Name: Elektrophysiologische Aufnahmen von einzelzelligen Ionenströmen unter genau definiertem Scherspannung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Lernen Sie elektrophysiologische Aufnahmen von mechanosensitiven Ionenkanälen unter definiertem Scherspannung. Diese Methode ermöglicht Echtzeituntersuchungen zellulärer Reaktionen auf mechanische Reize in der Neurowissenschaft.

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Diese Arbeit wurde vom National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL073965, IL) und (T32 HL007829-24, ISF) finanziert. Die Autoren möchten auch den Scientific Machine Shop an der University of Illinois in Chicago für die Generierung unserer neuesten MPP-Flusskammern würdigen.

Die Verwendung von Tieren in unseren Studien ist von der University of Illinois at Chicago Animal Care Committee (#16-183) zugelassen.
1. Montage der modifizierten Parallelplattendurchflusskammer
HINWEIS: Siehe Tabelle 1 und Abbildung 1 für MPP-Flusskammerstück-IDs. In Abbildung 1 finden Sie einen Schaltplan, in dem die Ausrichtung von Kammerstücken für die Montage detailliert beschrieben wird.
<ol><li>Um das rechteckige Abdeckglas, Stück D, an der Unterseite des Stücks C zu befestigen, stellen Sie zunächst die Silikonelastomerlösung her, indem Sie 500 l Silikonelastomer-Härtungsmittel gründlich in 5 ml Silikonelastomerbasis mischen.</li>
	<li>Tragen Sie eine dünne Schicht der Silikonelastomerlösung um die Ränder des rechteckigen Raumes des Stücks C auf und legen Sie das rechteckige Abdeckglasstück D vorsichtig direkt auf die Elastomerlösung, so dass Stück D den offenen rechteckigen Raum des Stücks C vollständig abdeckt. Überschüssige Silikonelastomerlösung vorsichtig wegwischen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 1.2 zum Festhalten des rechteckigen Abdeckglases, Stück F, an der Unterseite des Stücks E und lassen Sie die Silikonelastomerlösung über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. HINWEIS: Nach dem Aushärten bleibt das rechteckige Abdeckglas bis zu sechs Monate haften, bevor es ausgetauscht werden muss.</li>
	<li>Beginnend mit dem unteren Kammerstück, Stück E, montieren Sie die MPP-Durchflusskammer, indem Sie jedes Stück sequenziell auf das vorherige in der folgenden Reihenfolge platzieren: Stück E (unten), Stück C, Stück B, Stück A (oben).</li>
	<li>Richten Sie die Schraublöcher jedes Stücks an den Ecken aus und schrauben Sie die Teile fest zusammen, um Leckagen während der Verabreichung des Durchflusses an die MPP-Durchflusskammer zu verhindern.</li>
</ol>2. Zellvorbereitung und Aussaat in die MPP-Durchflusskammer
HINWEIS: Befolgen Sie die Schritte 2.1-2.7 für kultivierte Endothelzellen. Befolgen Sie die in den Schritten 2.8-2.14 beschriebene Methode zur Isolierung von Endothelzellen aus der mesenterischen Arterienpassage der Maus und zur Herstellung frisch isolierter Endothelzellen.
