Name: Dual Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorprogression und Angiogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Erfahren Sie die duale Biolumineszenz-Bildgebung zur gleichzeitigen Verfolgung von Tumorwachstum und Angiogenese in einem Mäusemodell. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring für Onkologie-Forschung und Arzneimittelscreening.

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Diese Forschung wurde unterstützt durch das National Key R&D Program of China (2017YFA0103200), die National Natural Science Foundation of China (81671734) und Key Projects of Tianjin Science and Technology Support Program (18YFZCSY00010), Fundamental Research Funds for den Zentraluniversitäten (63191155). Wir erkennen die Revisionen der Gloria Nance an, die für die Verbesserung der Qualität unseres Manuskripts wertvoll waren.

Die Versuche müssen den nationalen und institutionellen Vorschriften über die Verwendung von Tieren zu Forschungszwecken entsprechen. Genehmigungen für die Durchführung von Experimenten müssen eingeholt werden. Die Behandlung von Tieren und die experimentellen Verfahren der Studie entsprechen den Richtlinien des Nankai University Animal Care and Use Committee, die den richtlinien für Tierpflege entsprechen, die von den National Institutes of Health (NIH) genehmigt wurden.
1. LV-Rluc-RFP (RR) und LV-Rluc-RFP-HSV-ttk (RRT) lentivirale Verpackung und Produktion
ANMERKUNG: Der pLV-RR trägt die Gensequenzen von Renilla luciferase (Rluc) und rotem fluoreszierendem Protein (RFP) unter dem Promotor EF1, während der pLV-RRT die Gensequenzen trägt, die Rluc, RFP und Herpes simplex virus abgeschnittene Thymidinkinase (HSV-ttk) ( Abbildung 2).
<ol><li>Samen 1 x 106 von 293T Zellen pro Brunnen in eine 6 Wellplatte und Kultur über Nacht in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C mit Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS).</li>
	<li>Bereiten Sie die Liposomensuspension vor: Mischen Sie 7,5 l Liposom und 0,25 ml minimales wesentliches Medium (MEM) in ein 1,5 ml Rohr nach inkubationszeit für 5 min bei Raumtemperatur (RT), um Liposomen gleichmäßig zu dispergieren.</li>
	<li>Die DNAs-Lösung (DNAs-RR) vorbereiten: Fügen Sie den pLV-RR-Vektor und die Hilfsplasmide in einem 1,5 ml-Rohr, wie in Tabelle 1beschrieben, 0,25 ml MEM hinzu.</li>
	<li>Erhalten Sie die Liposomen-/DNAs-RR-Verbindung: Fügen Sie die DNAs-RR-Lösung vorsichtig in vorbereitete Liposomensuspension Tropfen für Tropfen und inkubieren Sie für 20 min bei RT, so dass die DNA-Bindungen an die Lipidmembran.</li>
	<li>Ersetzen Sie das Medium der 293T-Zellen durch 1 ml DMEM, das 10% FBS enthält, und fügen Sie die Liposomen-/DNAs-RR-Verbindung vorsichtig zum Medium der 293T-Zellen hinzu.</li>
	<li>Nach der Inkubation in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2 bei 37 °C für 12–16 h, ersetzen Sie die Liposomen/DNAs-RR-Verbindung, die ein Medium der 293T-Zellen enthält, durch 1 ml DMEM mit 10% FBS und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin.</li>
