Name: Enzymatische Synthese von epoxidierten Metaboliten von Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic und Arachidonsäuren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Lernen Sie die enzymatische Synthese enantiomerenreiner Epoxyfettsäuren aus DHA, EPA und Arachidonsäure mit dem bakteriellen Cytochrom-P450-Enzym BM3. Diese Methode ermöglicht die effiziente Herstellung bioaktiver Metaboliten für die biomedizinische Forschung.

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Diese Arbeit wird von R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) und Startup-Fonds der Michigan State University finanziert. Die Autoren danken Dr. Jun Yang (University of California at Davis) und Lalitha Karchalla (Michigan State University) für die Unterstützung bei der Optimierung der enzymatischen Reaktion und Dr. Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) Unterstützung bei der HRMS-Datenerfassung.

VORSICHT: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Materialsicherheitsdatenblätter (MSDS), bevor Sie die aufgeführten Chemikalien verwenden.
1. Ausdruck des Wildtyps BM3
<ol><li>Inokulat pBS-BM3 transfizierte DH5- E. coli (eine großzügige Spende von Dr. F. Ann Walker) in 5 ml steriler LB-Brühe mit 0,5 mg Ampicillin in einem 20 ml Kulturrohr.</li>
	<li>Die Zellkultur in einem Shaker bei 37 °C für 24 h bei 200 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Fügen Sie die Nachtstarterkultur (5 ml) und 100 mg Ampicillin zu 1 L steriler LB-Brühe in einem Fernbach- oder Erlenmeyerkolben hinzu. Bei 37 °C bei 200 Umdrehungen von 200 Umdrehungen/ minute schütteln, dann bei 30 °C für 18 h bei 200 Rpm.</li>
	<li>Sammeln und zentrifugieren Sie die Zellkultur bei 4 °C für 10 min bei 1.000 x g. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Zellpellet bei -78 °C bis zur Enzymreinigung. HINWEIS: Der Überstand kann entweder durch Behandlung mit Bleichmittel chemisch sterilisiert oder mit einem Autoklaven sterilisiert und dann in den Abfluss gegossen werden.</li>
</ol>2. Reinigung von BM3.
<ol><li>
Zelllyse
	<ol>
<li>Das Zellpellet auf Eis auftauen und in 40 ml eiskaltem (4 °C) Löslichkeitspuffer (10 mM Tris, 0,01 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8) wieder aufhängen. VORSICHT: PMSF ist durch Kontakt toxisch.</li>
		<li>Während auf dem Eis, beschallen Sie die Zellen für 1 min mit einem Ultraschall-Homogenisator (Ausgangsleistungseinstellung 10, Zoll 100%), gefolgt von einem 1 min Bruch auf Eis, um die Zellen zu lysieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang 6 Mal. Zentrifugieren Sie die Zelle bei 4 °C für 30 min bei 11.000 x g zu Pelletzellablagerungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Affinitätschromatographie
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine starke Anionenaustauschchromatographie-Säule (siehe Materialtabelle;Durchmesser: 2,8 cm x 6 cm, Säulenvolumen: 37 ml) durch Waschen mit 5 Säulenvolumen (CV) Puffer A (10 mM Tris, pH 7,8) bei 4 °C vor.</li>
		<li>Fügen Sie die Zelle lysiert zu ausgeglichenen Spalte und waschen Sie die Säule mit 3 CV Kaltpuffer A. Elute die BM3 durch Waschen der Säule mit Kaltpuffer B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).</li>
		<li>Sammeln Sie die rötlich-braune Eluentenfraktion. Wenn das Protein nicht sofort verwendet wird, mischen Sie es mit einem gleichen Volumen von Glycerin und Blitz einfrieren mit flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie die tiefgefrorene Lösung bei -78 °C auf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Epoxidation von DHA durch BM3