<ol><li>In einer 6-Well-Platte vier bis fünf 12 mm Abdeckung Glaskreise/Brunnen und Samenzellen zwischen 10% und 30% Konfluenz, so dass einzelne Zellen für elektrophysiologische Aufnahmen zugänglich sind.</li>
	<li>Inkubieren Sie Zellen unter Standardkulturbedingungen (5%CO2, 37 °C) für nicht weniger als 2 h, damit Zellen haften können, und nicht mehr als 24 h als Endothelzellen in der Erfahrung der Autoren werden sehr flach und schwer zu patchen, wenn sie bei Subkonfluenz für mehr als 24 h.</li>
	<li>Ein Deckglas mit aufhaftenden Zellen aus einem Brunnen der 6-Well-Platte entfernen, schnell in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) abspülen und vor der Übertragung in den MPP-Fluss in eine 35 mm Petrischale mit 2 ml elektrophysiologischer Badlösung (Tabelle2) übertragen kammer.</li>
	<li>Übertragen Sie den Abdeckungglaskreis auf das rechteckige Deckglas, Stück D, das auf Stück C der MPP-Durchflusskammer haftet, da sicher ist, dass eine ausreichende Lösung auf dem Deckglas bleibt, damit die Zellen nicht der Luft ausgesetzt werden. Fügen Sie den Zellen die gewünschte Badlösung (ca. 250 l) hinzu, so dass der Deckelglaskreis und die Zellen vollständig in Lösung eingetaucht sind.</li>
	<li>Positionieren Sie den Abdeckungsglaskreis so, dass er in der Hälfte am nächsten an der Vakuumbehälterseite liegt, so dass die Zellen mit den Schlitzöffnungen des Stücks B in Einklang stehen. Stellen Sie sicher, dass der Glasabdeckungskreis durch Lösungsglashaftung am Stück D haftet, so dass die durch fluss in die Kammer stört nicht die Position des Abdeckungglaskreises.</li>
	<li>Montieren Sie die MPP-Durchflusskammer, indem Sie die Teile in der entsprechenden Reihenfolge zusammenschrauben, wie in den Schritten 1.4 und 1.5 beschrieben und wie in Abbildung 1dargestellt. Übertragen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe und durchdringen Sie die Kammer sofort mit einer Badlösung, so dass die Lösung das Vakuumreservoir für die Aspiration erreicht (ca. 10 ml).</li>
	<li>Identifizieren Sie eine gesunde Zelle für das Experiment, indem Sie eine Zelle mit einem dunklen Rand und einem offensichtlichen Kern identifizieren. Vermeiden Sie Zellen, die zu bleichen scheinen, oder Zellen, die mit anderen Zellen in Kontakt stehen. HINWEIS: Im Labor der Autoren werden menschliche Aorten-Endothelzellen und primäre mausmesenterische Endothelzellen in der Kultur verwendet. Jedoch, jede andere Art von AnhängerZelle, die für spezifische Forschungsbedürfnisse von Interesse ist, kann auf die gleiche Weise verwendet werden.</li>
	<li>Waschen Sie die isolierte arterielle Arkade in Dissoziationslösung (Tabelle 2). Übertragen Sie die Arkade in ein 2 ml Zentrifugenrohr mit 2 ml vorgewärmter (37 °C) Dissoziationslösung (Rezept für Dissoziationslösung in Tabelle 2) mit neutraler Protease (0,5 mg/ml) und Elastase (0,5 mg/ml). 1 h bei 37 °C mit sanftem Schütteln alle 10 min inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie 1 ml der neutralen Protease/Elastase-Dissoziationslösung und fügen Sie 1 mg/ml Kollagennase Typ 1 hinzu. Geben Sie die Kollagenaselösung für eine endgültige Kollagenase-Typ-1-Konzentration von 0,5 mg/ml an die Lösung zurück, die die Arterien enthält. Inkubieren Sie für 2 x 3 min bei 37 °C.</li>
	<li>Mit 5 Grad Zangen bewegen Sie die Arkade schnell auf eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 mm, die einen 750 L Tropfen frischer, gekühlter Dissoziationslösung enthält. Weitere Dissoziation des Gewebes durch die Verwendung von zwei 20 G Spritzennadeln, um endotheliale Zellen mechanisch aus enzymatisch verdauten Arterien zu befreien.</li>
	<li>Mit einer 9" Einweg-Pasteur-Glaspipette trituieren Sie die Zelllösung 10x, bevor Sie die Zellen mit der Glaspipette in ein neues 1,5 ml Zentrifugenrohr übertragen.</li>
	<li>Waschen Sie die Petrischale mit weiteren 750 L Dissoziationslösung und übertragen Sie sie in ein und dasselbe Rohr. Mit der Glaspipette, weiter mechanisch dispergieren die Zellen durch Pipettierung mindestens 10x, um eine einzellige Suspension zu schaffen, die darauf achtet, keine Blasen einzuführen, die die Integrität der Endothelzellen beschädigen können.</li>
	<li>Fügen Sie 750 l der Endothelzellsuspension (500 bis 1.000 Zellen) direkt in Stück D der MPP-Durchflusskammer auf der Hälfte, die der Vakuumseite des Reservoirs am nächsten ist, hinzu. Lassen Sie die Endothelzellen zwischen 45 min und 1 h bei Raumtemperatur haften.</li>