	<li>Die 293T-Zellen im befeuchteten Inkubator nach der Transfektion 48 h weiter kultivieren. Dann sammeln Sie den Überstand der 293T-Zellen und zentrifugieren Sie das Medium bei 300 x g für 5 min, um die 293T-Zellen zu pellet. Den lentivirus-RR (LV-RR)-haltigen Überstand in 1,5 ml sterile Polypropylen-Lagerröhrchen geben und bei -80 °C lagern. HINWEIS: Für die Arbeit mit dem rekombinanten Lentivirus ist eine Anlage der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) erforderlich.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.1–1.7 und verwenden Sie pLV-RRT-Vektor anstelle des pLV-RR-Vektors in Schritt 1.3, um das Lentivirus-RRT (LV-RRT) zu erhalten. LV-RRT bei -80 °C lagern. HINWEIS: Der nicht gereinigte lentivirale Bestand kann in einigen Fällen das Zellwachstum hemmen. Lentivirale Bestände müssen möglicherweise gereinigt werden. Die lentiviralen Bestände, die LV-RR- oder LV-RRT-Partikel enthalten, sollten zur Lagerung in 1,5 ml-Rohre (1 ml pro Röhre) unterteilt werden, um mehrere Freitauzyklen zu vermeiden.</li>
</ol>2. LV-RR und LV-RRT lentivirale Transduktion zur Genexpression in 4T1-Zellen
<ol><li>Samen 4T1-Zellen in eine 6-Well-Platte (5 x 105 Zellen/well) und Kultur mit Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10% FBS über Nacht in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium von der Kulturplatte und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches RPMI 1640 Medium sowie 1 ml Lentivirale Vorräte (LV-RR oder LV-RRT) an jedem Brunnen. Fügen Sie 8 g/ml Polybren hinzu und mischen Sie das Medium, das lentivirale Partikel enthält, sanft, indem Sie nach oben und unten pfeifen. HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass das Medium lentivirale Partikel enthält, die menschliche Zellen transducieren könnten.</li>
	<li>Spintransduktionslösung in einer Zentrifuge bei 1.000 g für 60 min bei RT zur Steigerung der Transduktionseffizienz. Nach der Zentrifugation 4T1-Zellen für 4–12 h kulturieren und in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C aufbewahren. HINWEIS: Für einige Zelllinien kann Polybren für die Langzeitkultur giftig sein. Daher kann die Inkubationszeit für die Transducing verschiedener Zellen änderbar sein. Überprüfen Sie den Zellenstatus mehrmals, um die geeignete Inkubationszeit zu finden.</li>
	<li>Erfrischen Sie das Medium der transduzierten 4T1-Zellen mit 2 ml RPMI 1640 Medium, das 10% FBS und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin enthält, um lentivirale Partikel und Polybren zu entfernen.</li>
</ol>3. Arzneimittelscreening und Identifizierung von LV-RR- und LV-RRT-transduzierten 4T1-Zellen
<ol><li>Wählen Sie transduzierte Zellen mit Medium, das Blasticidin (BSD) enthält, gemäß dem BSD-Resistenzgen, das von LV-RR oder LV-RRT getragen wird, wie die folgenden Schritte beschrieben. HINWEIS: Alternativ könnten die transduzierten Zellen, die RFP-positiv sind, durch Durchflusszytometrie gemäß dem RFP-Gen ausgewählt werden, das von LV-RR oder LV-RRT getragen wird.</li>
	<li>48 h nach Transduktion Durchgang 4T1-Zellen im Verhältnis 1:3 zu 1:4 mit Selektionsmedium (RPMI 1640 medium mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin-Streptomycin und 5 g/ml BSD). Wechseln Sie das Medium alle 2 oder 3 Tage. HINWEIS: Die optimale BSD-Konzentration kann von Zelllinie zu Zelllinie variieren. Daher sollte ein Pilotversuch der Kill-Kurve durchgeführt werden, um die optimale Konzentration von BSD vor dem ersten Experiment zu bestimmen.</li>
	<li>7 Tage nach dem Arzneimittelscreening die LV-RR-transduzierten 4T1-Zellen (4T1-RR) und LV-RRT-transduzierte 4T1-Zellen (4T1-RRT) unter dem fluoreszenzinvertierten Phasenkontrastmikroskop. Zählen Sie die Anzahl der RFP+ 4T1-Zellen und aller 4T1-Zellen in drei Sichtfeldern, um das RFP-positive Verhältnis zu schätzen (Abbildung 2). HINWEIS: Alternativ könnte das RFP-positive Verhältnis der transducierten 4T1-Zellen durch Durchflusszytometrie identifiziert werden.</li>