<ol><li>Bereiten Sie die Reaktion vor, indem Sie 0,308 g (0,940 mmol) DHA in 18,8 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 2 L Rührreaktionspuffer (0,12 m Kaliumphosphat, 5 mM MgCl2, pH 7,4) zusammen mit 20 nM des aufgetauten BM3-Enzyms hinzufügen. Die Enzymkonzentration kann durch die Kohlenmonoxid/Dithionit-Spektral-Assay-Methode19bestimmt werden.</li>
	<li>Während die Lösung rührt, beginnen Sie die Reaktion, indem Sie 1 Äquivalent von NADPH (Nicotinamid Adenin-Dinukleotid-Phosphat reduziert, Tetranatriumsalz, 0,808 g, 0,940 mmol) im Reaktionspuffer gelöst. Rühren Sie die Reaktion für 30 min, während Luft durch das Reaktionsgemisch mit einem luftgefüllten Ballon an einer Spritze und Nadel befestigt.</li>
	<li>Mit Einem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle)wird die Absorption des Reaktionsgemisches bei 340 nm überprüft, um festzustellen, ob NADPH erschöpft ist. Wenn keine Restabsorption vorhanden ist, die den Verbrauch von NADPH anzeigt, ist die Reaktion vollständig. HINWEIS: In der Regel ist die Reaktion nach 30 min abgeschlossen.</li>
	<li>Das Reaktionsgemisch durch langsames Hinzufügen von 1 M Oxalsäure tropfenweise ablöschen, bis der pH-Wert der Lösung 4 erreicht.</li>
</ol>4. Extraktion von EDP
<ol><li>Extrahieren Sie die abgeschreckte Pufferlösung mit 2 L Diethylether (wasserfrei, peroxidfrei) 3 mal. Die Ätherschicht (6 l) sammeln und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat (MgSO4)trocknen.</li>
	<li>Filtern Sie das MgSO4 aus der Lösung und konzentrieren Sie die getrocknete Ätherschicht auf einen Rotationsverdampfer, um den rohen EDP-Rückstand zu erhalten.</li>
	<li>Reinigen Sie den Rückstand durch Blitzsäulenchromatographie (eine 40 g Kieselsäurepatrone ist ausreichend). Beginnen Sie bei 10% Ethylacetat (EtOAc) in Hexanen und fahren Sie bis zu 60% EtOAc in Hexanen über 22 min. HINWEIS: Drei hauptgipfel werden erhalten und gesammelt, Eluing in der Reihenfolge 1. unreagierte DHA; 2. Mischung von EDP-Isomeren; und 3. Diepoxid (normale Überoxidationsprodukte (siehe Abbildung 1)).</li>
	<li>Kombinieren Sie die Fraktionen und konzentrieren Sie sie auf den Rotationsverdampfer. Aus diesem Beispiel 0,074 g, (24%) von unreagiertem DHA, 0,151 g (47%) von EDP-Isomen und 0,076 g( 22%) Diepoxid erhalten wurden.</li>
</ol>5. Veresterung von EDP, Trennung von 16(S), 17(R)- und 19(S),20(R)-EDP und Verseifung von Estern
VORSICHT: Trimethylsilyldiazomethan (TMS-Diazomethan) ist sowohl durch Kontakt als auch durch Einatmen sehr giftig. Nur in einer Dunstabzugshaube mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung verwenden.
<ol><li>Die Epoxide (0,151 g, 0,435 mmol) in einem rundgrundkolben oder kleinen Durchstechflasche mit 2 ml wasserfreiem Methanol (MeOH) und 3 ml wasserfreiem Toluen verdünnen, einen Rührstab hinzufügen und TMS-Diazomethan (1,2 Moläquivalente oder 0,26 ml einer 2-M-Lösung in Hexanes) unter</li>
	<li>Warten Sie 10 min und fügen Sie zusätzliche TMS-Diazomethan (0,050 ml) hinzu, bis eine blassgelbe Farbe verbleibt.</li>
	<li>Nach 30 min die Mischung mit dem Rotationsverdampfer sorgfältig konzentrieren und den Rückstand durch Blitzsäulenchromatographie reinigen. Elute mit 4% EtOAc in Hexanen (mit einer 40 g Kieselgelsäule oder Kartusche) für 22 min. In diesem Beispiel wurde 19,20-EDP-Methylester (0,116 g, 74%) und 16,17-EDP-Methylester (0,029 g, 19 %) wurden als Klare Öle (Gesamtertrag, 93 %) gewonnen.</li>
	<li>Sammeln Sie die Fraktionen, die die gereinigten EDP-Methylester-Regioisomere enthalten. 19(S),20(R)-EDP Methylester eluiert zuerst, gefolgt von 16(S),17(R)-EDP Methylester.</li>
	<li>Bleiben gemischte Fraktionen (die beide Isomere enthalten; können durch Dünnschichtchromatographie (TLC) in 8:1 Hexan/EtOAc beurteilt und mit Kaliumpermanganat (KMnO4) gefärbt), rechromatographieren Sie sie mit dem gleichen Lösungsmittelsystem wie zuvor.</li>
