlich sind, und integrieren Sie sie in die Konstrukte. Wichtig ist, dass Primer für die Verstärkung außerhalb der sich wiederholenden Elemente liegen müssen.</li>
	<li>Fügen Sie die kreisförmige RNA-Sequenz(Supplemental Abbildung 1 ist eine Testsequenz) in <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start" target="_blank">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start</a> ein und wählen Sie den richtigen Organismus aus. Senden Sie die Sequenz und gehen Sie zur Browseransicht, zoomen Sie 1,5x oder ggf. (Abbildung 2A). HINWEIS: Die Suchsequenz wird in der oberen Zeile(Abbildung 2A, 1) angezeigt. Abhängig von der Reihenfolge der Exons in der kreisförmigen RNA verbindet BLAT nicht alle Exons. In diesem Beispiel ist exon 12 (Abbildung 2A, 4) nicht mit 11 verbunden ( Abbildung2A, 2, 3), da exon 12 vor Exon 11 in der kreisförmigen RNA-Sequenz (Supplementale Abbildung 1) liegt. Die sich wiederholenden Elemente befinden sich in der Spur "Wiederholungsmasker", die durch Kästchen gekennzeichnet ist, wobei die farbeschwarze bis graue Farbe die evolutionäre Konservierung anzeigt (Abbildung 2A, 5).</li>
	<li>Bewegen Sie die Maus über die sich wiederholenden Elemente, um ihren Subtyp in einem unverankerten Fenster zu identifizieren. Alu-Elemente befinden sich in der SINE-Linie (kurz durchsetztes Kernelement). Verwenden Sie die Schaltfläche "Standardspuren" unter dem Fenster, um den Browser zurückzusetzen, wenn ein anderes Bild als Abbildung 2 erhalten ist. HINWEIS: Das Mousing über die Exons in der Genanzeige erzeugt ein Fenster mit Exon-Nummern, die computergeneriert sind. Diese Zahlen entsprechen nicht der in der Literatur festgelegten Exonnummerierung und wechseln auch zwischen Isoformen.</li>
</ol>2. Wählen Sie die Sequenz aus, die in einem Ausdrucksvektor geklont werden soll.
<ol><li>Laden Sie die im Fenster gezeigte DNA-Sequenz herunter, indem Sie in der oberen Zeile des UCSC-Genombrowsers die Ansichts-DNA aufrufen. Wählen Sie in der Option Sequencing Formatting OptionErweiterte Fall-/Farboptionenaus.</li>
	<li>Wählen Sie die Standardgroß-Kleinschreibung als Niedriger aus, und wählen Sie die Umschaltanfrage für NCBI refseqaus. Wählen Sie Unterstreichung und Fett und Kursiv für Repeat Maskeraus. Klicken Sie auf Senden. Es wird Exons als Großbuchstaben und Introns als kleine Buchstaben geben. Überprüfen Sie die Exon-/Intron-Grenzen.</li>
	<li>In diesem Beispiel gibt es eine 'ccctttacCTTTTT' Sequenz, die angibt, dass der Browser die umgekehrte Ergänzung anzeigt. Wenn dies der Fall ist, gehen Sie zurück und wählen Sie das umgekehrte Komplementfeld aus, bis Sie die richtigen Exon-Intron-Grenzen (agEXONgt) sehen, in diesem Beispiel AAAAAGgtaaaggg.</li>
	<li>Kopieren Sie die Datei mit der richtigen Ausrichtung (interne Exons sind von intronic ag umgeben... gt) in ein Textverarbeitungsdokument einfließen und die Exons hervorheben (Ergänzende Abbildung 2). HINWEIS: In diesem Beispiel ist das genomische Fragment, das die Exons 9-12 umfasst, etwa 24 kb groß und damit zu groß, um aus der genomischen DNA verstärkt zu werden. Daher wird jedes Exon, das von ca. 1 kb intronic-Region umgeben ist, individuell verstärkt und diese vier Fragmente werden in einem Klonvektor zusammengesetzt.</li>
	<li>Wählen Sie die zu verstärkenden Fragmente aus (exon 500 nt intron). Stellen Sie sicher, dass das Intron nicht in einem sich wiederholenden Bereich beginnt oder endet, da Primer in diesen Regionen bestimmte Sequenzen nicht verstärken. Die ausgewählten Regionen sind in Abbildung 2Bdargestellt, ihre Sequenzen in der ergänzenden Abbildung 3. ANMERKUNG: Im Allgemeinen gilt: Je größer die Konstrukte, desto schwieriger wird das Klonen. Die Fragmente können entweder schrittweise zusammengesetzt werden (d.h. exon 9 wird mit dem Vektor kombiniert und im nächsten Schritt wird exon 10 durch Klonen in dieses Konstrukt eingeführt, bis alle Exons an Ort und Stelle sind), oder alternativ werden alle Fragmente gleichzeitig zusammengesetzt. Ein schrittweiser Ansatz funktioniert immer, erfordert aber mehr Zeit. Eine gleichzeitige Baugruppe funktioniert nicht immer und hängt davon ab, wie gut die einzelnen Fragmente aus der genomischen DNA verstärkt werden können und wie groß das Konstrukt ist. Wir beginnen daher in der Regel mit beiden Ansätzen gleichzeitig.</li>