	<li>Montieren Sie die MPP-Durchflusskammer, indem Sie die Teile in der in den Schritten 1.4 und 1.5 beschriebenen Reihenfolge zusammenschrauben, wie in Abbildung 1dargestellt. Übertragen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe und durchdringen Sie die Kammer sofort mit einer Badlösung, so dass die Lösung die Vakuumaspiration erreicht (ca. 10 ml). Identifizieren Sie zugängliche Endothelzellen anhand ihres rauen und runden Phänotyps19,20. HINWEIS: Eine Vielzahl von Verdauungsmethoden und Enzymcocktails wurden verwendet, um Endothelzellen aus verschiedenen arteriellen Betten zu isolieren. Siehe Tabelle 3 für detaillierte Beschreibungen von Protokollen, die von einer Vielzahl von Forschern verwendet wurden, um Endothelzellen für die Patchklemmenelektrophysiologie von mechanosensitiven Ionenkanälen zu isolieren. Diese Methoden sind wahrscheinlich für den Einsatz in Kombination mit der MPP-Durchflusskammer geeignet.</li>
</ol>3. Steuerung der Scherspannung zur MPP-Durchflusskammer für elektrophysiologische Aufnahmen von scheraktivierten mechanosensitiven Ionenkanälen
<ol><li>Einrichtung eines Schwerkraft-Perfusionssystems durch Anschluss eines 30 ml abgestuften Spritzenzylinders an ein 3-Wege-Luer-Schloss mit Mikrobohrrohr (Innendurchmesser: 0,05 Zoll, Außendurchmesser: 0,09 Zoll) zum Einsetzen in das 3 mm Durchmesser eingelassene Einlassloch des Stücks A des MPP kammer.</li>
	<li>Befestigen Sie den abgestuften Zylinder mit doppelseitigem Klebeband an der Außenseite des Faraday-Käfigs, der das Elektrophysiologie-Rig umgibt (Abbildung 2). Vor dem Einsetzen der Schläuche in die MPP-Kammer die Spritze und die Schläuche mit Badlösung vorfüllen (siehe Tabelle 2 für Badlösung zur Untersuchung der inneren Rektifikierung von K+ Kanälen in Endothelzellen). Setzen Sie die Schläuche in das MPP-Flusskammer-Einlassloch von Stück A ein.</li>
	<li>Füllen Sie die MPP-Durchflusskammer mit einer Lösung vor, so dass die Lösung im Vakuumbehälter entfernt wird. Stoppen Sie den Fluss in die Kammer und füllen Sie den abgestuften Zylinder bis zur Bestmarke auf. Berechnen Sie die Durchflussraten manuell, indem Sie die Lösung durch die Kammer fließen lassen und mit einer Stoppuhr ml/s bei einer bestimmten Spritzenzylinderhöhe berechnen.</li>
	<li>Heben oder senken Sie die Spritze, um den Durchfluss zu verändern, und scheren Sie so in der Kammer, und setzen Sie diesen Prozess fort, bis ein gewünschtes Maß an Scherspannung gefunden wird.</li>
	<li>Berechnen Sie die Scherspannung in einer parallelen Kammer mit der folgenden Gleichung21: • = 6 x Q/h2w wobei die Flüssigkeitsviskosität (g/cms), Q = Durchflussrate (ml/s) und die breite der parallelen Plattenkammer (b = 2,2 cm) und die Höhe (h = 0,1 cm) HINWEIS: Im aktuellen Schwerkraft-Perfusionssystem beträgt der Durchfluss bei einer Spritzenzylinderhöhe (gemessen von der Oberseite des Zylinders) von 57 cm über der Mikroskopstufe 0,3 ml/s. Die in der Kammer berechnete Scherung bei dieser Spritzenzylinderhöhe und Durchflussrate beträgt 0,7 dyn/cm2. Es sollte auch beachtet werden, dass andere Perfusionssysteme, wie eine peristaltische Pumpe, verwendet werden können, um den Durchfluss zur MPP-Durchflusskammer zu steuern. Diese Geräte können jedoch unerwünschte Turbulenzen und Einflussstabilität der elektrophysiologischen Messungen unter Strömung hinzufügen, daher wird mit dem hier beschriebenen Schwerkraftperfusionssystem empfohlen.</li>
	<li>Eine montierte Kammer mit haftenden Zellen auf die Mikroskopstufe des Elektrophysiologie-Rigs übertragen und die mit Badlösung vorgefüllten Schläuche in das Loch des Stücks A einlegen. Gleichzeitig die Kammer füllen und die Zellen mit 10 ml Badlösung durch Drehen des 3-Wege-Luerschlosses so, dass die Lösung in die Kammer fließt.</li>
	<li>Sobald die gewünschte Patch-Konfiguration erfolgreich erreicht ist, können kanalströmen in einem statischen Bad bei Raumtemperatur stabilisiert werden. Sobald sich die Ströme stabilisiert haben, tragen Sie die Scherung schrittweise auf, so dass sich die Erhöhung des Stroms vor dem nächsten Schritt der Erhöhung der Scherspannung stabilisiert. HINWEIS: Die Autoren finden den größten Erfolg mit der perforierten Patch-Konfiguration beim Studium mechanoaktivierter Ionenkanäle in Endothelzellen. Um perforierte Ganzzell-Patchkonfigurationen durchzuführen, fügen Sie 5 l einer 60 mg/ml-Lageramphotericin B in Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 1 ml 0,2 m sterilgefilterte Pipettenlösung hinzu. Nach der Erzeugung einer Giga-Ohm-Dichtung in der zellgebundenen Konfiguration bilden sich perforierte Ganzzell-Patches innerhalb von 2 x 5 min.</li>