	<li>Konzentrieren Sie die Fraktionen, die die einzelnen Regioisomere enthalten. HINWEIS: An dieser Stelle können Identität und Reinheit durch NMR bewertet werden (mit CDCl3 als Lösungsmittel; siehe die Legende für Abbildung 2).</li>
	<li>Um einzelne EDV-Methylester-Regioisomen in ihre Säureformen umzuwandeln, verdünnen Sie den EDV-Ester in THF:Wasser (ca. 0,7 ml/0,1 mmol Ester). 2 M wässrige LiOH (3 Moläquivalente) hinzufügen und über Nacht umrühren. HINWEIS: Die Vollständigkeit der Reaktion kann durch TLC mit 3:1 Hexanen/EtOAc, Färbung mit KMnO4bewertet werden; das Produkt hat einen Retentionsfaktor von 0,3 €.</li>
	<li>Die Reaktion langsam mit Ameisensäure ablöschen, bis der pH-Wert der Mischung 3-4 erreicht. Wasser und Ethylacetat (1-2 ml/0,100 mmol Ester) hinzufügen und die Schichten trennen. Die Wasserschicht mit EtOAc (3 x 5 ml) abziehen, mit gesättigter Sole (NaCl)-Lösung waschen und die EtOAc-Schicht über wasserfreies Natriumsulfat trocknen (Na2SO4).</li>
	<li>Die Ethylacetatlösung mit einem Rotationsverdampfer konzentrieren, Hexane (10 ml) hinzufügen und wieder konzentrieren. Zweimal wiederholen, um azeotropisch Restameisensäure zu entfernen. Reinigen Sie den Rückstand durch Blitzsäulenchromatographie, Eluing mit 10-30% EtOAc über 15 min.</li>
	<li>Die gewünschten Fraktionen konzentrieren und im Vakuum trocknen, um sich die gereinigte Säure leisten zu können. HINWEIS: In diesem Stadium kann die enantiomere Reinheit beurteilt werden (durch chirale HPLC siehe die Legenden für Abbildung 3 - Abbildung 4 für Spalte und Bedingungen). Die chemische Reinheit kann mit C18 (achiral) HPLC beurteilt werden (siehe Materialtabelle und Referenz 14).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Wir präsentieren hier eine operativ einfache und kostengünstige Methode zur Vorbereitung der beiden am häufigsten vorkommenden Epoxidmetaboliten von DHA - 19,20 und 16,17-EDP. Diese Epoxidfettsäuren können in hochenantiopurer (als S,R-Isomere) Form mit Wildtyp-BM3-Enzym hergestellt werden. Im Folgenden werden mehrere kritische Punkte beschrieben, die zur Fehlerbehebung verwendet werden können, und die Erweiterung unserer Methode zur Herstellung von enantiopuren Epoxidmetaboliten von AA und EPA.
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Da das Interesse an der Rolle, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren (insbesondere Omega-3 und Omega-6 mehrfach ungesättigte Fettsäuren) in der menschlichen Biologie spielen, in den letzten Jahren zugenommen hat, haben Forscher die breite Palette attraktiver Vorteile, die ihre Metaboliten ausstellen. Insbesondere Epoxid-Fettsäure-Metaboliten, die von der Cytochrom-P450-Klasse von Enzymen produziert wurden, waren ein großer Schwerpunkt. Beispielsweise spielen viele PUFA-Epoxide, einschließlich Epoxyeicosatrienosäuren (EETs), Epoxydocosapentaensäuren (EDP) und Epoxyeicosatetraenosäuren (EEQs), eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Blutdruck und Entzündungen1,2 , 3 , 4 , 5. Interessanterweise haben die spezifischen Enantiomere und Regioisomere von AA- und EPA-Epoxiden bekanntlich unterschiedliche Auswirkungen auf die Vasokonstriktion6,7. Während die physiologischen Wirkungen der Enantiomere und Regioisomere von EETs und EEQs dokumentiert sind, ist wenig über die Wirkung der analogen Epoxidokanosäuren (EDP) aus DHA bekannt. Die weitverbreitete Verwendung von Fischöl8, das sowohl an EPA als auch an DHA reich ist, hat ebenfalls das Interesse an DEN EDP9geweckt. Die Vorteile dieser Ergänzungen werden geglaubt, um teilweise aufgrund der nachgelagerten DHA-Metaboliten (16,17-EDP und 19,20-EDP ist die am häufigsten vorkommende), weil in vivo Niveaus von EDP sehr gut mit der Menge an DHA in der Ernährung10 , 11.
