Name: Ein doppelt humanisiertes BLT-Mäuse-Modell mit einem stabilen humanähnlichen Gut-Mikrobiom und menschlichem Immunsystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung doppelt humanisierter BLT-Mäuse mit funktionalem menschlichem Immunsystem und stabilen humanähnlichen Darmmikrobiom. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Modelle ohne keimfreie Bedingungen für immunologische und mikrobiombezogene Forschung.

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Wir danken Yanmin Wan, Guobin Kang und Pallabi Kundu für ihre Unterstützung bei der Erzeugung von BLT-humanisierten Mäusen. Wir möchten die UNMC Genomics Core Facility würdigen, die teilweise Unterstützung vom Nebraska Research Network In Functional Genomics NE-INBRE P20GM103427-14, The Molecular Biology of Neurosensory Systems CoBRE P30GM110768, The Fred & Pamela erhält. Buffett Cancer Center - P30CA036727, The Center for Root and Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, und die Nebraska Research Initiative. Wir danken der University of Nebraska - Lincoln Life Sciences Annex und ihren Mitarbeitern für ihre Unterstützung. Diese Studie wird teilweise von den National Institutes of Health (NIH) Grants R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI111862 to Q Li unterstützt.  Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Erstellung des Manuskripts oder der Entscheidung für die Veröffentlichung.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den von Institutional Animal Care and Research Committee (IACUC) genehmigten Protokollen an der Universität Nebraska-Lincoln (UNL) durchgeführt. Die IACUC an der UNL hat zwei Protokolle zur Erzeugung und Verwendung von Hu-BLT-Mäusen genehmigt, darunter Doppel-Hu-Mäuse. Darüber hinaus hat das Scientific Research Oversight Committee (SROC) an der UNL auch die Verwendung menschlicher embryonaler Stammzellen und fetaler Gewebe genehmigt, die aus der Advanced Bioscience Resources für humanisierte Mäusestudien (SROC-1-002) beschafft werden.
1. Mäusegehäuse und Wartung
<ol><li>Kaufen Sie 6-8 Wochen alte NSG-Mäuse (NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).</li>
	<li>Beherbergen Sie die Mäuse unter SPF-Bedingungen mit Luftaustausch, Vorfiltern und HEPA-Filtern (0,22 m) in einem Raum mit kontrollierter Temperatur, Feuchtigkeit und Druck.<ol>
<li>Die Mäuse in autoklavierten Einzelmikroisolatorkäfigen in einem Racksystem unterbringen und warten, das in der Lage ist, den Luftaustausch mit Vorfiltern und HEPA-Filtern (0,22 m) zu verwalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie alle Verfahren und Manipulationen der Mäuse in einer biologischen Sicherheitsrauchhaube der Klasse II Typ A2 durch, die mit 70% Ethanol vorbehandelt wurde. Vor der Arbeit im Tierzimmer, Duschen und wechseln Sie in saubere Peelings, Tyvek Anzug, Stiefelabdeckungen, Haarkappe, Gesichtsmaske und Handschuhe. Tragen Sie während der chirurgischen Eingriffe ein OP-Kleid über dem Tyvek-Anzug. HINWEIS: Ultraviolette (UV) Lichtdekontamination wird auch vor Verfahren bevorzugt.<ol>
<li>Autoklaven Sie nach Möglichkeit alle Instrumente und Reagenzien und desinfizieren Sie sie dann vor dem Transfer auf die Dunstabzugshaube.</li>
		<li>Entfernen Sie während der Eingriffe die individuell belüfteten Käfige der Tiere aus dem Gestell und desinfizieren Sie sie, bevor Sie auf die Dunstabzugshaube übertragen werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Füttern Sie die Mäuse mit einer bestrahlten Nahrung und liefern Sie autoklaviertes Wasser. Bestrahlte Lebensmittel ab libitum zur Verfügung stellen und bei Bedarf mit zusätzlichen bestrahlten Lebensmitteln ergänzen. Ändern Sie autoklaviertes Wasser wöchentlich oder nach Bedarf. HINWEIS: Autoklaviertes saures Wasser kann auch verwendet werden. Die bereitgestellte bestrahlte Ernährung hatte eine Haltbarkeit von 6 Monaten nach der Herstellung.</li>
</ol>2. Erzeugung von humanisierten BLT-Mäusen
HINWEIS: Die Erzeugung von hu-BLT-Mäusen wurde zuvor beschrieben22,23,24.
<ol><li>Geben Sie den Mäusen am Tag der Operation eine Ganzkörperbestrahlung in einer Dosis von 12 cGy/g Körpergewicht.</li>
	<li>Bereiten Sie die Mäuse für eine Operation vor.<ol>
<li>Geben Sie jeder bestrahlten Maus eine Mischung aus Ketamin bei der Arbeitskonzentration von 100 mg/kg und Xylazin in der Konzentration von 12 mg/kg, die zwischen 130-170 l pro Maus auf der Grundlage des Körpergewichts durch intraperitoneale (IP) Injektion zur Anästhesie reichte. Zur Zubereitung von 3 ml des Ketamin- und Xylazin-Gemischs 0,27 ml Ketamin bei der Lagerkonzentration von 100 mg/ml und 0,03 ml Xylazin in der Konzentration von 100 mg/ml bis 2,7 ml steriler Saline hinzufügen und gut vermischen. Desinfizieren Sie die Haut vor der Injektion mit 70% Isopropanol.</li>
		<li>Geben Sie jeder bestrahlten Maus Buprenorphin 1 mg/kg Körpergewicht (halblebend 72 h, SR-LAB) durch subkutane Injektion für ein lang anhaltendes Schmerzmanagement.</li>
		<li>Geben Sie jeder bestrahlten Maus 100 l (858 g) Cefazolin durch IP-Injektion zur präoperativen Antibiotikaprophylaxe.</li>
		<li>Rasieren Sie die Haare der Mäuse mit elektrischen Haarschneider um die linke seitliche und mediale Seite der Maus an der späteren chirurgischen Stelle verwendet, um die linke Niere zu belichten.</li>