</ol>3. Design-Primer zum Klonen
<ol><li>Verwenden Sie ein Web-Tool (<a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a>), um die Primer für das Klonen zu entwerfen. Geben Sie beispielsweise die Fragmente 9, 10, 11 und 12 und die Vektorsequenz (Ergänzende Abbildung 3) in dieses Werkzeug ein.</li>
	<li>Fügen Sie für die Vektorsequenz die Einfügestelle als letztes Nukleotid hinzu, und fügen Sie anschließend die Fragmente hinzu. Da die Vektornummerierung nicht mit einer bestimmten Einfügestelle beginnt, befindet sich die Einfügestelle im Vektor und das nachgeschaltete Teil wird vor der Upstream-Sequenz eingelagert. In diesem Beispiel beginnen die Einfügungen direkt nach der HindIII [AAGCTT]-Site und enden direkt nach der PmeI [GTTTAAAC]-Site von pcDNA3.1. Die Sequenz von cccgctgatcag ... ccgtaaaaaggccgc wird vor Position 1 in der pcDNA3.1-Sequenz (gttgctggcgtttttcc ...) eingefügt.</li>
	<li>Passen Sie Primer an, wenn ihre Schmelzpunkte mehr als 4 °C voneinander entfernt sind, da sie bei der Verstärkung nicht funktionieren. Die Montage der entworfenen Fragmente und Primersequenzen ist in der ergänzenden Abbildung 4dargestellt. Primer zum Klonen können auch manuell25entworfen werden.</li>
</ol>4. PCR- und Amplicon-Erkennung
<ol><li>Standard-PCR-Reaktion: Machen Sie einen Reaktionsmix für ein Gesamtvolumen von 50 l pro Reaktion. Unten ist das Rezept für eine Reaktion mit Polymerase 1: 10 l 5x Reaktionspuffer 1 L mit 10 mM dNTPs 2,5 l von 10 m Vorwärts-Primer 2,5 l von 10 m Reverse Primer 0,5 l Polymerase 1 32,5 l Nukleasefrei H2O<ol>
<li>Optional fügen Sie 10 l 5x GC Enhancer hinzu, wenn das Produkt einen hohen GC-Gehalt aufweist; eine separate Mischung mit GC Enhancer herstellen, um die PCR-Reaktion zu testen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 49 l der Mischung in PCR-Röhren pro Reaktionsprobe.</li>
	<li>Fügen Sie der PCR 1 l DNA hinzu, die Menge reicht von 10 pg bis 1 ng.</li>
	<li>Drehen Sie die Proben herunter, um Rückstände von den Seiten zu entfernen und legen Sie sie in eine PCR-Maschine. Verwenden Sie bei der Optimierung der PCR-Bedingungen die gleiche Maschine sowie die gleichen Stellen in der Maschine.</li>
</ol>5. Optimierung für längere DNA-Fragmente für die Verwendung verschiedener Polymerasen
<ol><li>Temperatur<ol>
<li>Optimieren Sie die Langstrecken-Polymerase 2.<ol>
<li>Verwenden Sie eine niedrigere Denaturierungstemperatur (Polymerase 1: 98 °C, Polymerase 2: 94 °C).</li>
			<li>Verwenden Sie eine längere Denaturierungszeit (Polymerase 1: 10 s, Polymerase 2: 30 s).</li>
			<li>Verwenden Sie eine längere Glühzeit (Polymerase 1: 30 s, Polymerase 2: 60 s).</li>
			<li>Verwenden Sie eine längere Verlängerungszeit (Polymerase 1: 30 s/kb, Polymerase 2: 50 s/kb).</li>
			<li>Verwenden Sie eine niedrigere Durchwahltemperatur (Polymerase 1: 72 °C, Polymerase 2: 65 °C).</li>
			<li>Verwenden Sie eine Glühtemperatur 5 °C unter dem Tm der Primer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Optimieren Sie die Primerkonzentrationen (5x weniger bis 5x mehr als die ursprüngliche Primerkonzentration). Optimieren Sie DNA-Konzentrationen von 10 pg bis 50 pg, 100 pg, 1 ng, 5 ng, 10 ng.</li>
		<li>Als Beispiel für ein PCR-Programm zur Verstärkung einer Produktgröße von 15 kb mit Polymerase 2 eine anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 30 s, DNA-Denaturierung bei 94 °C für 30 s, gefolgt von Glühen bei 58 °C für 30 s und DNA-Verlängerung bei 65 °C für 12 min 30 s. Führen Sie eine Endverlängerung bei 65 °C für 10 min mit einem letzten 4 °C Halten durch. HINWEIS: Die glühende Temperatur (Ta) spezifisch für die Primer, die durch webbasierte Temperaturberechnungen bestimmt werden, die für jede Polymerase spezifisch sind. Erweiterungszeiten können variieren und müssen optimiert werden, wenn Fragmente größer als 10 KB sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verlängerungszeiten und DNA-Konzentrationen<ol>
<li>Verwenden Sie längere Verlängerungszeiten für DNA-Fragmente über 6 kb: 1 min pro 1 kb. Längere Fragmente sollten weniger DNA verwenden.</li>