Die Untersuchung der Mechanismen und Ziele dieser Epoxidfettsäuren durch Metabolomik, chemische Biologie und andere Methoden hat sich als herausforderunglich erwiesen, zum Teil, weil sie als Mischungen von Regio- und Stereo-Isomeren existieren, und eine Methode zur Gewinnung reiner Mengen der Enantiomere und Regioisomer erforderlich sind. Herkömmliche Mittel zur chemischen Synthese dieser Verbindungen haben sich als unwirksam erwiesen. Die Verwendung von Peroxysäuren wie Meta-Chloroperoxybenzoesäure für die Epoxidation hat viele Nachteile, insbesondere den Mangel an Epoxidationsselektivität, der eine teure und sorgfältige Reinigung einzelner Regioisomere und Enantiomere erfordert. Die Gesamtsynthese von DHA- und EPA-Metaboliten ist möglich, leidet aber auch unter Nachteilen, die es für großflächige Syntheseen wie hohe Kosten und niedrige Erträge12,13machen. Effiziente Gesamtproduktion kann mit enzymatischer Synthese erreicht werden, da enzymatische Reaktionen regio- und stereoselektiv sind14. Studien zeigen, dass die enzymatische Epoxidation von AA und EPA (mit BM3) sowohl regioselektiv als auch enantioselektivist 15,16,17,18, aber dieses Verfahren wurde nicht mit DHA oder an einem großen skala. Das übergeordnete Ziel unserer Methode war es, diese chemoenzymatische Epoxidation zu skalieren und zu optimieren, um schnell signifikante Mengen an reinen Epoxidfettsäuren als ihre individuellen Enantiomere zu produzieren. Mit der hier vorgestellten Methode haben Forscher Zugang zu einer einfachen und kostengünstigen Strategie für die Synthese von EDV und anderen PUFA-Epoxidmetaboliten.

<table><tbody><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>NA</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>GoldBio</td><td>A30125</td><td>NA</td></tr><tr><td>Wasserfreies Magnesiumsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-3</td><td>NA</td></tr><tr><td>Wasserfreies Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322515</td><td>NA</td></tr><tr><td>Wasserfreies Natriumsulfat</td><td>Fisher</td><td>Scientific S421-500</td><td>NA</td></tr><tr><td>wasserfrei Toluol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>NA</td></tr><tr><td>Arachidonsäure (AA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-71A</td><td>Luftempfindlich.&nbsp;</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td>NA</td></tr><tr><td>DMSO (molekularbiologische Qualität)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>NA</td></tr><tr><td>Docosahexaensäure (DHA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-84A</td><td>Luftempfindlich.&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td></td></tr><tr><td>NA Eicosapentaensäure (EPA)</td><td>Nu-Chek Vorbereitung</td><td> U-99A</td><td>luftempfindlich.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylacetat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>34858</td><td>NA</td></tr><tr><td>Flash-Säulenkartuschen Größen 25, 40, 4, 12 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>145170203, 145154064, 5170200</td><td>Alternativ kann auch konventionelle Säulenchromatographie verwendet werden</td></tr><tr><td>Ameisensäure (HPLC-Qualität)</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td>NA</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>VWR</td><td>BDH24575</td><td>NA</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>NA</td></tr><tr><td>Lithiumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442410</td><td>NA</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>2444-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>Methanol (HPLC-Qualität)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-41-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>NADPH Tetranatriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>481973</td><td>Luftempfindlich.&nbsp;</td></tr><tr><td>Oxalsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>194131</td><td>NA</td></tr><tr><td>pBS-BM3 transfiziert DH5&alpha; E. coli</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Giftig!</td></tr><tr><td>Kaliumpermanganat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223468</td><td>Für die DC-Färbung.