		<li>Überprüfen Sie das richtige Maß an Anästhesie durch Pedalreflex (feste Zehenklemme).</li>
		<li>Geben Sie Isoflurangas bei 3-5%, wenn eine zusätzliche Anästhesie an jedem Punkt während der Operation benötigt wird.</li>
		<li>Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf beide Augen auf, um hornhautaustrocknung zu verhindern. Tragen Sie bei Bedarf ein Ohrschild auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine Operation durch, um die Leber und Thymusgewebe in die linke Nierenkapsel zu implantieren.<ol>
<li>Desinfizieren Sie die Haut an der chirurgischen Stelle, indem Sie Jodpeeling von der Mitte der chirurgischen Stelle aus auftragen und sich kreisförmig nach außen bewegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit 70% Isopropanol und ein drittes Mal mit Jod.</li>
		<li>Mit Zangen, laden Sie zuerst ein menschliches fetales Lebergewebe Fragment in einen Trokar. Dann mit Zangen, laden Sie ein menschliches fetales Thymus-Gewebefragment in den Trokar. Dann mit Zangen, laden Sie ein weiteres menschliches fetales Lebergewebe Fragment in den Trokar. Gewebe sollten auf 1-1,6 mm3 geschnitten werden, um die Innenabmessungen des Trokars zu passen.</li>
		<li>Verwenden Sie Zangen, um die Haut zu heben und verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt längs zu machen. Verlängern Sie den Schnitt auf 1,5-2 cm in der linken Seite der Maus.</li>
		<li>Verwenden Sie Zangen, um die Muskelschicht zu heben und verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen Schnitt längs zu machen. Erweitern Sie den Schnitt nach Bedarf, um die Niere freizulegen.</li>
		<li>Setzen Sie die Niere aus, indem Sie das Fettgewebe, das die Niere umgibt, sanft erfassen. Berühren Sie das Nierenparenchym nicht direkt.</li>
		<li>Machen Sie einen 1-2 mm Schnitt am hinteren Ende der Nierenkapsel mit einem Skalpell.</li>
		<li>Setzen Sie den vorbelasteten Trokar langsam durch den Schnitt parallel zur langen Achse der Niere ein und geben Sie das Gewebe zwischen Nierenkapsel und Niere frei.</li>
		<li>Bringen Sie die Niere und den Darm vorsichtig in ihre normale Position zurück. Verwenden Sie resorbierbare 5/0 P-3 (P-13) Nähte mit 13mm 3/8 Kreisnadel, um die Muskelschicht und chirurgische Klammern zu schließen, um die Haut zu schließen.</li>
	</ol></li>
	<li>Nach der Operation, legen Sie die Maus in einen sauberen autoklavierten Mikroisolator Käfig für die Genesung.<ol>
<li>Um den Wärmeverlust während der postoperativen Rückgewinnung zu minimieren, legen Sie den Käfig mit den Mäusen auf ein Heizkissen, das mit einer Wasserpumpe verbunden ist, die das Wasser erwärmt und zirkuliert.</li>
		<li>Überwachen Sie die Mäuse, bis sie genügend Bewusstsein wiedererlangt haben, um die Brustbesinnung aufrechtzuerhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Innerhalb von 6 h nach Abschluss der Operation, über die Schwanzvene, injizieren CD34+ hämatopoetische Stammzellen aus menschlichen fetalen Lebergewebe isoliert.<ol>
<li>Erwärmen Sie die Mäuse mit einer Wärmelampe. Desinfizieren Sie den Schwanz mit 70% Isopropanol und injizieren Sie dann 1,5 bis 5 x 105 Stammzellen/200 l in die Schwanzvene.</li>
		<li>Stoppen Sie alle Blutungen aus der Injektion und bringen Sie Mäuse in den Mikroisolatorkäfig und den Mikroisolatorkäfig in den Käfigträger zurück. HINWEIS: Mäuse nach der Operation sind in der Regel zusammen untergebracht, fünf pro Mikroisolatorkäfig, während und nach der Genesung. Mäuse werden jedoch nur zusammen untergebracht, wenn sie alle am selben Tag operiert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Überprüfen Sie die Mäuse täglich. Überwachen Sie die chirurgischen Heftklammern sorgfältig und ersetzen Sie sie bei Bedarf. Beobachten Sie die Mäuse genau auf Anzeichen einer Infektion oder Beschwerden. Liefern Sie autoklavierte Lebensmittel auf dem Boden des Mikroisolatorkäfigs für ein paar Tage nach der Operation.</li>
	<li>Entfernen Sie die chirurgischen Heftklammern 7-10 Tage nach der Operation. Geben Sie Isoflurangas bei 3-5%, um die Mäuse zu anästhesieren. Entfernen Sie vorsichtig die Heftklammern und wenden Sie dann Antibiotikum und schmerzlindernde Salbe auf die Website.</li>
	<li>Erlauben Sie 9-12 Wochen für die Rekonstitution von menschlichen Immunzellen, dann sammeln peripheres Blut aus der medialen saphenous Vene von jeder der humanisierten Mäuse.<ol>
<li>Beschränken Sie bewusste Mäuse mit einer entsprechend großen Kunststoffkegelrückhalteeinrichtung mit einer Öffnung in der Nähe des Mauskopfes zum Atmen und einer Öffnung in der Nähe der Rückseite der Maus, um ein Bein zu isolieren. Setzen Sie die Mäuse zuerst in den Rückhaltekegelkopf und ziehen Sie dann sanft ein Bein durch die Beinöffnung.</li>
		<li>Sprühen Sie die mediale Seite des isolierten Beins mit 70% Isopropanol, dann verbreiten Sie Antibiotika und schmerzlindernde Salbe auf die gleiche Stelle. HINWEIS: Die Salbe hilft, die Position der Vene ohne die Notwendigkeit der Haarentfernung zu offenbaren und hilft auch bei der Bildung von Bluttröpfchen.</li>