	<li>Entfernen Sie die Scherexposition gegenüber den Zellen, indem Sie den Fluss in die Kammer stoppen, sodass mechanosensitive Kanalströme zu den im statischen Bad beobachteten Basisströmen zurückkehren können.</li>
	<li>Isolieren Sie mechanosensitive Ionenkanalströme von Interesse, indem Sie die Lösungsvalenz (z.B. 60 mM K+ in Badlösung mit 0 Ca2+ in Pipettenlösung zur inneren Korrektur von K+-Kanälen) verändern. Tabelle 2 zeigt Beispiellösungsrezepte) und/oder pharmakologische Hemmung potenziell kontaminierender Stromquellen.</li>
</ol>

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<li>Ueba, H., Kawakami, M., Yaginuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+as+an+inhibitor+of+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation.+Role+of+transforming+growth+factor-beta+1+and+tissue-type+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress as an inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Role of transforming growth factor-beta 1 and tissue-type plasminogen activator.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1512-1516 (1997).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das Gefäßsystem ist ständig aktiven hämodynamischen Kräften ausgesetzt, die mechanosensitive Ionenkanäle3,22 aktivieren, aber die physiologischen Rollen dieser Kanäle in der Scherstress-induzierten Mechanotransduktion sind nur 4,6,8. Die Mechanismen, die für die Mechanosensitivität von scherenspannungsaktivierten Kanälen verantwortlich sind, bleiben unbekannt. Das hier b...

Hämodynamische Kräfte, die durch den Blutfluss erzeugt werden, sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle in der endothelialen und vaskulären Funktion1,2zu spielen. Es ist auch bekannt, dass mehrere Arten von Ionenkanälen akut auf Veränderungen der Scherspannung3,4,5 reagieren, was zu der Hypothese führt, dass Ionenkanäle primäre Scherspannungssensoren sein können. In jüngerer Zeit haben wir und andere gezeigt, dass mechanosensitive Ionenkanäle in mehreren scher-stressempfindlichen Gefäßfunktionen eine entscheidende Rolle spielen, einschließlich der vasoaktiven Reaktion auf Scherstress6,7,8 und Entwicklungsangiogenese9. Die Mechanismen der Scher-Stress-Empfindlichkeit von Ionenkanälen sind jedoch fast völlig unbekannt. Diese Wissenslücke ist wahrscheinlich auf die technische Schwierigkeit zurückzuführen, elektrophysiologische Aufnahmen unter genau definierter Scherspannung durchzuführen. In diesem Artikel bieten wir daher ein Schritt für Schritt detailliertes Protokoll routinemäßig in unserem Labor durchgeführt, um dieses Ziel zu erreichen6,7,10,11.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Echtzeit-Untersuchung der Ionenkanal-Mechanoaktivierung unter genau definiertem Scherstress im physiologischen Bereich zu ermöglichen. Dies wird erreicht, indem eine Standard-Parallelplattendurchflusskammer so geändert wird, dass eine elektrophysiologische Pipette in die Kammer abgesenkt und Zugangszellen, die während der Echtzeit-Exposition zum Durchfluss auf der Bodenplatte angebaut werden, abgesenkt werden können, was einen einzigartigen Ansatz bietet, dies zu erreichen. Tor6,7,11. Im Gegensatz dazu können Standard-Parallelplattendurchflusskammern, die in früheren Veröffentlichungen beschrieben wurden, für die Echtzeit-Bildgebungsanalyse von Zellen verwendet werden, die Scherkräften12 oder anderen nicht-invasiven Ansätzen13,14 Elektrophysiologie. In ähnlicher Weise ist der Kegel- und Plattenapparat, ein weiterer starker Ansatz, um Zellen Scherspannung15,16 auszusetzen, auch nicht für elektrophysiologische Aufnahmen geeignet. Somit erlauben diese Durchflussgeräte keine Untersuchung der Scherspannungsempfindlichkeit von Ionenkanälen. Die Schwierigkeit bei der Durchführung elektrophysiologischer Aufnahmen unter Fließen ist der Hauptgrund für die Mangel an Informationen über die Mechanismen, die für diese entscheidenden Effekte verantwortlich sind.