</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma</td><td>795496</td><td>NA</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td>NA</td></tr><tr><td>Q Sepharose Fast Flow Harz (GE Healthcare life sciences)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-0515-01</td><td>Für die Reinigung des Anionenaustauschs von</td></tr><tr><td>Enzym Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran, wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>186562</td><td>NA</td></tr><tr><td>TMS-Diazomethan (2,0 M in Hexanen)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>362832</td><td>Sehr giftig.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GoldBio</td><td>T-400</td><td>NA</td></tr><<tr><td>strong>Ebenfalls erforderlich:Automatisches Flash-Reinigungssystem</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(wir haben einen Büchi Reveleris X2 verwendet)&nbsp;</td><td>Büchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 HPLC-Säule (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge für 10.000 x g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chirale HPLC-Säule (Lux Cellulose-3), 250 x 4,6 mm, 5 & Mikro; M, 1000 &Aring;)</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General Chemistry liefert: einen 2-Liter-Scheidetrichter, Bechergläser und Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von 1000-2000 l, 20-ml-Fläschchen, HPLC-Fläschchen, kleine Rundkolben und Rührstäbchen.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC (wir verwenden eine Shimadzu Prominence LC-20AT Analysepumpe und SPD-20A UV-vis Detektor</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 Spektralphotometer&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td>NMR: Agilent DD2 Spektrometer (500 MHz)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotationsverdampfer</td><td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator oder Ultraschall-Homogenisator</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

enzymatische synthese von epoxidierten metaboliten von docosahexaenoic, eicosapentaenoic und arachidonsäuren

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Die epoxidierten Metaboliten verschiedener mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFAs), die als Epoxidfettsäuren bezeichnet werden, haben eine Vielzahl von Rollen in der menschlichen Physiologie. Diese Metaboliten werden endogen durch die Cytochrom-P450-Klasse von Enzymen hergestellt. Aufgrund ihrer vielfältigen und starken biologischen Wirkung besteht ein erhebliches Interesse an der Untersuchung dieser Metaboliten. Die Bestimmung der einzigartigen Rolle dieser Metaboliten im Körper ist eine schwierige Aufgabe, da die Epoxidfettsäuren zunächst in signifikanten Mengen und mit hoher Reinheit erhalten werden müssen. Die Gewinnung von Verbindungen aus natürlichen Quellen ist oft arbeitsintensiv, und lösliche Epoxidhydrolasen (sEH) hydrolysieren die Metaboliten schnell. Andererseits ist die Erlangung dieser Metaboliten über chemische Reaktionen sehr ineffizient, da es schwierig ist, reine Regioisomere und Enantiomere, niedrige Erträge und eine umfangreiche (und teure) Reinigung zu erhalten. Hier präsentieren wir eine effiziente enzymatische Synthese von 19(S), 20(R)- und 16(S),17(R)-epoxydocosapentaennoic acids (EDPs) aus DHA via Epoxidation mit BM3, einem bakteriellen CYP450-Enzym, das ursprünglich aus Bacillus isoliert wurde Megaterium (das leicht in Escherichia coliausgedrückt wird). Die Charakterisierung und Bestimmung der Reinheit erfolgt mit DerKernspinresonanzspektroskopie (NMR), der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und der Massenspektrometrie (MS). Dieses Verfahren veranschaulicht die Vorteile der enzymatischen Synthese von PUFA-Epoxid-Metaboliten und ist auf die Epoxidation anderer Fettsäuren anwendbar, einschließlich Arachidonsäure (AA) und Eicosapentaensäure (EPA), um die analoge epoxyeicosatrienoische Säuren (EETs) bzw. Epoxyeicosatetraenosäuren (EEQs).

Das Blitzsäulenchromatogramm (durchgeführt mit einem automatisierten Blitzreinigungssystem, wie unten beschrieben), das bei der Reinigung des Rohgemischs aus enzymatischer Epoxidation erhalten wurde, ist in Abbildung 1dargestellt. Nach Veresterung und Trennung der Regioisomerewurden reine 16( S), 17(R)-EDP und 19(S),20(R)-EDP Methylester erhalten. In der Regel sind sie in einem ungefähren Verhältnis von 1:4bis 1:5 ...