		<li>Mit einer 25-Spur-Nadel in einem 90°-Winkel, punktieren Sie die Vene und sammeln Sie 50-100 l Blut mit einem EDTA-beschichteten Blutentnahmeröhrchen. Stoppen Sie die Blutung, indem Sie Druck auf die Stelle mit steriler Gaze ausüben. Sobald die Blutung aufgehört hat, kehren Sie die Mäuse in ihren Käfig zurück. HINWEIS: Die maximalen Blutmengen, die gesammelt werden, betragen in der Regel 50 l pro Woche oder 100 l alle zwei Wochen.</li>
		<li>Verwenden Sie das gesammelte periphere Blut, um das Niveau der rekonstitutionen der menschlichen Immunzellen mithilfe der Durchflusszytometrie mit Antikörpern für hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19 zu testen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Antibiotika-Behandlung
<ol><li>Sammeln Sie vor der Antibiotikabehandlung Fäkalienproben vor der Behandlung. Bewegen Sie die Mäuse in einen neuen autoklavierten Mikroisolatorkäfig.</li>
	<li>Bereiten Sie täglich einen frischen Cocktail mit Breitspektrum-Antibiotika zu.<ol>
<li>Bereiten Sie 250 ml Wasser mit frisch zubereitetem Metronidazol (1 g/L), Neomycin (1 g/L), Vancomycin (0,5 g/L) und Ampicillin (1 g/L) für jeden Mikroisolatorkäfig von Mäusen vor. HINWEIS: Verwenden Sie autoklaviertes oder steriles Wasser für das mit Antibiotika ergänzte Trinkwasser.</li>
		<li>9,2 g Grapezucker gesüßtes Getränk in 250 ml antibiotisches, mitzusätzlichem Wasser hinzufügen. HINWEIS: Die Verwendung von Traubenzucker gesüßten Getränk Mischung maskiert den bitteren Geschmack der Antibiotika und hilft, Austrocknung bei den Mäusen zu verhindern.</li>
		<li>Ändern Sie das Antibiotikum und Traubenzucker gesüßt Getränk Mischung ergänzt Wasser und legen Sie die Mäuse in einem neuen autoklavierten Käfig täglich. HINWEIS: Mäuse sind koprophamisch und tägliches Wechseln der Käfige verhindert, dass sich die Mäuse wieder mit Darmbakterien impfen.</li>
		<li>Zur maximalen Engraftmentierung des menschenähnlichen Darmmikrobioms, antibiotika für 14 Tage zur Verfügung stellen. Während der Antibiotika-Behandlung, überwachen Sie die Mäuse auf Gewichtsverlust und Dehydrierung. Gewichtsverlust wird während der ersten 3-4 Tage und Plateaus danach für die Dauer der Behandlung erwartet. Wenn Dehydrierung auftritt, geben Sie den Mäusen Saline oder Ringers Lösung durch intraperitoneale Injektion. HINWEIS: Andere Darmmikrobiom Humanisation Protokolle erfordern orale Gavage von Antibiotika. Während wirksam bei der Erschöpfung der murinen Darmbakterien, Fanden wir, dass die weniger invasive Methode der Zugabe von Antibiotika in das Trinkwasser weniger Stress auf unsere humanisierten Mäuse und führte zu besseren Ergebnissen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Spenderproben und Fäkaltransplantation
<ol><li>Bereiten Sie menschliche Spender-Fäkalienproben vor.<ol>
<li>Verwenden Sie richtig vorbereitete Quellen von fäkalem Mikrobiota-Transplantationsmaterial (FMT) für die Fäkaltransplantation in die humanisierten Mäuse.</li>
		<li>FMT-Präparate auftauen und unter anaeroben Bedingungen in einer anaeroben Kammer aliquotieren.</li>
		<li>Wenn gewünscht, mischen Sie bei diesem Schritt gleiche Teile der Fäkalienproben zusammen, um eine unvoreingenommene "menschliche" Probe zu erstellen.</li>
		<li>Einfrieren und Auftauen des FMT-Materials auf ein Minimum beschränken, wenn keine Aliquotierung oder Vermischung von Proben erforderlich ist, nur unmittelbar vor dem Eingriff auftauen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Menschliche Fäkaltransplantation<ol>
<li>Nach Abschluss der 14-tägigen Antibiotika-Behandlung, ändern Sie das Trinkwasser in autoklaviertes Wasser und bewegen Sie die Mäuse in einen neuen autoklavten Käfig. Stoppen Sie tägliche Käfigwechsel und implementieren Sie einmal alle 1-2 Wochen Käfigwechsel.</li>
		<li>Geben Sie zwei Fäkalientransplantationen bei 24 und 48 h nach Beendigung der Antibiotika.</li>
		<li>24 h nach Antibiotika-Behandlung, tauen Sie die benötigte Menge an FMT-Material, geben Sie jeder Maus 200 l FMT-Material über orale Gavage. Wiederholen Sie den Vorgang erneut bei 48 h nach Antibiotika.</li>
		<li>Verteilen Sie das verbleibende oder übrig gebliebene aufgetaute FMT-Material auf das Fell der humanisierten Mäuse oder auf die Käfigbetten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Frische Fäkalienprobensammlung
<ol><li>Autoklavn Sie einzelne Papiertüten vor dem Transfer auf die Dunstabzugshaube.</li>
	<li>In der Dunstabzugshaube eine Maus in jede einzelne Papiertüte stecken und die Maus defäkieren lassen.</li>
	<li>Mit sterilen Zangen die Fäkalienprobe in 1,5 ml Kunststoffrohre einsammeln und bei -80 °C einfrieren. Bringen Sie die Mäuse in Mikroisolatorkäfige zurück. HINWEIS: Diese Methode der Sammlung von Fäkalienproben ermöglicht eine frische Fäkalienprobenentnahme von einzelnen Mäusen, ohne dass Stress zu Manipulationen führt.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das hier beschriebene Protokoll ist für die Schaffung von doppelhu-BLT-Mäusen, die sowohl ein funktionelles menschliches Immunsystem als auch ein stabiles menschenähnliches Darmmikrobiom aufweisen. Dieses Protokoll kann an andere humanisierte oder nicht-humanisierte Mäusemodelle angepasst werden, ohne dass GF-Tiere und gnotobiotische Einrichtungen benötigt werden. Während die hier beschriebenen Methoden relativ einfach sind, gibt es einige kritische Details, die für die erfolgreiche Erstellung von Doppelhu-BLT-Mäusen wic...