		<li>Führen Sie Verdünnungen der DNA durch, um die optimale DNA-Konzentration für die Amplifikation zu finden, in der Regel 1 pg bis 1 ng für Plasmide oder 1 ng bis 1 g für genomische DNA. HINWEIS: Für die meisten Klonen verwenden Polymerase 1, entwickelt durch Verschmelzung der Sso7d DNA-Bindungsdomäne zu einer proprietären thermostabilen DNA-Polymerase26. Die Polymerase hat eine niedrige Fehlerrate und aufgrund der Sso7d-Domäne eine hohe Prozessivität, die benötigt wird, um große (10-15 kb) genomische Fragmente zu verstärken. Aufgrund dieser großen Fragmentgröße wird die enzymatische Montage von DNA-Molekülen27 zum Einführen in Vektoren verwendet, da diese Methode keine Restriktionsenzyme erfordert. Die Verstärkung von Fragmenten mit mehr als 15 kb wird mit polymerase 1 immer schwieriger. Für große Fragmentverstärkung verwenden Polymerase 2 aus Pyrococcus-wie Korrektur-Polymerase verschmolzen zu Sso7d oder die Langstrecken-PCR-Kit, die jedoch höhere Fehlerraten gibt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Reinigung von PCR-Produkten zum Klonen
<ol><li>Führen Sie die Hälfte der PCR-Produkte auf 1% Agarose-Gelen, die einen interkalierenden Nukleinsäurefleck enthalten (z. B. 1x GelGreen). Visualisieren Sie die gefärbten Gele auf einem dunklen Lesetransilluminator. Diese gebeizte DNA läuft nicht größengetreu. HINWEIS: GelGreen intercalates in DNA, ähnlich wie Ethidiumbromid, aber es wird durch Licht um 500 nm (Cyan) angeregt, eine Wellenlänge, die dna nicht schädigt, was das Klonen stark verbessert.</li>
	<li>Parallel dazu die Hälfte der PCR-Produkte auf einem 1%-Gel ausführen, das nach dem Lauf mit Ethidiumbromid gebeizt wird (Abbildung 3A,B).</li>
	<li>Verbrauchen Sie Bänder der richtigen Größe aus dem gebeizten Gel (Schritt 6.1) und isolieren SIE DNA mit einem Gel und PCR Cleanup Kit. Abweichend von seinem Standardprotokoll wird die DNA in nur 20 l doppelt destilliertem Wasser, da die DNA-Konzentrationen in der Regel niedrig sind, elute.</li>
	<li>Überprüfen Sie vor dem Klonen die isolierte DNA eines Agarose-Gels auf Konzentration und Integrität (Abbildung 3B). Ziel für eine 2:1 Molaren-Einsatz-Vektor-Verhältnis. Bei Verwendung mehrerer Einsätze beträgt das Verhältnis 2:2:2:1.</li>
</ol>7. DNA-Montage und Klon-Erkennung
HINWEIS: Das Klonen erfolgt mit einem enzymatischen DNA-Montagekit mit geringfügigen Modifikationen. Die Montage erfolgt für 60 min bei 50 °C und in der Regel wird der untere DNA-Bereich für die Montage verwendet (20-100 fmol/20 l Reaktion). Der gesamte Reaktionsmix wird chemisch kompetenten Zellen zugesetzt und die ganzen Zellen auf einer 6 cm Agarplatte plattiert.
<ol><li>Kombinieren Sie den Vektor und fügen Sie in einem 1:2-Molarenverhältnis (je 20-500 Fmol) in 10 l Wasser ein.</li>
	<li>Fügen Sie 10 L DNA Assembly Master Mix hinzu.</li>
	<li>Proben 60 Minuten bei 50 °C inkubieren.</li>
	<li>Als nächstes transformieren Sie kompetente Zellen mit der Gesamtmontagereaktion. Verwenden Sie hier E. coli-Stamm 1-Zellen für kürzere Konstrukte oder E. coli-Stamm 2-Zellen für längere oder instabile Konstrukte. Die Zellen sollten in einem Volumen von 50 l sein.</li>
	<li>Die Zellen auf Demeis auftauen und den kompetenten Zellen 2 L des gekühlten, zusammengesetzten Produkts hinzufügen. Mischen Sie durch sanftes Streichen der Röhre 4-5 mal. Wirbel nicht.</li>
	<li>Lassen Sie die Mischung 30 min auf dem Eis sitzen.</li>
	<li>Hitzeschock bei 42 °C für 30 s. Nicht mischen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Röhre für 2 min zurück auf das Eis.</li>
	<li>Fügen Sie dem Rohr 950 L RAUMtemperatur-SOC-Medien hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Reaktionsrohr bei 37 °C für 60 min. Kräftig schütteln (300 U/min).</li>
	<li>Warme Selektionsplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum während der Inkubation bei 37 °C.</li>
	<li>Pellet die Zellen durch Zentrifugation (10.000 x g, 30 s) und Platte aus 1/4 und 3/4 der Zellen auf zwei Selektionsplatten und inkubieren bei 37 °C über Nacht.</li>
</ol>8. Validierung von Klonen
<ol><li>Verwenden Sie Kolonie-PCR, wobei PCR-Primer verwendet werden, die die Montagestandorte überspannen (Abbildung 1C) für die Erkennung.</li>
	<li>Nehmen Sie einen sterilen Zahnstocher und berühren Sie eine einzelne Bakterienkolonie.</li>
	<li>Berühren Sie den Boden eines PCR-Rohrs mit dem Zahnstocher, der die Kolonie hat, und streifen Sie dann den Zahnstocher auf einer Antibiotikum-Agarplatte, bebrüten Sie die gestreifte Platte bei 37 °C oder Raumtemperatur für empfindliche Konstrukte über Nacht.</li>