	<li>Messen Sie die Renilla-Signale von 4T1-RR-Zellen und 4T1-RRT-Zellen mit hilfe eines lebenden Bildgebungssystems, um die lineare Beziehung zwischen Zellzahlen und Renillasignalen zu erkennen (Abbildung 3).</li>
	<li>Erweitern Sie BSD-geprüfte 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen mit Selektionsmedium bei Split-Verhältnissen zwischen 1:3 und 1:4 und speichern Sie die Zelllinienbestände in flüssigem Stickstoff.</li>
</ol>4. Vegfr2-Fluc-KI Mäuse und tumortragendes Mausmodell
HINWEIS: Die transgenen Vegfr2-Fluc-KI-Mäuse, 6-8 Wochen alt und weiblich, werden in diesem Experiment verwendet, um die Angiogenese in vivo von BLI nicht-invasiv zu überwachen.
<ol><li>Kultur 4T1-RR-Zellen und 4T1-RRT-Zellen in 60 mm Petrischalen in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 bei 37 °C. Wenn die Zellen bei 80% Zusammenfluss sind, entfernen Sie das Medium und spülen Sie es mit Phosphatgepufferter Saline (PBS).</li>
	<li>Entfernen Sie die PBS und fügen Sie eine zusätzliche 2 ml von 0,25% Trypsin-0,53 mM EDTA-Lösung bzw. hinzu. Halten Sie die Schale bei RT (oder bei 37 °C) auf, bis sich die Zellen lösen.</li>
	<li>Fügen Sie 5–10 ml frisches Medium mit 10% FBS hinzu, dann aspirieren und abgeben Zellen, um 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen in 15 ml Zentrifugenröhren zu suspendieren. Zählen Sie zwei Arten von 4T1-Zellen mit einer Zählkammer und bereiten Sie die Zellsuspensionen mit einer Konzentration von 1 x 106 pro 100 l in RPMI 1640 medium vor.</li>
	<li>Anästhetisieren Sie die Vegfr2-Fluc-KI-Mäuse mit 1%–3% Isofluran in 100% Sauerstoff in der Anästhesie-Induktionskammer mit einer Durchflussrate von 1 L/min. Überwachen Sie die Zehenpinch-Reaktion der Maus, um den Status der Anästhesie zu bestätigen. Dann wenden Sie ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus, um Austrocknung zu verhindern.</li>
	<li>Entfernen Sie die Maus aus der Kammer und positionieren Sie sie in nosecone. Entfernen Sie das Haar der Schulter der Maus vollständig mit Elektrorasierer und Haarentfernungscreme, die eine gute Sicht auf das chirurgische Feld bieten könnte und vermeiden, die BLI-Signale in Folgeexperimenten zu blockieren.</li>
	<li>Subkutan injizieren 4T1-RR-Zellen (1 x 106 Zellen bei einem Gesamtvolumen von 100 L) und 4T1-RRT-Zellen (1 x 106 Zellen bei einem Gesamtvolumen von 100 L) in die linke bzw. rechte Schulter jeder Maus (Aufnahme als Tag 0). Platzieren Sie Mäuse im Erholungsgebiet mit thermischer Unterstützung, bis sie vollständig geborgen sind.</li>
	<li>Berühren Sie nach der Implantation von 4T1-RR- und 4T1-RRT-Zellen die Tumormassen, um zu überprüfen, ob die Mäuse jeden Tag tumortragend sind (Abbildung S1). Am Tag 7 nach der Implantation injiziert intraperitoneal 50 mg/kg Ganciclovir (GCV) zweimal täglich bis zum Ende des Experiments in die tumortragende Maus. HINWEIS: Vor diesem Experiment sollte das Zytotoxisch von GCV an 4T1-RRT-Zellen nachgewiesen werden. Die Tötungseffizienz von GCV konnte durch Zellzähltest mit unterschiedlicher GCV-Konzentration bewertet werden (Abbildung S2).</li>
	<li>Am Tag 0, 3, 7, 14 und 21 nach der 4T1-Implantation überwachen Sie das Tumorwachstum und die Angiogenese tumortragender Mäuse und bewerten sie sowohl durch Rluc als auch durch Fluc-Bildgebung (Abbildung4).</li>
</ol>5. Duale Biolumineszenz-Bildgebung von Tumor (Rluc) und Angiogenese (Fluc)