In Bezug auf die alternativen Ansätze, um das gleiche Ziel zu erreichen, gibt es keine, die so genau oder kontrolliert sind. Einige frühere Studien versuchten, die Ionenkanalaktivität unter dem Durchfluss aufzuzeichnen, indem zellen einem Flüssigkeitsstrom aus einer anderen Pipette aus einer anderen Pipette aus der Nähe einer Zelle von oben17,18aussetzten. Dies ist sehr nicht-physiologisch, da die unter diesen Bedingungen erzeugten mechanischen Kräfte wenig mit den physiologischen Profilen von Scherstress in den Blutgefäßen gemein haben. Ähnliche Bedenken gelten für die Versuche, physiologische Scherspannung durch Durchblutung offener Kammern zu simulieren. Wie in unserer früheren Studie10ausführlich erläutert, erzeugt eine offene Flüssigkeits-Luft-Schnittstelle mehrere Störungen und Dierezirkulation, die nicht-physiologisch sind. Um all diese Bedenken auszuräumen, haben wir in unseren früheren Studien6,7,10,11, eine modifizierte Parallelplatte (MPP) Strömungskammer entworfen, die auch als "minimal-invasives Durchflussgerät" bezeichnet wird. aus Acryl und ausgiebig in unserem Labor verwendet. Trotz der Tatsache, dass die ursprüngliche Beschreibung des Designs vor fast 20 Jahren veröffentlicht wurde und das einzige Strömungsgerät ist, das die Durchführung elektrophysiologischer Aufnahmen unter genau definierter Scherspannung ermöglicht, wurde diese Methode nicht von anderen Labors angenommen und es gibt nur sehr wenige Studien, die versuchen, Ströme unter Fluss zu erfassen. Wir glauben daher, dass die Bereitstellung einer detaillierten Beschreibung für die Verwendung der MPP-Flusskammer eine große Hilfe für Forschungen sein wird, die sich für mechanosensitive Ionenkanäle und Gefäßbiologie interessieren.