Humanisierte Mäuse (Hu-Mäuse) haben die Untersuchung vieler Aspekte der menschlichen Gesundheit und Krankheit verändert, einschließlich Hämatopoese, Immunität, Krebs, Autoimmunerkrankung und Infektionskrankheit1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Diese Hu-Mäuse haben den deutlichen Vorteil gegenüber anderen Mausmodellen, da sie ein funktionelles menschliches Immunsystem haben und mit humanspezifischen Krankheitserregern infiziert werden können. Dennoch hat sich die Bedeutung des Darmmikrobioms durch seine Rolle bei vielen menschlichen Krankheiten wie Fettleibigkeit, metabolischem Syndrom, entzündlichen Erkrankungen und Krebs10,11,12, 13. Das Schleimhaut-Immunsystem und Das Darmmikrobiom sind wechselseitig reguliert, um Darm und systemische Homöostase aufrechtzuerhalten. Das Immunsystem wird durch Antigene des Darmmikrobioms geformt und umgekehrt spielt das Immunsystem eine wichtige regulatorische Rolle bei der Förderung von darmen Darmbakterien und der Eliminierung von Krankheitserregern14,15, 16. Allerdings ist das Darmmikrobiom von Hu-Mäusen nicht gut charakterisiert und das murine Darmmikrobiom unterscheidet sich in Zusammensetzung und Funktion wesentlich von Menschen17. Dies ist auf evolutionäre, physiologische und anatomische Unterschiede zwischen dem murinen und menschlichen Darm sowie andere wichtige Faktoren wie Ernährung zurückzuführen, die die experimentellen Ergebnisse der Hu-Mäuse-Krankheitsmodelle beeinflussen können18. Daher wird über die Klassifizierung des murinen Darmmikrobioms von Hu-Mäusen hinaus ein Tiermodell benötigt, das sowohl ein menschliches Immunsystem als auch ein menschliches Darmmikrobiom zeigt, um die komplexen Wechselwirkungen menschlicher Krankheiten in vivo zu untersuchen.
Das Studium menschlicher Krankheiten direkt beim Menschen ist oft unpraktisch oder unethisch. Viele Tiermodelle können nicht zur Untersuchung menschlicher Krankheitserreger wie dem humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) verwendet werden. Nichtmenschliche Primatenmodelle sind genetisch ausgezüchtet, sehr teuer und nicht anfällig für viele menschliche Krankheitserreger. Mäuse, die als keimfrei (GF) abgeleitet und mit menschenähnlichen Darmmikrobiomen rekonstituiert wurden, wurden weit verbreitet verwendet, um die menschliche Gesundheit und Krankheit zu studieren19,20. Diese Tiere haben jedoch kein menschliches Immunsystem und die Arbeit mit GF-Tieren erfordert spezielle Einrichtungen, Verfahren und Fachwissen. Daher ist es notwendig, verbesserte präklinische Modelle zu studieren, um die komplexe Beziehung des Darmmikrobioms und des menschlichen Immunsystems zu untersuchen. Viele Stämme von Mäusen, wie NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) sind nicht als GF erhältlich. GF-Tiere können auch an langanhaltenden Immunschwächen leiden, die durch die Transplantation von Mikroben nicht vollständig umgekehrt werden21. Daher haben wir eine doppelhu-Mäuse mit einem funktionellen menschlichen Immunsystem und stabilem menschenähnlichen Darmmikrobiom unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen entwickelt. Um Doppel-Hu-Mäuse zu erzeugen, wurde an NSG-Mäusen operiert, um Knochenmark, Leber, Thymus humanisierte Mäuse (hu-BLT) zu erzeugen. Die hu-BLT-Mäuse wurden dann mit Breitspektrum-Antibiotika behandelt und dann mit einer gesunden menschlichen Spenderprobe fäkal transplantiert. Wir charakterisierten das bakterielle Darmmikrobiom von 173 Fäkalienproben von 45 doppelhu-BLT-Mäusen und 4 menschlichen Fäkalien-Spenderproben. Doppel-Hu-BLT-Mäuse haben einzigartige 16S rRNA-Genprofile, die auf der einzelnen menschlichen Spenderprobe basieren, die transplantiert wird. Wichtig ist, dass das transplantierte menschenähnliche Mikrobiom bei den Mäusen für die Dauer der Studie bis zu 14,5 Wochen nach der Transplantation stabil war. Darüber hinaus zeigten die vorhergesagten Metagenome, dass Doppel-Hu-BLT-Mäuse eine andere vorhergesagte funktionelle Kapazität haben als Hu-Mäuse, die den menschlichen Spenderproben ähnlicher sind.