Wir präsentieren eine Methode, die für die großflächige enzymatische Synthese und Reinigung spezifischer Enantiomere und Regioisomere von Epoxiden von Arachidonsäure (AA), Docosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure (EPA) unter Verwendung eines bakteriellen Cytochroms nützlich ist. P450-Enzym (BM3).

Enzymatische Synthese von epoxidierten Metaboliten von Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic und Arachidonsäuren

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

So ermöglicht unser Protokoll uns, enantiopure Epoxid-Fettsäuren vorzubereiten, und diese Methode könnte helfen, die Forschung über die Mechanismen, mit denen diese Metaboliten im Körper wirken, voranzutreiben. Historisch gesehen sind reine Epoxidfettsäuren sehr schwer zu erhalten. Unser Protokoll ist also einfach, schnell und kostengünstig und ermöglicht es uns, erhebliche Mengen dieser Metaboliten vorzubereiten.Ja, wir haben ein Protokoll für DHA entwickelt, aber es funktioniert auch sehr gut für EPA und Arachidonsäure. Arbeiten Sie schnell, da einige der Reagenzien luftempfindlich sind, speziell DHA und NADPH, und achten Sie darauf, alles im Voraus zu koppeln, so dass die Einrichtung einfach ist. Seien Sie sich auch der Gefahren bewusst.Unser Protokoll verwendet Techniken sowohl in der Enzymologie als auch in der organischen Chemie. Die Visualisierung ist wichtig, um Lesern und Betrachtern zu helfen, die mit den spezialisierten Techniken in diesen Bereichen nicht vertraut sind. Um zu impfen, verwenden Sie eine sterile Schleife oder Pipette in Glycerin-Bestand von pBS-BM3 transfiziert DH5-alpha E.coli in fünf Milliliter sterile LB-Brühe mit 0,5 Milligramm Ampicillin ergänzt.Die Zellkultur in einem Shaker bei 37 Grad Celsius 24 Stunden bei 200 Umdrehungen pro Minute bebrüten. Dann fügen Sie die Fünf-Milliliter-Starterkultur und 100 Milligramm Ampicillin zu einem Liter steriler LB-Brühe in einem Erlenmeyerkolben hinzu. Schütteln Sie bei 37 Grad Celsius für sechs Stunden bei 200 Rpm, dann bei 30 Grad Celsius für 18 Stunden bei 200 Rpm.Danach die Zellkultur in Zentrifugenröhren sammeln und die Zellkultur bei vier Grad Celsius 10 Minuten bei 1000 mal g zentrifugieren. Gießen Sie den Überstand in einen anderen Kolben. Dekontaminieren Sie mit Bleichmittel oder mit dem Autoklaven, und speichern Sie das Zellpellet bei minus 78 Grad Celsius bis zur Enzymreinigung.Um die Zelllyse durchzuführen, tauen Sie zuerst das Zellpellet auf Eis auf und setzen Sie in 40 Millilitere eiskalte Löslichkeitspuffer mit Tris, PMSF und EDTA wieder auf. Während sie auf dem Eis sind, beschallen Sie die Zellen für eine Minute mit einem Ultraschall-Homogenisator, mit einer Ausgangsleistungseinstellung von 10 und einer Leistung von 100, gefolgt von einer einminütigen Pause auf Eis, um die Zellen zu lysieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang sechsmal.Zentrifuge die Zelle lysiert bei vier Grad Celsius für 30 Minuten bei 11.000 mal g, um den Zellabfall zu pellet. Um die Affinitätschromatographie in einem Kühlraum oder Kühlschrank mit Schiebetür bei vier Grad Celsius durchzuführen, bereiten Sie zunächst eine starke Anionenaustauschchromatographiesäule vor, indem Sie das Harz mit fünf Säulenvolumen des Puffers A von 10-Millimolar Tris bei pH 7,8 waschen. Als nächstes fügen Sie den Überstand der Zelllysate in die ausgeglichene Spalte ein und waschen Sie die Säule mit drei Spaltenvolumina des Kaltpuffers A. Dann, elute die BM3 durch Waschen der Spalte mit sechs Spaltenvolumen kaltpuffer B von 10-Millimolar Tris und 600-Millimolar Natriumchlorid.Sammeln Sie