<ol><li>Öffnen Sie das lebende Bildgebungssystem, initialisieren Sie die lebende Bildgebungssoftware, und initialisieren Sie dann das System. HINWEIS: Die Systeminitialisierung dauert einige Minuten, um die aufgeladene Gerätekamera (CCD) auf -90 °C abzukühlen, bevor die Bildgebung beginnen kann. Die Temperatur wird grün, wenn die CCD-Kamera gekühlt wird.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgenden Kameraeinstellungen: Überprüfen Sie die Lumineszenz und Fotografie. Überprüfen Sie Überlagerung. Lumineszenzeinstellungen: Belichtungszeit setzt AUTO unter normalen Bedingungen. Binning setzt auf 8. F/Stop setzt auf 1. Emissionsfilter setzt Open. Fotoeinstellungen: Binning setzt auf Medium. F/Stop setzt auf 8. IVIS-Systemeinstellungen: Sichtfeld: C=1 Mausansicht, D=5-Mäuseansicht. Die Motivhöhe setzt 1,5 cm.</li>
	<li>Wiegen und erfassen Sie die Mäuse und berechnen Sie das benötigte Volumen von Coelenterazin (CTZ; 2,5 mg/kg) und D-Luziferin (150 mg/kg).</li>
	<li>Anästhetisieren Sie tumortragende Maus um 1%–3% Isofluran in 100% Sauerstoff in der Anästhesie-Induktionskammer mit einer Durchflussrate von 1 L/min. Überwachen Sie die Zehenpinch-Reaktion der Maus, um den Status der Anästhesie zu bestätigen. Geben Sie dann einen Tropfen Schmieraugensalbe auf beide Augen, um Hornhautschäden zu vermeiden.</li>
	<li>Injizieren Sie 2,5 mg CTZ (3,33 mg/ml) pro Kilogramm Körpergewicht in die Retrobulbar der Maus (z. B. für eine 20 g Maus, injizieren Sie 15 l, um 50 g CTZ zu liefern) mit einer InsulinspritzeNadel.</li>
	<li>Bewegen Sie die tumortragende Maus mit der Nase im Anästhesiekegel sanft in die Kamerakammer und erfassen Sie sofort mehrere Bilder des Maus-Dorsal, um die Rluc-Signale von 4T1-Zellen zu erhalten, bis die BLI-Signale verblassen. ANMERKUNG: Die Halbwertszeit von CTZ ist sehr kurz und die Signale von Rluc fallen süberschmisch um 30 s. Um sicherzustellen, dass sich jedes verbleibende Rluc-Signal aufgelöst hat und das Intervall zwischen Rluc und Fluc-Bildgebung mehr als 10 min betragen sollte.</li>
	<li>Intraperitoneal injizieren 150 mg/kg D-Luciferin (30 mg/ml) mit einer Insulinspritze Nadel (z.B. für eine 20 g Maus, injizieren 100 l, um 3 mg D-Luciferin zu liefern). Halten Sie die Maus bei RT für 10 min vor Fluc-Bildgebung.</li>
	<li>Bewegen Sie diese Maus wieder in die Kamerakammer mit ihrer Nase im Anästhesiekegel und erfassen Sie mehrere Bilder der Maus dorsal, um die Fluc-Signale von der Angiogenese zu erhalten. HINWEIS: Der kinetische Fluc-Monitor sollte für jede Maus durchgeführt werden, bis die Signale das Maximum erreichen und dann verblassen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Prozedurschritte 5.4–5.8 für jede Maus.</li>
	<li>Nach der Bildgebung die Mäuse in einer warmen Umgebung warten, bis die Tiere aufwachen.</li>
	<li>Zum gewünschten Zeitpunkt (Tag 3, 7, 14 und 21) wiederholen Sie oben stehende Verfahren (Schritt 5.3–5.10), um die Tumorprogression und Tumorangiogenese im Laufe der Zeit zu erkennen.</li>
	<li>Analysieren Sie die Rluc- und Fluc-Signale, um den Zusammenhang zwischen Tumorwachstum und Angiogenese bei der Tumorprogression zu untersuchen. HINWEIS: Die Regionen von Interesse (ROI), die die BLI-Signalstelle abdecken, werden zur Analyse der Daten verwendet. Messen Sie die Gesamtstrahlung (Photonen) des ROI in der Einheit photonen/sekunden/cm2/steradian (p/s/cm2/sr) für jeden Zeitpunkt.</li>
	<li>Analysieren Sie die Rluc- und Fluc-Signale des ROI mithilfe von Grafiksoftware (Abbildung 4).</li>
</ol>