	<li>Überlagerung der PCR-Röhre, die mit der Kolonie berührt wurde, mit einem PCR-Mix, der die Erkennungsprimer enthält. Diese werden mit Primer 3 (<a href="http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/" target="_blank">http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</a>) entwickelt. Das Programm hat die Möglichkeit, das Primerdesign über eine definierte Sequenz zu erzwingen, indem die "[ccc]"-Zeichen verwendet werden, um Primer über den Baugruppenknoten auszuwählen. DNA von positiven Stämmen wird isoliert und durch Sequenzierung verifiziert.</li>
</ol>9. Analyse von kreisförmigen RNA-exemittiven Reportergenen
<ol><li>Zur Analyse, transfekieren Reporter Gene in eukaryotische Zellen. Verwenden Sie hier HEK293-Zellen (ATTC #CRL-1573), da sie eine hohe Transfektionseffizienz bieten. Um Kosten zu sparen, verwenden Sie PEI-Lösungen (Polyethylenimin).</li>
	<li>Für die PEI-Lösung lineares Polyethyleneiminhydrochlorid (PEI) bei 1 mg/ml in Wasser bei niedrigem pH-Wert, pH2 auflösen. Den pH-Wert mit NaOH auf 7 hochbringen. Sterilfilter mit 0,22 m Filtern und bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Teilen Sie Zellen in sechs Brunnen (ca. 150.000 Zellen pro Brunnen) auf und lassen Sie sie über Nacht in 10% FBS in DMEM-Medien wachsen.</li>
	<li>Aliquot 1 g des Reporter-Gens in einer sterilen Röhre und fügen Sie 200 l steril gefiltert150 mM NaCl hinzu. Mischen Sie mit der DNA durch Wirbeln.</li>
	<li>Fügen Sie PEI-Lösung zu dieser Mischung und Wirbel, kurz Zentrifuge, um Proben am Boden des Rohres zu sammeln. Verwenden Sie ein Verhältnis von 1 g DNA pro 3 l PEI.</li>
	<li>Bei Raumtemperatur 10 min inkubieren und dann direkt zu HEK 293 Zellen hinzufügen.</li>
	<li>HEK293-Zellen bei 37 °C, 5%CO2über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Isolieren Sie RNA für RT-PCR über ein RNA-Isolationskit.</li>
</ol>10. RNase R Behandlung zur Entfernung linearer RNAs
<ol><li>Verwenden Sie 10 g Gesamt-RNA in einer RNase-freien Röhre.</li>
	<li>10 l 10x RNase R Puffer (0,2 M Tris-HCl (pH 8,0), 1 M KCl, 1 mM MgCl2) zur RNA geben.</li>
	<li>RNase R der RNA hinzufügen (1 l = 20U).</li>
	<li>Fügen Sie der RNA 1 l Glykolblau hinzu und bringen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf bis zu 100 l.</li>
	<li>Proben bei 37 °C für 30 min inkubieren.</li>
	<li>1 min Phenol/Chloroform und Wirbel hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 21.000 x g für 1 min zu trennenden Phasen.</li>
	<li>Nehmen Sie den Überstand (wässrige Phase) und fügen Sie 1 Volumen (ca. 80 l Chloroform) hinzu.</li>
	<li>Wirbel für 1 min, und dann Zentrifuge für 1 min zu trennen Phasen.</li>
	<li>Überstand nehmen, 1:10 vol KAc und 2,5 Vol Ethanol hinzufügen und bei -20 °C für 1-4 h niederschlagen. Zentrifuge bei 4 °C für 30 min bei voller Geschwindigkeit (21.000 x g). Es wird ein kleines blaues Pellet an der Unterseite sein.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 80% Ethanol. Lassen Sie die Luft für 5 min bei Raumtemperatur trocknen und lösen Sie sie in 10 l Wasser auf.</li>
</ol>11. RT-PCR-Analyse
<ol><li>Verwenden Sie pro RT-Reaktion 1 g RNA.</li>
	<li>Machen Sie eine Reaktionsmischung für ein Endvolumen von 20 l pro Reaktion. Für eine Reaktion verwenden Sie 1 l mit 10 mM dNTPs, 1 l 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 4 l 5x First-Strand Buffer und 0,5 l Reverse Transcriptase.</li>
	<li>Aliquot 6,5 L Reaktionsmischung in neue PCR-Röhren.</li>
	<li>Mischen Sie bis zu 5 Primer in einem Mix. Einige Primer können jedoch mit anderen Primern in der PCR(Abbildung 5) nicht miteinander verzahnt werden. Primersequenzen befinden sich in Tabelle 2. Wir verwenden routinemäßig genspezifische Exon-Junction-Primer, aber auch das Priming mit zufälligen Hexamern ist möglich.</li>
	<li>Fügen Sie dem gewünschten RT-Reaktionsrohr 1 l von 10 M Reverse Primer hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie dem PCR-Reaktionsröhrchen 1 g RNA hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie RNase-freieH2O bis zu einem Gesamtvolumen von 20 l hinzu.</li>
	<li>Spin Rohre nach unten, um Rückstände auf der Seite der Rohre zu entfernen und in Thermocycler zu platzieren.</li>
	<li>Führen Sie die RT-Reaktion im Thermocycler bei 50 °C 50 Minuten lang aus.</li>
	<li>Bewahren Sie RT cDNA bei -20 °C auf oder fahren Sie mit der PCR-Reaktion fort.</li>
</ol>