die rötlich-braune Eluentenfraktion. Wenn das Protein nicht sofort verwendet wird, mischen Sie es mit einem gleichen Volumen von Glycerin, und Flash-Freeze mit flüssigem Stickstoff. Bewahren Sie die gefrorene Lösung bei minus 78 Grad Celsius auf.Um die Epoxidation von DHA durchzuführen, bestimmen Sie zunächst die Konzentration des aufgetauten BM3-Enzyms gemäß der Carbonmonoxid-Dithionit-Spektral-Assay-Methode. Dann, in einem Becher, der zwei Liter Reaktionspuffer enthält, der auf einer magnetischen Rührplatte gerührt wird, fügen Sie 0,94 Millimol DHA in 18,8 Milliliter DMSO verdünnt und das BM3-Enzym auf 20 Nanomolar verdünnt. Während die Lösung rührt, beginnen Sie die Epoxidationsreaktion, indem Sie 8,7 Milliliter Reaktionspuffer hinzufügen, der 0,94 Millimole NADPH enthält.Rühren Sie die Reaktion für 30 Minuten, während Luft in die Reaktionsmischung mit einem luftgefüllten Ballon an einer Spritze befestigt und Nadel an der Innenseite des Bechers geklebt. Danach einen Mikroliter des Reaktionsgemisches aufstellen und in ein NanoDrop Spektralphotometer geben, um die Absorption bei 340 Nanometern zu messen. Verwenden Sie Wasser als Rohling.Wenn keine Restabsorption vorhanden ist, was darauf hinweist, dass NADPH verbraucht wurde, ist die Reaktion vollständig. Das Reaktionsgemisch durch langsames Hinzufügen von einmollaren Oxalsäure tropfenweise ablöschen, bis der pH-Wert der Lösung etwa vier erreicht. Extrahieren Sie nun die abgeschreckte Pufferlösung mit zwei Litern wasserfreiem, peroxidfreiem Diethylether.Verwenden Sie einen Trenntrichter, um die Schichten zu schütteln und zu trennen, und sammeln Sie den Äther in einem Erlenmeyerkolben. Wiederholen Sie zwei weitere Male, und fügen Sie etwa 50 Gramm wasserfreies Magnesiumsulfat hinzu, um den Äther zu trocknen. Auf einem Vakuumfiltertrichter den getrockneten Äther gießen, um das Magnesiumsulfat zu filtern, und die gefilterte Ätherschicht in einen rund-Boden-Kolben des Rotationsverdampfers geben.Stellen Sie die Rotationsgeschwindigkeit auf Medium ein, und starten Sie das Vakuum, um die Flüssigkeit zu konzentrieren, um rohe EDP-Rückstände zu erzielen. Laden Sie den Rückstand in eine 40-Gramm-Kieselsäurepatrone, um die Flash-Säulenchromatographie mit einer automatischen Blitzreinigungsmaschine durchzuführen. Beginnen Sie bei 10%ethylacetat in Hexanen und hochfahren bis zu 60%ethylacetat in Hexanen über 22 Minuten.Die Fraktionen werden automatisch in Rohren gesammelt. Kombinieren Sie dann die Fraktionen von jedem Gipfel zu einem rund-Boden-Kolben, setzen Sie den Rotationsverdampfer auf und starten Sie die Verdunstung. Es werden drei Fraktionen erhalten, DHA, EDP-Isomere und Diepoxid.Um die erhaltenen 0,151 Gramm Epoxid in einem rund-Boden-Kolben oder einer kleinen Durchstechflasche zu verestern, fügen Sie zwei Milliliter wasserfreies Methanol und drei Milliliter wasserfreies Toluol hinzu, und fügen Sie einen Rührbalken hinzu. Verbinden Sie den Kolben mit einem mit Argon gefüllten Ballon durch ein Gummiseptum und eine Nadel, und fügen Sie 0,26 Milliliter zweimollaren TMS-Diazomememe durch eine Spritze unter Rühren hinzu. Warten Sie 10 Minuten, und fügen Sie weitere 05 Milliliter TMS-Diazomethan hinzu, bis eine blassgelbe Farbe erscheint.Nach 30 Minuten die Mischung sorgfältig mit dem Rotationsverdampfer konzentrieren und eine 40-Gramm-Kieselgel-Säulenpatrone auf der Blitzchromatographie-Maschine verwenden, um den Rückstand zu reinigen. Elute mit einer isokratischen Konzentration von 4%Ethylacetat in Hexanen über 22 Minuten. Sammeln Sie zuerst die Fraktionen, die die gereinigten 19S, 20R-EDP