<ol><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+angiogenesis%3A+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor angiogenesis: therapeutic implications.</a> The New England Journal of Medicine. 285, 1182-1186 (1971).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor angiogenesis.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 2039-2049 (2008).</li>
<li>Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+enigma+of+multicolor+bioluminescence+of+firefly+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68, 1167-1182 (2011).</li>
<li>Nakatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+spectral+difference+in+luciferase+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence.</a> Nature. 440, 372-376 (2006).</li>
<li>McMillin, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-specific+bioluminescence+platform+to+identify+stroma-induced+changes+to+anticancer+drug+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity.</a> Nature Medicine. 16, 483-489 (2010).</li>
<li>Madero-Visbal, R. A., Hernandez, I. C., Myers, J. N., Baker, C. H., Shellenberger, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+bioluminescent+imaging+of+xenograft+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+HNSCC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">In situ bioluminescent imaging of xenograft progression in an orthotopic mouse model of HNSCC.</a> Journal of Clinical Oncology. 26, 17006(2008).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Imaging+of+Tumor+Angiogenesis+and+Therapeutic+Effects+with+Dual+Bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis and Therapeutic Effects with Dual Bioluminescence.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 18, 422-428 (2017).</li>
<li>Rivera, L. B., Cancer Bergers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+angiogenesis%2C+from+foe+to+friend%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tumor angiogenesis, from foe to friend.</a> Science. 349, 694-695 (2015).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+therapeutic+effects+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+with+an+injectable+hydrogel+for+hindlimb+ischemia+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Enhanced therapeutic effects of mesenchymal stem cell-derived exosomes with an injectable hydrogel for hindlimb ischemia treatment.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 10, 30081-30091 (2018).</li>
<li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proangiogenic+potential+of+mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+stimulated+by+a+nitric+oxide+releasing+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer.</a> Biomaterials. , 70-81 (2017).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+VEGF+signaling+is+required+for+vascular+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autocrine VEGF signaling is required for vascular homeostasis.</a> Cell. 130, 691-703 (2007).</li>
<li>Dewhirst, M. W., Cao, Y., Moeller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cycling+hypoxia+and+free+radicals+regulate+angiogenesis+and+radiotherapy+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response.</a> Nature Reviews. Cancer. 8, 425-437 (2008).</li>
<li>Wigerup, C., Pahlman, S., Bexell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer.</a> Pharmacology & Therapeutics. 164, 152-169 (2016).</li>
<li>Wong, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-action+combination+therapy+enhances+angiogenesis+while+reducing+tumor+growth+and+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual-action combination therapy enhances angiogenesis while reducing tumor growth and spread.</a> Cancer Cell. 27, 123-137 (2015).</li>
<li>Mezzanotte, L., van 't Root, M., Karatas, H., Goun, E. A., Lowik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Molecular+Bioluminescence+Imaging%3A+New+Tools+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications.</a> Trends in Biotechnology. 35, 640-652 (2017).</li>
<li>Du, W., Tao, H., Zhao, S., He, Z. X., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+applications+of+molecular+imaging+in+cardiovascular+disease+and+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Translational applications of molecular imaging in cardiovascular disease and stem cell therapy.</a> Biochimie. 116, 43-51 (2015).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+biodistribution%2C+and+imaging+of+PEGylated-acetylated+polyamidoamine+dendrimers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoscience+and+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthesis, biodistribution, and imaging of PEGylated-acetylated polyamidoamine dendrimers.</a> Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14, 3305-3312 (2014).</li>
<li>Branchini, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red-emitting+chimeric+firefly+luciferase+for+in+vivo+imaging+in+low+ATP+cellular+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Red-emitting chimeric firefly luciferase for in vivo imaging in low ATP cellular environments.</a> Analytical Biochemistry. 534, 36-39 (2017).</li>
<li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+%26%2334%3Bred-shifted%26%2334%3B+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing &#34;red-shifted&#34; luciferase.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7, e2571(2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In diesem Protokoll wird ein nicht-invasiver dualer BLI-Ansatz zur Überwachung der Tumorentwicklung und Angiogenese beschrieben. Das BLI-Reportersystem wurde entwickelt und enthält das HSV-ttk/GCV-Selbstmordgen zur Verfolgung der Tumorprogression und Regression in vivo durch Rluc-Bildgebung. In der Zwischenzeit wird die Tumorangiogenese mit Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen mittels Fluc-Bildgebung untersucht. Dieses tumortragende Mausmodell ist in der Lage, eine praktische Plattform für die kontinuierliche und nicht-invasive Trackin...