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</ol>

Nichts zu verraten.

Im Allgemeinen sind kreisförmige RNAs niedrig reichlich1, was die Untersuchung ihrer Funktion und Bildung erschwert. Ähnlich wie bei linearen RNAs13ermöglicht die Verwendung von Reporter-Minigenes die Identifizierung von cis und trans-wirkenden Faktoren, die die Bildung von kreisförmigen RNAs regulieren. So erzeugt dieser Ansatz Hypothesen, die mit den endogene Genen weiter getestet werden können.
Der wichtigste Schritt ist das Design des Reporte...

Zirkuläre RNAs Circular RNAs (circRNAs) sind kovalent geschlossene einsträngige RNAs, die in den meisten Organismen exprimiert werden. Sie werden erzeugt, indem sie eine nachgelagerte 5' Spleißstelle zu einem vorgelagerten 3' Spleißstandort verbinden, ein Prozess, der als Back-Spleicing bezeichnet wird (Abbildung 1A)1. Sequenzen in der Pre-mRNA, die eine Basis komplementär wie 30-40 nt aufweisen, bringen Back-Splice-Sites in die richtige Ausrichtung für die zirkRNA-Bildung2. Beim Menschen bilden Alu-Elemente 1, die etwa 11% des Genoms3darstellen, aufgrund ihrer Selbstkomplementärität4,5 umfangreiche doppelsträngige RNA-Strukturen in pre-mRNA und fördern damit die Bildung von CircRNAs1.
Derzeit wurden drei Hauptfunktionen von circRNAs beschrieben. Einige circRNAs binden microRNAs (miRNAs) und wirken durch Sequestrierung wie miRNA Schwämme6. CircRNAs wurden in die transkriptionelle und posttranskriptionelle Regulierung, durch Wettbewerb mit linearer Spleißung7 oder Modulation der Transkriptionsfaktoraktivität8verwickelt. Schließlich enthalten circRNAs kurze offene Leserahmen und Grundsatzstudien zeigen, dass sie9,10übersetzt werden können. Die Funktion der meisten circRNAs bleibt jedoch rätselhaft. Die meisten zirkulären RNAs wurden mit den Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation11erkannt. Detaillierte Analysen einzelner Gene mit gezielten RT-PCR-Ansätzen zeigen, dass eine große Anzahl von kreisförmigen RNAs noch entdeckt werden muss12.
Einsatz von Reportergenen zur Analyse der Pre-mRNA-Verarbeitung Die Analyse von mRNA, die von DNA-Reporterkonstrukten abgeleitet wurde, die in Zellen transfiziert werden, ist eine etablierte Methode zur Untersuchung alternativer Pre-mRNA-Spleißungen, die auf kreisförmige RNAs angewendet werden können. Im Allgemeinen werden das alternative Exon, seine umgebenden Introns und konstitutive Exons verstärkt und zu einem eukaryotischen Expressionsvektor geklont. Häufig werden die Introns verkürzt. Die Konstrukte werden in eukaryotische Zellen transfiziert und in der Regel von RT-PCR13,14analysiert. Dieser Ansatz wurde ausgiebig verwendet, um regulatorische Spleißstellen und transacting Faktoren in Co-Transfektionsexperimenten13,15,16,17,18zu kartieren. Darüber hinaus ermöglichte die Erzeugung von proteinexstigen Minigenen das Screening von Substanzen, die alternative Spleißen ändern19,20.
Die Methode wurde auf zirkuläre RNAs angewendet. Derzeit sind mindestens 12 Minigen-Rückgrate in der Literatur beschrieben und in Tabelle 1zusammengefasst. Mit Ausnahme des tRNA-basierten Expressionssystems21,22sind sie alle von Polymerase-II-Promotoren abhängig. Hier beschreiben wir eine Methode zur Generierung menschlicher Reporter-Minigene, um cis und trans-acting Faktoren zu bestimmen, die an der Erzeugung von kreisförmigen RNAs beteiligt sind. Eine Übersicht über die Methode anhand von Sequenzen eines veröffentlichten Reportergens23 ist in Abbildung 1dargestellt.

<table><tbody><tr><td>(PEI) Hydrochlorid</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>Bauwerkzeug</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator.</td><td>Clare Chemical Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assemblierungskit für enzymatische DNA</td><td>NEB</td><td>E2621S</td><td></td></tr><tr><td>Gel- und PCR-Aufreinigungskit</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Glyco Blue</td><td>Thermo</td><td>Fisher AM9516</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 Klonierungsstelle</td><td>Polyklonierungsstelle</td><td></td><td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf" target="_blank">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf</a></td></tr><tr><td>Polymerase 1</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Q5 DNA-Polymerase</td></tr><tr><td>Polymerase 2</td><td>Biorad</td><td>1725310</td><td>Long Range Polymerase (NEB), iproof (BioRad)</td></tr><tr><td>Polymerase 2</td><td>Qiagen</td><td>206402</td><td>Qiagen Long Range Polymerase</td></tr><tr><td>Kit Reverse Transkriptase</td><td>Thermo Fisher</td><td>18080044 RNA-Isolationskit</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>12183025</td><td>Ambion von Life Technologies</td></tr><tr><td>RNAse R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td>Epicenter/Lucigen</td></tr><tr><td>Stabile kompetente Zellen</td><td>NEB</td><td>C3040H</td><td>NEB stabile Zellen</td></tr><tr><td>Standard Klonierung von Bakterien</td><td>NEB</td><td>C2988J</td><td>NEB5-alpha kompetentes Web-Tool</td></tr><tr><td>zum Entwerfen von Primern</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a>Webbasierte</td></tr> <tr><td>Temperaturberechnungen</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main</a></td></tr></tbody></table>

verwendung von alu-element enthaltenden minigenes zur analyse von kreisförmigen rnas

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Neben linearen mRNAs erzeugen viele eukaryotische Gene kreisförmige RNAs. Die meisten kreisförmigen RNAs werden generiert, indem eine 5' Spleißstelle mit einer vorgelagerten 3' Spleißstelle innerhalb einer Pre-mRNA, einem Prozess, der als Back-Spleicing bezeichnet wird, angeschlossen wird. Diese Zirkularisierung wird wahrscheinlich durch sekundäre Strukturen in der Pre-mRNA unterstützt, die die Spleißstellen in die Nähe bringen. In menschlichen Genen werden Alu-Elemente gedacht, um diese sekundären RNA-Strukturen zu fördern, da Alu-Elemente reichlich vorhanden sind und Basiskomplementaritäten miteinander aufweisen, wenn sie in entgegengesetzten Richtungen in der Pre-mRNA vorhanden sind. Hier beschreiben wir die Erzeugung und Analyse großer Alu-Elemente, die Reportergene enthalten, die kreisförmige RNAs bilden. Durch die Optimierung von Klonprotokollen können Reportergene mit bis zu 20 kb Insert-Länge erzeugt werden. Ihre Analyse in Co-Transfektionsexperimenten ermöglicht die Identifizierung regulatorischer Faktoren. So kann diese Methode RNA-Sequenzen und zelluläre Komponenten identifizieren, die an der kreisförmigen RNA-Bildung beteiligt sind.