<table><tbody><tr><td>0,2 &Mikro; m sterile Spritzenvorsatzfilter</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Wird zum Filtrieren von elektrophysiologischer Pipettenlösung</td></tr><tr><td>5-Grad-Pinzetten verwendet</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>1252-30</td><td>Wird zum Übertragen von verdauten Arterien in eine frische Lösung</td></tr><tr><td>verwendet 9" Pasteur Pipet</td><td>Fisher Scientifc</td><td>13-678-20D</td><td>Wird zum mechanischen Aufbrechen verdauter Arterien und zum Übertragen frisch isolierter endohtelialer Zellen verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>Deckglaskreise mit einem Durchmesser von 12 mm</td><td>Fisher Scientifc</td><td>12-545-80</td><td>Zur Verwendung bei Studien mit kultivierten Zellen und mehreren Behandlungen. Die auf das Deckglas geklebten Zellen werden für Patch-Clamp-Analysen verwendet</td></tr>: <tr><td>24 mm x 40 mm Rectangluar Deckglas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS2975224</td><td>Deckglas zum Hinzufügen zu MPP-Durchflusskammerstücken C (Abbildung 1)</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm Rechteckiges Deckglas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS2975245</td><td>Deckglas zum Hinzufügen zum MPP-Durchflussraum E (Abbildung 1)</td></tr><tr><td>20 G Spritzennadeln</td><td>Becton Dickinson und Co</td><td>305175</td><td>Zur Verwendung bei der mechanischen Disruption von verdauten Mesenterialarterien</td></tr><tr><td>35 mm Petrischale</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Zur Verwendung bei der mechanischen Disruption von verdauten Mesenterialarterien</td></tr><tr><td>Amphotericin B solubilisiert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9528-50MG</td><td>Wird zur Erzeugung der perforierten Ganzzell-Patch-Konfiguration verwendet.</td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>100 mg - LS004194</td><td>Enzym, das in unserem Labor als kurzer Aufschluss nach dem ersten Cocktail aus neutraler Protease und Elastase verwendet</td></tr><tr><td>wird Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher Scientifc</td><td>67-68-5</td><td>Lösungsmittel für Amphotericin B, das in perforierten Ganzzell-Patch-Clamps verwendet</td></tr><tr><td>wird Elastase, lyophilisiert</td><td>Worthington Biochemical</td><td>25 mg - LS002290&nbsp;</td><td>Enzym, das in unserem Labor in einem Cocktail mit neutraler Protease/Dispase verwendet wird, um die Verdauung der Arterien für die Isolierung von Endothelzellen zu beginnen.</td></tr><tr><td>Falcon Gewebekulturplatte, 6-Well, flacher Boden mit Deckel mit geringer Verdunstung&nbsp;</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>Zur Verwendung mit Studien mit kultivierten Zellen und mehreren Behandlungen</td></tr><tr><td>Neutrale Protease/Dispase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>10 mg- LS02100 50 mg - LS02104</td><td>Enzym, das in unserem Labor in einem Cocktail mit Elastase verwendet wird, um die Verdauung von Arterien für die Isolierung von Endothelzellen zu beginnen</td></tr><tr><td>SylGard&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Silikonelastomer zum Verkleben des rechteckigen Deckglases mit den MPP-Durchflusskammerstücken C und E (Abbildung 1)</td></tr><tr><td>Tygon ND 10-80 Schlauch</td><td>Microbore Schlauch</td><td>AAQ04133</td><td>ID: 0,05 Zoll, Außendurchmesser: 0,09 Zoll, Einlassperfusionsschlauch zur Verwaltung des Durchflusses zur Kammer</td></tr></tbody></table>

elektrophysiologische aufnahmen von einzelzelligen ionenströmen unter genau definiertem scherspannung

Electrophysiological Recordings of Single-cell Ion Currents Under Well-defined Shear Stress

Flüssigkeitsscherspannung ist bekannt, eine wichtige Rolle in der endothelialen Funktion zu spielen. In den meisten Gefäßbetten löst ein erhöhter Scherstress durch akute Nukzesserhöhungen eine Signalkaskade aus, was zu vasodilatation führt und dadurch die mechanische Belastung der Gefäßwand lindert. Das Muster der Scherspannung ist auch bekannt als ein kritischer Faktor bei der Entwicklung von Arteriosklerose mit laminaren Scherstress atheroprotective und gestörtscher Stress pro-atherogen. Während wir ein detailliertes Verständnis der verschiedenen Zwischenzellsignalwege haben, werden die Rezeptoren, die zuerst den mechanischen Stimulus in chemische Mediatoren übersetzen, nicht vollständig verstanden. Mechanosensitive Ionenkanäle sind entscheidend für die Reaktion auf die Scherung und regulieren die scherinduzierte Zellsignalisierung und steuern so die Produktion von vasoaktiven Mediatoren. Diese Kanäle gehören zu den frühesten aktivierten Signalkomponenten zum Scheren und wurden durch Förderung der Stickstoffmonoxidproduktion mit der scherinduzierten Vasodilatation in Verbindung gebracht (z.B. nach innen korrigierende K+ [Kir] und transientes Rezeptorpotential [TRP] Kanäle) und Endothel-Hyperpolarisierungsfaktor (z. B. Kir- und Calcium-aktivierte K+ [KCa]-Kanäle) und scherinduzierte Vasokonstriktion durch einen unbestimmten Mechanismus, der Piezokanäle umfasst. Das Verständnis des biophysikalischen Mechanismus, durch den diese Kanäle durch Scherkräfte (d. h. direkt oder durch einen primären Mechano-Rezeptor) aktiviert werden, könnte potenzielle neue Ziele zur Lösung der pathophysiologie im Zusammenhang mit endotheliaaler Dysfunktion bieten. und Atherogenese. Es ist immer noch eine große Herausforderung, die strömungsinduzierte Aktivierung von Ionenkanälen in Echtzeit mittels Elektrophysiologie aufzuzeichnen. Die Standardmethoden zur Belichtung von Zellen gegenüber klar definierter Scherspannung, wie dem Kegel- und Plattenrheometer und der geschlossenen parallelen Plattendurchflusskammer, erlauben keine Echtzeituntersuchung der Ionenkanalaktivierung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine modifizierte parallele Plattendurchflusskammer zu beschreiben, die eine elektrophysiologische Echtzeitaufzeichnung mechanosensitiver Ionenkanäle unter genau definierter Scherspannung ermöglicht.