Angiogenese ist ein wesentlicher Prozess bei der Progression von Krebs von kleinen, lokalisierten Neoplasmen zu größeren, potenziell metastasierenden Tumoren1,2. Die Korrelation zwischen Tumorwachstum und Angiogenese wird zu einem der Schwerpunkte im Bereich der onkologischen Forschung. Herkömmliche Methoden zur Messung morphologischer Veränderungen können jedoch die Tumorprogression und Angiogenese bei lebenden Tieren nicht gleichzeitig mit einem visualisierten Ansatz überwachen.
Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) von Tumorzellen ist eine besonders geeignete experimentelle Methode zur Überwachung des Tumorwachstums aufgrund seiner Nicht-Invasivität, Empfindlichkeit und Spezifität3,4,5,6 . Die BLI-Technologie basiert auf dem Prinzip, dass die Luziferase die Oxidation eines bestimmten Substrats katalysieren kann, während sie Diebiomineszenz aussendet. Die in implantierten Tumorzellen exprimierte Luziferase reagiert mit dem injizierten Substrat, das durch ein lebendiges Bildgebungssystem nachgewiesen werden kann, und Signale spiegeln indirekt die Veränderungen der Zellzahl oder Zelllokalisierung in vivo6,7wider.
Abgesehen vom Tumorwachstum kann die Tumorangiogenese (der kritische Schritt in der Krebsprogression) auch durch BLI-Technologie mit Vegfr2-Fluc-KI transgenen Mäusen8,9,10visualisiert werden. Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (Vegf) Rezeptor 2 (Vegfr2), eine Art Von Vegf-Rezeptor, wird meist in den vaskulären Endothelzellen von erwachsenen Mäusen11exprimiert. Bei transgenen Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen wird die DNA-Sequenz der Firefly-Luziferase (Fluc) in das erste Exon der endogenen Vegfr2-Sequenz geschlagen. Als Ergebnis wird der Fluc (der als BLI-Signale erscheint) in einer Weise ausgedrückt, die mit dem Niveau der Angiogenese bei Mäusen identisch ist. Um über ein paar Millimeter zu wachsen, rekrutiert der Tumor neue Gefäße aus bestehenden Blutgefäßen, die die durch Wachstumsfaktoren aus den Tumorzellen1ausgelöste Vegfr2 stark ausdrücken. Dies eröffnet die Möglichkeit, vegfr2-Fluc-KI transgene Mäuse zu verwenden, um die Tumorangiogenese durch BLI nicht-invasiv zu überwachen.
In diesem Protokoll wird ein tumortragendes Mausmodell zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in einer einzigen Maus durch Firefly luciferase (Fluc) bzw. Renilla luciferase (Rluc) Bildgebung eingerichtet (Abbildung 1). Es entsteht eine 4T1-Zelllinie (4T1-RR), die Rluc und rotes fluoreszierendes Protein (RFP) stabil ausdrückt, um das Zellwachstum durch Rluc-Bildgebung zu verfolgen. Um die dynamischen Veränderungen der Angiogenese in der Progression und Regression des Tumors weiter zu untersuchen, wird eine weitere 4T1-Zelllinie (4T1-RRT) erstellt, die Selbstmord-Genherpes simplex-Virus abgeschnittene Thymidinkinase (HSV-ttk), Rluc und RFP ausdrückt. Durch die Verabreichung von Ganciclovir (GCV) werden die HSV-ttk-Exemitzellen selektiv ablated. Basierend auf diesen Zelllinien wird ein tumortragendes Modell in Vegfr2-Fluc-KI-Mäusen entwickelt, das als experimentelles Modell dient, das die Tumorprogression und Tumorangiogenese in vivo überbrückt.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-0,53 mM EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-105-C-S</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Corning Glass Works</td><td>601052-50</td><td></td></tr><tr><td>293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Dish</td><td>Corning Glass Works</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Corning Glass Works</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td>Shanghai Lishen Scientific</td><td>Hfsafe-900LC</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochlorid (BSD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>Zellzählkit-8</td><td>MedChem Express</td><td>HY-K0301</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Tegulierter Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4111</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazin (CTZ)</td><td>NanoLight-Technologie</td><td>479474</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin-Kaliumsalz-Messschieber</td><td>Life Sciences</td><td>119222 DMEM-Medium</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>BIOIND</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti-E/U/S</td><td></td></tr><tr><td>Ganciclovir (GCV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001129</td><td></td></tr><tr><td>Grafiksoftware</td><td>GraphPad Software</td><td>Graphpad Prism 6</td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritzennadeln</td><td>Becton Dickinson</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>691477H</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirales Verpackungssystem</td><td>Biosettia</td><td>cDNA-pLV03</td><td></td></tr><tr><td>Liposom</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>11668019</tr><tr><td>Living Imaging Software Caliper</td><td>Life Sciences</td><td>Living Imaging Software 4.2</td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging System</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>IVIS Lumina II</td><td></td></tr><tr><td>MEM Medium</td><td>Invitrogen</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Corning Glass Works</td><td>R21031399</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-1G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>SORVALL ST 16R Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Thermo Sorvall ST 16 ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Ultratiefkühlschrank</td><td>Haier</td><td>DW-86L338</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8 Gas-Anästhesiesystem</td><td>XENOGEN Korporation</td><td>7293</td><td></td></tr></tbody></table>