Methylestereluate enthalten, gefolgt von 16S, 17R-EDP Methylester.Bewerten Sie nun die Fraktionen durch dünnschichtige Chromatographie in einem Hexan-Ethylacetat-Gemisch von acht zu eins. Stain mit Kaliumpermanganat, um nach gemischten Fraktionen zu suchen, die beide Isomere enthalten. Konzentrieren Sie die Fraktionen, die jedem Peak entsprechen, auf einen Rotationsverdampfer und wiegen Sie dann auf einem Gleichgewicht, um die Menge der erhaltenen EDP-Ester zu bestimmen.Wenn gemischte Fraktionen übrig bleiben, rechromatographieren Sie sie mit dem gleichen Lösungsmittelsystem wie bisher verwendet. Konzentrieren Sie jede Fraktion, die das einzelne Regioisomer enthält, auf einen Rotationsverdampfer. Um einzelne EDV-Methylester-Regioisomen in ihre Säureformen umzuwandeln, verdünnen Sie den EDV-Ester in einer kleinen Durchstechflasche mit etwa 0,7 Milliliter THF pro 0,1 Millimol Ester, zusammen mit 0,175 Milliliter Wasser.Kühlen Sie die Durchstechflasche in einem Eisbad auf null Grad Celsius, fügen Sie drei Äquivalente von Lithiumhydroxid-Lösung hinzu und rühren Sie auf einer Rührplatte unter Argon über Nacht, während sie sich auf Raumtemperatur erwärmt. Am Morgen die Reaktion durch langsames Hinzufügen von Ameisensäure abschrecken, bis der pH-Wert der Mischung drei bis vier erreicht. Dann wasser und zwei Milliliter Ethylacetat hinzufügen, um die Schichten zu trennen.Die Wasserschicht dreimal mit 10 MilliliterEthylacetat abziehen, mit 20 Millilitern gesättigter Solelösung waschen und mehrere Gramm wasserfreies Natriumsulfat in die Lösung zum Trocknen der Ethylacetatschicht geben. Konzentrieren Sie die Ethylacetatlösung mit dem Rotationsverdampfer, fügen Sie 10 Milliliter Hexane hinzu und konzentrieren Sie sich erneut. Zweimal wiederholen, um azeotropisch Restameisensäure zu entfernen.Reinigen Sie den Rückstand durch Blitzsäulenchromatographie, Elumitieren mit 10 bis 30%Ethylacetat über 15 Minuten. Konzentrieren Sie die gewünschten Fraktionen im Rotationsverdampfer und trocknen Sie im Vakuum, um sich die gereinigte Säure zu leisten. Das Beikochromatogramm der Blitzsäule, das bei der Reinigung des Rohgemisches aus enzymatischer Epoxidation gewonnen wird, wird hier gezeigt.Es wurden drei haupthebespitzen erreicht, die in der Reihenfolge der erstens unreagierten DHA, der zweiten Mischung von EDV-Isomen und drittens Derpoxid, die normale Überoxidationsprodukte sind, elutierend. Nach veresterter und abgetrennter Regioisomer deuten die Proton-NMR-Spektren darauf hin, dass hochreine 16S, 17R-EDP und 19S, 20R-EDP-Methylester erhalten wurden. Chiral HPLC bestätigte enantiomere Reinheit der sauren Formen der EDP.Achten Sie darauf, Ihre Brühe während der Handhabung und Impfung steril zu halten, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Epoxidation kann für andere Fettsäuren verwendet werden. Also probierten wir es auch mit arachiiden und eicosapentaennoic Säuren, und wir erhielten gute Erträge dieser enantiopure Epoxide, so 14, 15-EET und 17, 18-EEQ.So könnte ein Protokoll, das Forschern den Zugang zu Epoxid-Fettsäuren ermöglicht, bei der Erforschung der biologischen Funktionen dieser Verbindungen helfen, was zu ihrer Verwendung als Arzneimittel-Leads führen könnte. Die gefährlichen Chemikalien sind PMSF, das durch Kontakt gefährlich ist, und TMS-Diazomeme, das durch Kontakt und Einatmen sehr giftig ist. Letzteres sollte also in einer Dunstabzugshaube und mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung verwendet werden.

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Chemie

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