Reportergene ermöglichen die Bestimmung regulatorischer Faktoren, die die zirkuläre RNA-Bildung beeinflussen. Diese Reportergene sind jedoch groß und enthalten sich wiederholende Elemente, die DNA-Konstrukte oft instabil machen. Aufgrund ihrer großen Größe ist es oft notwendig, Teile der Introns zu löschen, was durch die Verstärkung genomischer Teile mit den Exons und kleineren flankierenden intronischen Teilen erreicht wird. Diese DNA-Stücke werden enzymatisch zusammengesetzt, so dass Enzyme ohne Einschränkung aufgebaut...

Wir klonen und analysieren Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen. Diese Reportergene sind größer als Konstrukte, um lineare Spleißungen zu analysieren und Alu-Elemente zu enthalten. Zur Untersuchung der kreisförmigen RNAs werden die Konstrukte in Zellen transfiziert und die resultierende RNA wird mit RT-PCR nach Entfernung linearer RNA analysiert.

Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es dem Benutzer ermöglicht, ein genomisches Expressionssystem zu erzeugen, das alternatives Spleißen durchlaufen kann und in diesem Fall kreisförmige RNAs bildet, die auf ihre Funktion und Krankheitsassoziation getestet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie anderen den Weg ebnen wird, dieses Protokoll in der Molekularbiologie und beim Klonen zu verwenden, wenn sie alternatives Spleißen in der kreisförmigen RNA-Bildung und -Funktion untersucht. Mein Rat an jemanden, der diese Technik zum ersten Mal versucht, wäre, die PCR-Bedingungen zu optimieren.Führen Sie Gradienten oder führen Sie Touchdown-PCR mit unterschiedlichen Glühtemperaturen und Verlängerungszeiten durch. Normalerweise verlängern längere Fragmente über sechs KB eine KB pro Zyklus und verschiedene Glühtemperaturen müssten auf die beste Verstärkung getestet werden. Die Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie den Benutzern eine bessere visuelle Darstellung der schwierigeren Aspekte des Verfahrens, insbesondere der Generierung von Primern, geben wird.Um dieses Verfahren zu beginnen, laden Sie den UCSC Genome Browser und verwenden Sie ihn, um sich wiederholende Elemente zu identifizieren, die für die kreisförmige RNA-Bildung notwendig sind, und integrieren Sie sie in die Konstrukte. Wichtig ist, dass Primer für die Verstärkung außerhalb der sich wiederholenden Elemente liegen müssen. Fügen Sie die kreisförmige RNA-Sequenz in die menschliche BLAT-Suche ein und wählen Sie den richtigen Organismus aus.Senden Sie die Sequenz, wechseln Sie zur Browseransicht, und zoomen Sie 1,5 Timer oder ggf.. Als Nächstes bewegen Sie sich mit der Maus über die sich wiederholenden Elemente, um ihren Subtyp in einem unverankerten Fenster zu identifizieren. Alu-Elemente befinden sich in der Sinuslinie.Verwenden Sie die Schaltfläche "Standardspuren" unter dem Fenster, um den Browser zurückzusetzen, wenn ein falsches Bild abgerufen wird. Gehen Sie zuerst zu sehen, DNA auf der obersten Zeile des USCS Genome Browser, um die DNA-Sequenz im Fenster gezeigt herunterladen. Wählen Sie in der Formatierungsoption Sequenzierung erweiterte Groß-/Kleinformatoptionen aus.Wählen Sie die Standardgroß-Kleinschreibung als niedriger aus, und wählen Sie die Umschaltgroßteilfürgroßung für NCBI RefSeq aus. Wählen Sie unterstreichen und fett und kursiv für RepeatMasker. Klicken Sie auf Absenden.Es wird Exons als Großbuchstaben und Introns als Kleinbuchstaben geben. Überprüfen Sie die Exon-/Intron-Grenzen. Wenn der Browser die umgekehrte Ergänzung anzeigt, gehen Sie zurück und wählen Sie das umgekehrte Komplementfeld aus, bis die richtigen Exon-/Intron-Ränder angezeigt werden.Kopieren Sie als Nächstes die Datei mit der richtigen Ausrichtung in ein Textverarbeitungsdokument, und markieren Sie die Exons. Wählen Sie die zu verstärkenden Fragmente aus, um sicherzustellen, dass das Intron nicht in einem sich wiederholenden Bereich beginnt oder endet, da Primer in diesen Regionen bestimmte Sequenzen nicht verstärken. Verwenden Sie zunächst ein Webtool, um die Primer für das Klonen zu entwerfen.Fügen Sie für die Vektorsequenz die Einfügestelle als letztes Nukleotid hinzu, und fügen Sie anschließend die Fragmente hinzu. Da die Vektornummerierung nicht mit einer bestimmten Einfügestelle beginnt, befindet sich die Einfügestelle im Vektor und das nachgeschaltete Teil wird vor der Upstream-Sequenz eingelagert. Passen Sie Primer an, wenn ihre Schmelzpunkte mehr als vier Grad Celsius voneinander entfernt sind und nicht in der Verstärkung wirken.In dieser Studie werden Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen, geklont und analysiert. Optimierte PCR-Produkte werden auf einem 1%Agarose-Gel getrennt, das 1X Gel grün enthält. Die einzelnen Bänder stellen die PCR-Produkte dar, die in der enzymatischen DNA-Montage verwendet werden.Diese Bänder werden dann aus dem Gel herausgeschnitten und gereinigt. Das gereinigte PCR-Produkt läuft nicht der erwarteten Größe mit Gelgrün, so dass die Produkte auch auf einem 1%Agarose-Gel getrennt werden, das anschließend mit Ethidiumbromid gefärbt wird, um sicherzustellen, dass die Produkte die richtige Größe haben. Legen Sie zunächst ein enzymatisches DNA-Montageset vor.Kombinieren Sie den Vektor und fügt in einem Molverhältnis von eins zu zwei. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter DNA-Montage-Master-Mix hinzu. Inkubieren Sie Proben für 60 Minuten bei 50 Grad.Während der Inkubation kompetente Zellen auf Eis auftauen. Die Zellen sollten ein Volumen von 50 Mikrolitern haben. Als nächstes transformieren Sie kompetente Zellen mit der Gesamtmontagereaktion.Fügen Sie zwei Mikroliter des gekühlten, zusammengebauten Produkts zu den zuständigen Zellen hinzu. Mischen Sie, indem Sie das Rohr vier- bis fünfmal sanft streichen. Wirbel nicht.Die Mischung 30 Minuten auf Eis legen. Hitze schockieren die Mischung bei 42 Grad Celsius für 30 Sekunden. Dann legen Sie es wieder auf Eis für zwei Minuten.Danach 950 Mikroliter Raumtemperatur-SOC-Medien in die Röhre geben. Bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten inkubieren, während bei 300 RPM geschüttelt wird. Während dieser Inkubation zwei Selektionsplatten, die das entsprechende Antibiotikum enthalten, warm.Zentrifugieren Sie nach der Inkubation das Reaktionsrohr 30 Sekunden lang bei 10.000 g, um die Zellen zu pellet enzieren und 25 % der Zellen auf einer Selektionsplatte und 75 % auf der anderen zu versenken. Bebrüte diese Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bevor Sie mit der Transfektion beginnen, überprüfen Sie Ihre DNA durch Einschränkung Digest.Hier wird ein repräsentatives Tau-Minigen, das die Exons neun bis zwölf enthält, mit Restriktionsenzymen geschnitten, die auf größere Rekombinationen hinweisen. Für die Transfektion zunächst lineares Polyethylenhydrochlorid in Wasser mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter bei pH 2 auflösen. Verwenden Sie Natriumhydroxid, um den pH-Wert auf bis zu sieben zu bringen und sterile Filter die Lösung mit einem 0,22 Mikrometer Filter.Bewahren Sie die Lösung bei vier Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit ist. Dann teilen Sie die Zellen in die Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte und lassen Sie sie über Nacht bei DMEM-Medien mit 10%FBS wachsen. Am nächsten Tag aliquot ein Mikrogramm des gemeldeten Gens in einer sterilen Röhre und fügen Sie 200 Mikroliter steril gefiltertes 150 Millimolar Natriumchlorid hinzu.Mix durch Wirbel. Als nächstes fügen Sie die Polyethylenimin-Lösung zu diesem Gemisch im Verhältnis von drei Mikroliter Polyethylenimin für jedes Mikrogramm DNA hinzu. Zentrifuge kurz, um Proben an der Unterseite des Rohres zu sammeln.Inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Fügen Sie es dann direkt zu HEK293-Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Verwenden Sie am nächsten Tag ein RNA-Isolationskit, um die RNA für RT-PCR zu isolieren. cDNA aus zwei Proben aus menschlichen Hirngeweben wird mit kreisförmigen RNA-Primern circ tau exon 1210 reverse und circ tau exon 1211 nach vorne verstärkt. Während das erwartete Band, das tau-zirkuläre RNA entspricht, gesehen wird, sind die anderen starken Bänder Artefakte, die nicht mit dem menschlichen Genom übereinstimmten.Dieses Experiment wird mit identischen PCR-Bedingungen wiederholt, aber die umgekehrte Transkription wurde nur mit dem circ tau exon 1210 Reverse Primer durchgeführt. Nur das erwartete Band wird durch Sequenzierung verstärkt und validiert. Die RNA wird dann mit RNase R behandelt, die lineare RNA entfernt.Die kreisförmige RNA ist nach der Behandlung nachweisbar, während lineare RNA kein nachweisbares Signal mehr gibt. RNA wird 24 Stunden nach der Transfektion isoliert und mit RT-PCR analysiert. Die Verstärkung der linearen Tau mRNA zeigt zwei Bänder durch alternatives Spleißen von Exon 10.Ihr Verhältnis ändert sich zum Überausdruck von Spleißfaktoren. Die Verstärkung der kreisförmigen 1210 tau RNA zeigt die Abhängigkeit der tau circ RNA Expression von der Expression einiger Spleißfaktoren, insbesondere der Cdc2-ähnlichen Kinase CLK2 und des SR-Proteins 9G8. Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist das Design und die Lage der Primer beim Bau eines Minigens.Die Grundierung sollte nicht in sich wiederholenden Elementen liegen und muss unter verschiedenen Bedingungen optimiert werden, je nachdem, ob das Fragment verstärkt wird. Nach diesem Verfahren werden andere Methoden, die ausgeführt werden können, die Funktion der zirkulären RNAs testen. Die Benutzer können die Übersetzung oder Sequestrierung von Proteinen testen, um eine Funktion für die spezifische kreisförmige RNA zu identifizieren, an der der Benutzer interessiert ist.Diese Technik ebnete den Weg, um genomische Fragmente in einem Minigensystem zu nutzen, das die kreisförmigen RNAs überausdrücken kann, so dass der Benutzer ihre Funktion und in einigen Aspekten ihre Assoziation mit Krankheiten testen und identifizieren kann. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf mögliche Therapien und Diagnostika einer bestimmten Krankheit, zum Beispiel Tauopathien, neurodegenerative Erkrankungen im Zusammenhang mit Tau-Pathologie. Wir haben entdeckt, dass das mikrotubulieassoziierte Protein Tau, bekannt als MAPT, kreisförmige RNAs erzeugt, von denen wir glauben, dass sie zur Krankheitspathologie beitragen, und diese Methode ermöglicht es uns, diese kreisförmigen RNAs vollständig zu untersuchen und ihre Funktion und Beziehung zu Krankheiten zu identifizieren.Diese Methode könnte Einen Einblick in ein besseres Verständnis von kreisförmigen RNAs, ihre Funktionen und die Rolle, die sie bei bestimmten Krankheiten spielen können, geben. Diese Methode kann beim Klonen anderer Minigene angewendet werden, die kreisförmige RNAs über Arten hinweg ausdrücken, wo sie Einblicke in ihre Funktion geben können. Die Amplifikation der PCR-Produkte erweist sich als die schwierigste mit langen Fragmenten, die aus der genomischen DNA verstärkt werden, zusammen mit mehreren sich wiederholenden Elementen innerhalb des Fragments.