dual biolumineszenz-bildgebung der tumorprogression und angiogenese

Dual Bioluminescence Imaging of Tumor Progression and Angiogenesis

Die Angiogenese als entscheidender Prozess der Tumorprogression ist zu einem Forschungs-Hotspot und Ziel der Anti-Tumor-Therapie geworden. Es gibt jedoch kein zuverlässiges Modell, um Tumorprogression und Angiogenese gleichzeitig visuell und sensibel zu verfolgen. Die Biolumineszenz-Bildgebung zeigt ihre einzigartige Überlegenheit in der lebendigen Bildgebung aufgrund ihrer Vorteile hoher Empfindlichkeit, starker Spezifität und genauer Messung. Präsentiert hier ist ein Protokoll, um ein tumortragendes Mausmodell zu etablieren, indem eine Renilla-Luziferase-markierte murine Brustkrebs-Zelllinie 4T1 in die transgene Maus mit Angiogenese-induzierter Firefly-Luzifferase-Expression injiziert wird. Dieses Mausmodell bietet ein wertvolles Werkzeug, um die Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung in einer einzigen Maus zu überwachen. Dieses Modell kann weit verbreitet in Anti-Tumor-Arzneimittel-Screening und Onkologie-Forschung angewendet werden.

In diesem Experiment wurde ein Brustkrebs-Mausmodell mit 4T1-Zellen erstellt, um den Zusammenhang zwischen Tumorwachstum und Tumorangiogenese zu untersuchen (Abbildung 1). Zunächst wurden zwei Lentiviren verpackt, die Gensequenzen trugen, die Rluc/RFP (LV-RR) und Rluc/RFP/HSV-ttk (LV-RRT) exättierten, wie bereits berichtet7. Anschließend wurden zwei verschiedene 4T1-Zelllinien mit den Namen 4T1-RR und 4T1-RRT durch die Transducing LV-R...

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines tumortragenden Mausmodells zur Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese in Echtzeit durch duale Biolumineszenz-Bildgebung.

Dual Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorprogression und Angiogenese

Angiogenesis, as a crucial process of tumor progression, has become a research hotspot and target of anti-tumor therapy. However, there is no reliable ...

Angiogenese spielen eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung und Progression. In diesem Protokoll werden wir die duale Biolumineszenz-Bildgebungsmethode verwenden, um das dynamische Tumorverlauf und die Angiogenese in einem Mausmodell von Brustkrebs zu überwachen. In diesem Modell können wir das Tumorwachstum und die Angiogenese gleichzeitig in der einzelnen Maus durch Firefly luciferase bzw. Renilla luciferase Bildgebung verfolgen.Dieses Modell kann weit verbreitet in Antitumor-Arzneimittel-Screening und Onkologie-Forschung angewendet werden. Dieses duale Biolumineszenzmodell kann verwendet werden, um Tumorprogression und Regression zu verfolgen und tumorbezogene molekulare Prozesse als Reaktion auf therapeutische Strategien zu erkennen. Angiogenese ist ein entscheidender Prozess der Tumorprogression.Daher ist die visuelle und sensible Überwachung der Tumorprogression und Angiogenese für die Entwicklung wirksamer Tumorbehandlungen notwendig. Die Verfahren werden von Kaiyue Zhang, Chen Wang und Shang Chen, Studenten aus unserem Labor, demonstriert. Für Lentivirus-Verpackungen und Produktionssamen einmal 10 bis sechs sechs von 293T-Zellen in zwei Milliliter DMEM, ergänzt mit

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Research

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JoVE Journal

Medicine

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Brusttumor-Zellen, die Luciferase werden subkutan in Mäuse implantiert und visualisiert mit Hilfe der optischen Bildgebung, das Tumorwachstum und die Entwicklung nicht-invasiv in einer Längsschnittstudie zu überwachen.

In vivo Biolumineszenz Imaging von Brusttumoren mit IVIS Spectrum

Luciferase-modifizierten menschlichen Gehirns Tumorxenotransplantaten können intrakraniell in athymischen Mäusen festgestellt werden, mit anschließender Überwachung des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung. In Kombination mit dem Überleben Analyse wird Biolumineszenz Überwachung ein wesentliches Recherche-Tool für die präklinische Prüfung von Therapien, zur Behandlung von Gehirntumoren betrachtet.