<table><tbody><tr><td>Fütterungsnadeln für Tiere 18G</td><td>Cadence Science</td><td>9928B</td><td></td></tr><tr><td>Clidox-s Aktivator</td><td>Pharmacal Research Laboratories</td><td>95120F</td><td></td></tr><tr><td>Clidox-s Base</td><td>Pharmacal Research Laboratories</td><td>96125F</td><td></td></tr><tr><td>DGM 108 Käfiggestell</td><td>Techniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flat Braun Einkaufstasche 3-5/8" T x 6" B x 11-1/16" L&nbsp;</td><td>Grainger</td><td>12R063</td><td></td></tr><tr><td>FMT Upper Delivery Mikrobiota Präparate&nbsp;</td><td>OpenBiome</td><td>FMP30</td><td></td></tr><tr><td>Traube Kool-Aid</td><td>Kraft Foods Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCD19-PE/Cy5</td><td>Biolegend</td><td>302209</td><td></td></tr><tr><td>hCD3-PE</td><td>Biolegend</td><td>300408</td><td></td></tr><tr><td>hCD4-Alexa 700</td><td>Biolegend</td><td>300526</td><td></td></tr><tr><td>hCD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>304006</td><td></td></tr><tr><td>hCD8-APC/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>301016</td><td></td></tr><tr><td>Laktat gepufferte Ringer-Lösung</td><td>Boston BioProducts Inc&nbsp;</td><td>PY-906-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>mCD45-APC</td><td>Biolegend</td><td>103111</td><td></td></tr><tr><td>Microvette 100 K3E</td><td>Microvette</td><td>20.1278.100</td><td></td></tr><tr><td>Neosporin Erste Hilfe Antibiotikum/schmerzlindernde Salbe</td><td>Neosporin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NSG Mäuse (NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 25 G Needle</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>RS200 Röntgenstrahler</td><td>RAD Source Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sealsafe Plus GM500 Mikroisolatorkäfige</td><td>Techniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Vliesgaze</td><td>Fisherbrand</td><td>22-028-558</td><td></td></tr><tr><td>Teklad global 16% proteinbestrahltes Mausfutter</td><td>Teklad</td><td>2916</td><td></td></tr></tbody></table>