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Linear-vermittelte Amplifikation (LAM)-PCR ist eine Abwicklung, die genauen Positionen der Integration von viraler Vektoren in das Genom zu identifizieren Verfahren. Die Technik hat sich weiterentwickelt, um die überlegene Methode zur klonalen Dynamik in der Gentherapie-Patienten, biologische Sicherheit von neuartigen Technologien Vektor, T-Zell-Vielfalt, die Krebsstammzellen Modelle usw. studieren...

Linear Amplification vermittelte PCR - Lokalisierung von genetischen Elementen und Charakterisierung von Unbekannt flankierenden DNA-

Dieses Video zeigt die grundlegenden Schritte zur Durchführung einer Gesamttranskriptomanalyse an präparierten embryonalen Rückenmarksproben von Küken nach der Transfektion mit In-Ovo-Elektroporation.

RNA-Seq Analyse der differentiellen Genexpression in elektroporiertem Küken Embryonale Spinal Cord

Dieser Artikel stellt eine empfindliche Methode namens Circle-Seq zur Reinigung extrachromosomaler zirkulärer DNA (eccDNA) vor. Die Methode umfasst die Aufreinigung von Säulen, die Entfernung verbleibender linearer chromosomaler DNA, die Rolling-Circle-Amplifikation und die Hochdurchsatz-Sequenzierung. Circle-Seq ist anwendbar für das genomskalige Screening von eukaryotischer eccDNA und die Untersuchung von Genominstabilität und Variation der Kopienzahl.

Genomweite Reinigung von extrachromosomale zirkuläre DNA aus eukaryotischen Zellen

Die zwei verschiedenen 3' schnelle Verstärkung der cDNA enden (3' Rennen) Protokolle beschrieben hier machen Verwendung von zwei verschiedene DNA-Polymerasen Sequenzen zuordnen, die ein Segment der offenen Leserahmen (ORF), das Stopp-Codon und die gesamte 3' UTR eine Niederschrift mit RNA enthalten aus verschiedenen Krebszelllinien gewonnen.

Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen

Next Generation Sequencing (NGS) ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die genomische Charakterisierung, die durch die hohe Fehlerquote der Plattform (~0.5–2.0%) begrenzt ist. Wir beschreiben unsere Methoden zur Sequenzierung Fehler korrigiert, mit denen wir umgehen die NGS Fehlerquote und erkennen Mutationen bei Variante Allel Brüche so selten wie 0,0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Die Kennung der physikalischen Wechselwirkungen zwischen Genen und regulatorische Elemente ist anspruchsvoll aber erfassen Bezahlungsmethode Chromosom Konformation erleichtert worden. Diese Modifikation des 4C-Seq-Protokolls mildert PCR Bias durch Minimierung der Überverstärkung PCR-Vorlagen und maximiert die Mappability von Lesevorgängen durch den Einbau eines Zusatz Restriktionsenzym verdauen Schritt.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

Circular RNAs (circRNAs) sind nicht-kodierende RNAs, die eine Rolle bei der Transkriptionsregulation und der Vermittlung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen spielen können. Nach Der Bewertung verschiedener Parameter für den Aufbau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken wurde ein Protokoll unter Verwendung der gestrandeten Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitung mit RNase R-Vorbehandlung erstellt und hier vorgestellt.

Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung

Dieses Protokoll stellt ein schnelles und nützliches Werkzeug zur Bewertung der Rolle eines Proteins mit uncharakterisierter Funktion bei der alternativen Spleißregulation nach chemotherapeutischer Behandlung dar.

Verwendung des E1A Minigene Tools zur Untersuchung von mRNA-Spleißänderungen

Die absolute Quantifizierung der RNA-Sequenzierung (AQRNA-seq) ist eine Technologie, die entwickelt wurde, um die Landschaft aller kleinen RNAs in biologischen Gemischen zu quantifizieren. Hier werden sowohl die Bibliotheksvorbereitung als auch die Datenverarbeitungsschritte von AQRNA-seq demonstriert, wobei Veränderungen im Transfer-RNA (tRNA)-Pool in Mycobacterium bovis BCG während der hungerinduzierten Dormanzphase quantifiziert werden.

AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

Die DNAzyme-basierten Nanomaschinen können für den hochselektiven und sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für das Design von DNAzym-basierten Nanomaschinen mit einem 10-23-Kern unter Verwendung freier Software und deren Anwendung am Beispiel der Detektion eines Epstein-Barr-Virusfragments.

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

Erfahren Sie, wie Sie mit Alu-Element-Minigenen zirkuläre RNAs generieren und deren Funktion sowie Krankheitsrelevanz analysieren. Diese Methode ermöglicht alternative Splicing-Studien in der Molekularbiologie.

Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs

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