Gründung Intrakranielle Brain Tumor Xenografts mit anschließender Analyse des Tumorwachstums und Ansprechen auf die Therapie mit Biolumineszenz-Bildgebung

Ein experimentelles Mausmodell von Knochenmetastasen wurde nach intrakardialen Lieferung von Luciferase exprimierenden Mammatumorzellen gegründet. Tumorentstehung und führte Osteolyse wurden in Längsrichtung mit Biolumineszenz-und Mikro-CT-Bildgebung überwacht.

Überwachung Tumormetastasen und Osteolysen mit Biolumineszenz und Micro-CT Imaging

Biolumineszenz-Bildgebung des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α Aktivität wird angewandt, um intrakranielle Tumorhypoxie Entwicklung in einer Brustkrebs Hirnmetastasen Mausmodell zu überwachen.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

Hier beschreiben wir die Methoden zu konstruieren, zu visualisieren und zu quantifizieren Biolumineszenzreaktionen sowohl Glühwürmchen und Renilla Luciferase Enzymen bei metastasierendem Brustkrebs-Zellen während deren Wachstum und Metastasierung...

In vivo Dual-Substrat Bioluminescent Imaging

Intrakranielle Implantation von GL261-Zellen in C57BL / 6 Mäusen produziert maligne Gliome, dass viele Merkmale der menschlichen Glioblastoma multiforme zu rekapitulieren. Wir verwendeten GL261-Zellen stabil exprimiert Luziferase, damit wir...

Intrakranielle Implantation mit anschließender 3D In Vivo Bioluminescent Imaging von Murine Gliome

Dieser Artikel beschreibt die Verwaltung...

Bioluminescent Bakterielle Imaging<em&gt; In Vivo</em

Quelle:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Institut für Biowissenschaften, Universität Brasília, 2Abteilung für grundlegende psychologische Prozesse, Institut für Psychologie, Universität BrasíliaDieses Video zeigt das Verfahren zur Verfolgung der Tumorprogression in vivo,...

Biolumineszierende Bildgebung der Progression von Brusttumoren in einem weiblichen Mausmodell

Quelle: Ciraku, L., et. al. Ein Ex-vivo-Hirnschnittmodell zur Untersuchung und gezielten Bestimmung des Wachstums von Hirnmetastasen bei Brustkrebs. J. Vis. exp. (2021). Dieses Video zeigt die Bildgebung von Luciferase-exprimierenden Tumorzellen in einem organotypischen Maushirnschnitt. Luciferin wird dem Medium zugesetzt, und die Platte wird in die Kammer des In-vivo-Bildgebungssystems gelegt. Die Parameter für die Bilderfassung werden angepasst und die Form und Größe des Tumors definiert.

Biolumineszenz-Bildgebung zur Beurteilung des Tumorwachstums in einem organotypischen Maus-Hirnschnitt

Verbessertes Verständnis von Bauchspeicheldrüsenkrebs Biologie ist dringend erforderlich, um die Entwicklung von besseren therapeutischen Optionen zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs zu ermöglichen. Um diesen Bedarf zu demonstrieren wir eine orthotopic Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs, die nicht-invasive Überwachung der Tumorprogression ermöglicht...

Bioluminescent orthotopen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs Progression

Biolumineszenz-Bildgebung ist ein bekanntes Werkzeug für Tumoren und Metastasen zu lokalisieren, aber Quantifizierung dieser Bilder erfordert oft komplexe Berechnungen und bestimmte Instrumente. Wir beschreiben die einfach zu bedienende luminoscore-Methode, basierend auf genauen Aufnahmebedingungen, keine Berechnungen erfordern, und ermöglicht die Tumorlast und Ansprechen auf die Behandlung in Mausmodellen beobachtet werden.

Biolumineszenz-basierte Tumor Quantifizierung Verfahren zur Überwachung Tumorprogression und Therapieeffekte bei den Maus-Lymphom-Modelle

Erfahren Sie die duale Biolumineszenz-Bildgebung zur gleichzeitigen Verfolgung von Tumorwachstum und Angiogenese in einem Mäusemodell. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring für Onkologie-Forschung und Arzneimittelscreening.

Dual Biolumineszenz-Bildgebung der Tumorprogression und Angiogenese

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