ein doppelt humanisiertes blt-mäuse-modell mit einem stabilen humanähnlichen gut-mikrobiom und menschlichem immunsystem

A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System

Humanisierte Mäuse (Hu-Mäuse), die über ein funktionelles menschliches Immunsystem verfügen, haben die Untersuchung menschlicher Krankheitserreger und Krankheiten grundlegend verändert. Sie können verwendet werden, um Krankheiten zu modellieren, die sonst schwierig oder unmöglich sind, bei Menschen oder anderen Tiermodellen zu studieren. Das Darmmikrobiom kann einen tiefgreifenden Einfluss auf die menschliche Gesundheit und Krankheit haben. Jedoch, das murine Darmmikrobiom ist sehr anders als das beim Menschen gefunden.  Es besteht Bedarf an verbesserten präklinischen Hu-Mäuse-Modellen, die ein transplantiertes menschliches Darmmikrobiom haben. Daher haben wir Doppel-Hu-Mäuse entwickelt, die sowohl ein menschliches Immunsystem als auch ein stabiles menschenähnliches Darmmikrobiom aufweisen. nicken. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse sind aufgrund ihrer hohen Immunschwäche eines der besten Tiere für die Humanisierung. Keimfreie NSG-Mäuse und verschiedene andere wichtige keimfreie Mäusemodelle sind derzeit jedoch nicht kommerziell erhältlich. Darüber hinaus haben viele Forschungsumgebungen keinen Zugang zu gnotobiotischen Einrichtungen, und die Arbeit unter gnotobiotischen Bedingungen kann oft teuer und zeitaufwändig sein. Wichtig ist, dass keimfreie Mäuse mehrere Immunschwächen haben, die auch nach der Transplantation von Mikroben bestehen. Deshalb haben wir ein Protokoll entwickelt, das keine keimfreien Tiere oder gnotobiotischen Einrichtungen erfordert. Um Doppel-Hu-Mäuse zu erzeugen, wurden NSG-Mäuse vor der Operation mit Strahlung behandelt, um Knochenmark-, Leber-, Thymus-humanisierte (hu-BLT) Mäuse zu erzeugen. Die Mäuse wurden dann mit Breitspektrum-Antibiotika behandelt, um das bereits vorhandene murine Darmmikrobiom zu erschöpfen. Nach einer Antibiotika-Behandlung erhielten die Mäuse Fäkaltransplantationen mit gesunden menschlichen Spenderproben per oraler Gavage. Doppel-Hu-BLT-Mäuse hatten einzigartige 16S rRNA-Genprofile, die auf der einzelnen menschlichen Spenderprobe basierten, die transplantiert wurde. Wichtig ist, dass das transplantierte menschenähnliche Mikrobiom in den doppelhu-BLT-Mäusen für die Dauer der Studie bis zu 14,5 Wochen nach der Transplantation stabil war.

Abbildung 1 zeigt einen Überblick über die Methoden zur Herstellung von Doppel-Hu-BLT-Mäusen und beschreibt kurz den Prozess der Zugabe eines funktionellen menschlichen Immunsystems und eines stabilen menschenähnlichen Darmmikrobioms zu den NSG-Mäusen. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für die Analyse der Durchflusszytometrie von peripherem Blut aus einer humanisierten BLT-Maus 10 Wochen nach der Operation. Abbildung 3 zeigt die relati...

Wir beschreiben eine neuartige Methode zur Erzeugung doppelt humanisierter BLT-Mäuse, die über ein funktionelles menschliches Immunsystem und ein stabiles transplantiertes menschenähnliches Darmmikrobiom verfügen. Dieses Protokoll kann ohne keimfreie Mäuse oder gnotobiotische Einrichtungen befolgt werden.

Ein doppelt humanisiertes BLT-Mäuse-Modell mit einem stabilen humanähnlichen Gut-Mikrobiom und menschlichem Immunsystem

Humanized mice (hu-mice) that feature a functional human immune system have fundamentally changed the study of human pathogens and disease. They can be ...

