Elektrophysiologische Aufnahmen von einzelzelligen Ionenströmen unter genau definiertem Scherspannung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine modifizierte parallele Plattendurchflusskammer für die Untersuchung der Echtzeitaktivierung von mechanosensitiven Ionenkanälen durch Scherspannung zu beschreiben.

Die Verwendung der modifizierten parallelen Plattendurchflusskammer kann Forschern helfen, schlüsselrelevante Fragen zu beantworten, die sich auf die funktionelle Reaktion mechanosensitiver Ionenkanäle auf Scherspannung beziehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, aktivierte Ionenkanäle in einer leicht zu montierenden, wiederverwendbaren parallelen Plattendurchflusskammer in Echtzeit zu übertragen. Um das Verfahren zu beginnen, wenden Sie eine dünne Schicht von Silikon-Elastomer-Lösung um die Ränder des rechteckigen Raumes des Stückes C, und legen Sie vorsichtig das rechteckige Deckglas, Stück D, direkt auf die Elastomerlösung, um den offenen rechteckigen Raum des Stücks C vollständig zu bedecken.

Wiederholen Sie dann das Verfahren zum Festhalten des rechteckigen Abdeckglases, Stück F, an der Unterseite des Stückes E und lassen Sie die Silikonelastomerlösung über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. Nun montieren Sie die MPP-Flusskammer, indem Sie jedes Stück sequenziell auf die vorherige platzieren, beginnend mit der unteren Kammer, Stück E, dann Stück C, Stück B, gefolgt von Stück A auf der Oberseite. Als nächstes richten Sie die Schraublöcher jedes Stücks an den Ecken aus und schrauben die Teile fest zusammen, um Leckagen zu verhindern, während der Durchfluss in die MPP-Durchflusskammer verabreicht wird.

In einer Sechs-Brunnen-Platte legen Sie vier bis fünf, 12 Millimeter Abdeckung Glaskreise in jedem Brunnen. Speichern Sie die Zellen zwischen 10% und 30%konfluency, so dass einzelne Zellen für elektrophysiologische Aufnahmen zugegriffen werden können. Anschließend inkubieren Sie die Zellen unter Standardkulturbedingungen für nicht weniger als zwei Stunden, damit zellen haftet werden, und nicht mehr als 24 Stunden, da Endothelzellen flach und schwer zu patchen werden, wenn sie länger als 24 Stunden bei Subkonfluenz gesät werden.

Als nächstes entfernen Sie ein Deckglas mit den aufhaftenden Zellen aus einem Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte und spülen Sie schnell in PBS. Dann übertragen Sie das Deckglas mit Zellen auf eine 35 Millimeter Petrischale, die zwei Milliliter elektrophysiologische BAF-Lösung enthält. Übertragen Sie das Deckglas mit Zellen sofort in die MPP-Durchflusskammer.

Übertragen Sie den Deckelglaskreis auf das rechteckige Deckglas, Stück D, das auf Stück C der MPP-Durchflusskammer haftet. Fügen Sie die BAF-Lösung hinzu, um den Deckglaskreis und die Zellen vollständig zu untertauchen. Anschließend positionieren Sie den Deckelglaskreis auf Stück D so, dass die Zellen im Einklang mit den Schlitzöffnungen des Stücks B sind. Stellen Sie sicher, dass der Abdeckungsglaskreis durch Lösungsglashaftung an Stück D haftet, um eine Störung der Position des Abdeckungsglaskreises durch die Strömungsanwendung zu vermeiden.

Montieren Sie dann die MPP-Durchflusskammer, indem Sie die Teile in der entsprechenden Reihenfolge zusammenschrauben. Übertragen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe und durchdringen Sie die Kammer sofort mit BAF-Lösung. Als nächstes identifizieren Sie eine gesunde Zelle mit einem dunklen Rand und einem offensichtlichen Kern für das Experiment.

Vermeiden Sie Zellen, die zu bluben scheinen, oder Zellen, die mit anderen Zellen in Kontakt stehen. Um die Scherspannung zu steuern, richten Sie ein Schwerkraft-Perfusionssystem ein, indem Sie einen 30-Milliliter-Spritzenzylinder an ein Drei-Wege-Luer-Schloss mit Mikrobohrrohr anschließen. Als nächstes befestigen Sie den abgestuften Zylinder mit doppelseitigem Klebeband am Faraday-Käfig, der das Elektrophysiologie-Rig umgibt.

Vor dem Einsetzen der Schläuche in die MPP-Kammer, füllen Sie die Spritze und Schläuche mit BAF-Lösung. Legen Sie dann die Schläuche in das MPP-Flusskammer-Einlassloch des Stücks A.Pre-fill der MPP-Durchflusskammer mit Lösung, so dass sie im Vakuumbehälter entfernt wird. Stoppen Sie den Fluss in die Kammer und füllen Sie den abgestuften Zylinder bis zur Obersten Marke auf.

Berechnen Sie den Durchfluss manuell mit einer Stoppuhr, indem Sie die Lösung in einer bestimmten Spritzenzylinderhöhe durch die Kammer fließen lassen. Heben oder senken Sie die Spritze, um den Durchfluss zu ändern, und berechnen Sie die Scherspannung in einer parallelen Kammer mit dieser Gleichung. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis ein gewünschtes Maß an Scherspannung gefunden wird.

Anschließend wird eine montierte Kammer mit haftenden Zellen in die Mikroskopstufe des Elektrophysiologie-Rigs übertragen. Und legen Sie die mit BAF-Lösung vorgefüllten Schläuche in das Loch des Stückes A ein. Dann füllen Sie die Kammer und waschen Sie die Zellen gleichzeitig mit 10 Milliliter BAF-Lösung. Sobald die gewünschte Patchkonfiguration erfolgreich erreicht ist, lassen Sie die Kanalströme in einem statischen Bad bei Raumtemperatur stabilisieren.

Sobald sich die Ströme stabilisiert haben, tragen Sie die Scherung schrittweise auf, so dass sich der erhöhte Strom vor dem nächsten Schritt der Scherspannung stabilisiert. Entfernen Sie die Scherexposition gegenüber den Zellen, indem Sie den Fluss in die Kammer stoppen, sodass mechanosensitive Kanalströme zu den im statischen Bad beobachteten Basisströmen zurückkehren können. Hier ist eine repräsentative Rohaufzeichnung des Kirstroms aus einer primären mausmesenterischen Endothelzelle mit bemerkenswertem linearen Austrittsstrom zu sehen.

Eine Rampe von negativen 140 bis positiven 40 Millivolt wurde auf den Patch über 400 Millisekunden angewendet. Leckstrom verhindert die Analyse der realen Kir-Kanalaktivität. Um Leckstrom zu subtrahieren, berechnen Sie zunächst die lineare Neigungsleitfähigkeit des Leckstroms.

Mehrere G-Neigung durch entsprechende Spannungen der gesamten Rohspur, um Leckstrom auf den Rohdaten zu zeichnen. Die Linie sollte das nach außen gerichtete lineare Leck genau überlagern. Dann subtrahieren Sie den geplotteten Leckstrom von der gesamten Spur, so dass der lineare Außenstrom etwa null Picoampere pro Picofarad beträgt und der reale Kir-Strom analysiert werden kann.

Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist, das Deckglas in der Kammer richtig zu positionieren, so dass Zellen für Experimente zugänglich sind. Achten Sie außerdem darauf, dass der Abdeckschlupf angemessen an Stück D haftet, so dass der Flüssigkeitsfluss das Abdeckungsglas, das Zellen enthält, nicht stört.