Unser Protokoll ist von Bedeutung, da es verwendet werden kann, um Mäuse mit einem menschlichen Darmmikrobiom und einem menschlichen Immunsystem reproduzierbar zu erstellen. Wir nennen diese Mäuse doppelt humanisierte Mäuse. Das doppelhumanisierte Mausmodell kann sowohl für die grundlegende als auch für die translationale biomedizinische Forschung verwendet werden, einschließlich der Untersuchung von In-vivo-Beziehungen zwischen dem menschlichen Darmmikrobiom und dem menschlichen Immunsystem.Demonstriert wird das Verfahren von Jianshui Zhang, einem Postdoc, und Yilun Chang, einem Doktoranden aus unserem Labor. Um leber- und Thymusgewebe in die linke Nierenkapsel zu implantieren, legen Sie zuerst die Maus in eine Kapuze. Behandeln Sie die Mäuse am Tag der Operation mit einer subletalen Bestrahlung des Ganzen Körpers mit einer Dosis von 12 Centigrays pro Gramm Körpergewicht.Rasieren Sie jede Maus um die linke seitliche und mediale Seite, nachdem Sie eine entsprechende Sedierung sedierung sediert haben. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen des Tieres auf und tragen Sie bei Bedarf eine Ohrmarke auf. Desinfizieren Sie die Haut mit drei aufeinanderfolgenden Jod- und 70%Isopropanolpeelings.Wenn die Haut vorbereitet wurde, verwenden Sie Zangen, um ein bis sechs Millimeter gewürfeltes menschliches fetales Lebergewebefragment in einen Trokar zu laden, gefolgt von einem ein- bis 1,6 Millimeter gewürfelten menschlichen fetalen Thymus-Gewebefragment. Verwenden Sie die Zange, um die Haut zu heben, und verwenden Sie ein Skalpell, um eine kleine Längsschnitt in die Haut zu machen. Erweitern Sie den Schnitt auf 1,5 bis zwei Zentimeter auf der linken Seite der Maus.Und verwenden Sie Zangen, um die Muskelschicht zu heben. Verwenden Sie eine Schere, um die Muskelschicht längs zu öffnen, den Schnitt nach Bedarf zu verlängern, um die Niere freizulegen, und greifen Sie vorsichtig das Fettgewebe, das die Niere umgibt. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Ein- bis zwei Millimeter Schnitt am hinteren Ende der Nierenkapsel zu machen und setzen Sie den vorbelasteten Trokar langsam parallel zur langen Achse der Niere in den Schnitt ein.Lassen Sie das Gewebe zwischen Nierenkapsel und Niere frei und bringen Sie die Niere und den Darm in ihre normale Position zurück. Verwenden Sie dann Nähte, um die Muskelschicht und chirurgische Klammern zu schließen, um die Haut zu schließen. Legen Sie die Maus in einen autoklavierten Mikroisolatorkäfig mit Überwachung bis zur vollen Recumbumanz.Sechs Stunden nach der Operation die Mäuse unter eine Wärmelampe stellen und die Schwänze mit 70% Isopropanol desinfizieren. Injizieren Sie 1,5 bis fünf Mal 10-zu-die-fünf CD34-positive menschliche fetale Lebergewebe isoliert hämopoetischen Stammzellen in 200 Mikroliter PBS in eine erweiterte Schwanzvene pro Tier. Dann stoppen Sie alle Blutungen mit sanftem Druck und bringen Sie die Mäuse in ihren heimischen Käfig zurück.Neun bis 12 Wochen nach der Operation verwenden Sie eine entsprechend große Kunststoffkamm-Rückhalteeinrichtung, um ein Bein einer humanisierten Maus zu isolieren, und sprühen Sie die mediale Seite des isolierten Beins mit 70% Isopropanol. Verbreiten Sie Antibiotika und schmerzlindernde Salbe auf die Sammelstelle. Mit einer 25-Spur-Nadel in einem 90-Grad-Winkel, punktieren Sie die saphenous Vene, um 50 bis 100 Mikroliter Blut in einem EDTA-beschichteten Blutentnahmeröhrchen zu sammeln.Wenn ein geeignetes Blutvolumen erhalten wurde, drucke mit einem sterilen Stück Gaze auf die Stelle, um die Blutung zu stoppen, bevor die Maus in ihren Käfig zurückgebracht wird. Verwenden Sie dann die gesammelte periphere Blutprobe, um den Grad der rekonstitution der menschlichen Immunzellen durch Durchflusszytometrie mit Antikörpern gegen menschliche CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 und Maus-CD45 zu bewerten. Für die frische Fäkalienprobensammlung legen Sie einzelne autoklavierte Papiertüten in eine Dunstabzugshaube und legen Sie eine Maus in jede Tasche, bis jedes Tier entfände.Dann kehren Sie die Mäuse in ihren Käfig zurück und verwenden Sie sterile Zangen, um jede Fäkalienprobe in eine 1,5-Milliliter-Röhre pro Maus für minus 80 Grad Celsius Lagerung zu übertragen. Am Ende der 14-tägigen Antibiotikabehandlung das Trinkwasser in autoklavisiertes sterilisiertes Wasser umstellen und die Mäuse in einen neuen autoklaven Käfig geben. 24 und 48 Stunden nach Beendigung der Antibiotika tauen ordnungsgemäß vorbereitete Quellen von fäkalem Mikrobiota-Transplantationsmaterial auf und aliquotieren die Proben in einer anaeroben Kammer unter anaeroben Bedingungen.Um eine Fäkaltransplantation durchzuführen, liefern Sie 200 Mikroliter fäkales Mikrobiota-Transplantationsmaterial per Oral-Gavage an jedes Versuchstier und verteilen Sie das verbleibende aufgetaute Material auf dem Fell von humanisierten Mäusen oder auf die Käfigbetten. Hier wird ein Beispiel für die Durchflusszytometrieanalyse von peripherem Blut aus einer humanisierten BLT-Maus 10 Wochen nach der Operation gezeigt. T- und B-Zellpopulationen können sowohl identifiziert als auch CD4- und CD8-positive T-Zellen-Teilmengen identifiziert werden.In diesem Diagramm kann die relative Häufigkeit der menschlichen Fäkalienspenderproben beobachtet werden, die verwendet werden, um ein Darmmikrobiom zu übertragen, um doppelt humanisierte Mäuse zu erstellen. Die phänotytypischen Veränderungen der Milz und des Cecums, die durch antibiotika-Behandlung induziert werden, ähneln denen, die bei keimfreien Tieren beobachtet werden. Diese Hauptkomponentenanalyse-Diagramm der repräsentativen 16S ribosomale RNA-Sequenzierung Daten zeigt, dass doppel humanisierte Mäuse haben humanähnliche Darmmikrobiome, die einzigartig für die menschliche Spenderprobe sind.Der kritischste Aspekt dieses Protokolls ist es, die Einführung unerwünschter Bakterien zu begrenzen, um sicherzustellen, dass die Mäuse gesund bleiben und das menschliche Darmmikrobiom erhalten. Dieses Modell hat das Potenzial, die personalisierte Medizin voranzubringen und uns zu ermöglichen, zu sehen, wie menschliche Krankheiten das Darmmikrobiom beeinflussen, während wir andere mildernde Faktoren kontrollieren.

a-double-humanized-blt-mice-model-featuring-stable-human-like-gut

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die Generierung und Charakterisierung von Tumor-spezifischen T-Zellen mit humanisierten Mäusen wird hier beschrieben. Menschliche Thymus-Gewebe und gentechnisch veränderten humanen hämatopoetischen Stammzellen in immungeschwächten Mäusen transplantiert. Hierdurch ergibt sich der Rekonstitution eines konstruierten menschliche Immunsystem so zur in vivo-Untersuchung von Anti-Tumor-Immunantwort.

Mit der BLT humanisierte Maus als Stem Cell based Gene Therapy Tumormodell

Dieses Video demonstriert die Methode zur Erzeugung einer doppelt humanisierten Knochen-BLT-Maus (Mark, Leber und Thymus) mit einem funktionierenden menschlichen Immunsystem und einem stabilen transplantierten menschenähnlichen Darmmikrobiom.

Generierung eines doppelt humanisierten BLT-Mausmodells (Knochenmark, Leber, Thymus)

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Generierung eines dualen humanisierten Mausmodells mit einem menschlichen Immunsystem und Leberzellen. Dabei werden menschliche Leberzellen und hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen durch intrasplenische Injektion in eine transgene immundefiziente Maus transplantiert, was zur Transplantation von Leberzellen und zur Entwicklung menschlicher Immunzellen führt.

Entwicklung eines humanisierten Mausmodells mit menschlichen Leberzellen und Immunzellen

Neisseria meningitidis ist ein Menschen bestimmten Erreger infiziert, die Blutgefäße. In diesem Protokoll menschlichen Mikrogefäße werden durch Pfropfen von der menschlichen Haut auf immungeschwächten Mäusen in eine Maus vorgestellt. Bakterien haften umfassend für die menschlichen Gefäße, was zu Gefäßschäden und die Entwicklung der Purpura typischerweise in menschlichen Fälle beobachtet.

Humanisierten Maus-Modell, um bakterielle Infektionen Studieren Targeting der Mikrogefäß

Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Konstruktion eines humanisierten Knochenmark-/Leber-/Thymus-Mausmodells mit stammzellbasierter künstlicher Immunität gegen HIV-Infektionen.

Stammzellen Basierend Engineered Immunität gegen HIV-Infektion in der humanisierten Maus-Modell

Dieses Protokoll stellt eine Methode zum humanisierten Mäuse (Hu-NSG) schaffen über intrahepatischen Injektion von humanen hämatopoetischen Stammzellen in Strahlung bedingt neonatale NSG Mäuse. Die Hu-NSG-Maus ist anfällig für HIV-Infektion und kombinatorische antiretrovirale Therapie (cART) und dient als ein geeignetes pathophysiologischen Modell für HIV-Replikation und Latenz-Untersuchungen.

Humanisierten NOD/SCID/IL2rγnull (Hu-NSG) Maus-Modell für HIV-Replikation und Latenz-Studien

Hier werden drei experimentelle Ansätze beschrieben, um die Dynamik der HIV-Infektion bei humanisierten Mäusen zu untersuchen. Die erste erlaubt die Untersuchung chronischer Infektionsereignisse, während letztere die Untersuchung akuter Ereignisse nach primärer Infektion oder viraler Reaktivierung ermöglicht.

Chronische, akute und reaktivierte HIV-Infektion in humanisierten immundefizienten Mausmodellen

Wir haben ein Protokoll zur Generierung und Bewertung eines humanisierten und humanen, mit Immundefizienz virusinfizierten NOG-Mausmodells entwickelt, das auf Stammzelltransplantation, intravaginaler exposition menschlicher Immundefizienzviren und Tropfen-Digital-PCR-RNA basiert. Quantifizierung.

Humanisierte NOG-Mäuse für intravaginale HIV-Exposition und Behandlung von HIV-Infektionen

neuroHuMiX ist ein fortschrittliches Gut-on-a-Chip-Modell zur Untersuchung der Interaktionen von bakteriellen, epithelialen und neuronalen Zellen unter proximalen und repräsentativen Co-Kulturbedingungen. Dieses Modell ermöglicht es, die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, die der Kommunikation zwischen dem Darmmikrobiom und dem Nervensystem zugrunde liegen.

Ein Gut-on-a-Chip-Modell zur Untersuchung der Achse Darmmikrobiom und Nervensystem

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Mäusen mit menschlichem Immunsystem (KIS) für immunonkologische Studien. Anweisungen und Überlegungen zur Verwendung dieses Modells zum Testen von humanen Immuntherapeutika an menschlichen Tumoren, die in dieses Modell implantiert wurden, werden vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf der Charakterisierung der Reaktion des menschlichen Immunsystems auf den Tumor liegt.

Erprobung von Krebsimmuntherapeutika in einem humanisierten Mausmodell mit menschlichen Tumoren

Erfahren Sie die Erzeugung doppelt humanisierter BLT-Mäuse mit funktionalem menschlichem Immunsystem und stabilen humanähnlichen Darmmikrobiom. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Modelle ohne keimfreie Bedingungen für immunologische und mikrobiombezogene Forschung.

Ein doppelt humanisiertes BLT-Mäuse-Modell mit einem stabilen humanähnlichen Gut-Mikrobiom und menschlichem Immunsystem

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