In Abbildung 1sind mehrere Fotografien mit unterschiedlichen Ansichten der MPP-Flusskammer auf der Mikroskopbühne (oberes Panel) und einer schematischen Darstellung der MPP-Durchflusskammer (untere Wandgruppe) dargestellt. Der Schaltplan beschreibt die Abmessungen des gesamten Gerätes und der Durchflusskammer. Abbildung 2 zeigt ein Foto des Schwerkraftperfusionssystems zur MPP-Durchflusskammer in unserem Labor (Obere Platte). Gez...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine modifizierte parallele Plattendurchflusskammer für die Untersuchung der Echtzeitaktivierung von mechanosensitiven Ionenkanälen durch Scherspannung zu beschreiben.

Elektrophysiologische Aufnahmen von einzelzelligen Ionenströmen unter genau definiertem Scherspannung

Fluid shear stress is well known to play a major role in endothelial function. In most vascular beds, elevated shear stress from acute increases in blood ...

Die Verwendung der modifizierten parallelen Plattendurchflusskammer kann Forschern helfen, schlüsselrelevante Fragen zu beantworten, die sich auf die funktionelle Reaktion mechanosensitiver Ionenkanäle auf Scherspannung beziehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, aktivierte Ionenkanäle in einer leicht zu montierenden, wiederverwendbaren parallelen Plattendurchflusskammer in Echtzeit zu übertragen. Um das Verfahren zu beginnen, wenden Sie eine dünne Schicht von Silikon-Elastomer-Lösung um die Ränder des rechteckigen Raumes des Stückes C, und legen Sie vorsichtig das rechteckige Deckglas, Stück D, direkt auf die Elastomerlösung, um den offenen rechteckigen Raum des Stücks C vollständig zu bedecken.Wiederholen Sie dann das Verfahren zum Festhalten des rechteckigen Abdeckglases, Stück F, an der Unterseite des Stückes E und lassen Sie die Silikonelastomerlösung über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. Nun montieren Sie die MPP-Flusskammer, indem Sie jedes Stück sequenziell auf die vorherige platzieren, beginnend mit der unteren Kammer, Stück E, dann Stück C, Stück B, gefolgt von Stück A auf der Oberseite. Als nächstes richten Sie die Schraublöcher jedes Stücks an den Ecken aus und schrauben die Teile fest zusammen, um Leckagen zu verhindern, während der Durchfluss in die MPP-Durchflusskammer verabreicht wird.In einer Sechs-Brunnen-Platte legen Sie vier bis fünf, 12 Millimeter Abdeckung Glaskreise in jedem Brunnen. Speichern Sie die Zellen zwischen 10% und 30%konfluency, so dass einzelne Zellen für elektrophysiologische Aufnahmen zugegriffen werden können. Anschließend inkubieren Sie die Zellen unter Standardkulturbedingungen für nicht weniger als zwei Stunden, damit zellen haftet werden, und nicht mehr als 24 Stunden, da Endothelzellen flach und schwer zu patchen werden, wenn sie länger als 24 Stunden bei Subkonfluenz gesät werden.Als nächstes entfernen Sie ein Deckglas mit den aufhaftenden Zellen aus einem Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte und spülen Sie schnell in PBS. Dann übertragen Sie das Deckglas mit Zellen auf eine 35 Millimeter Petrischale, die zwei Milliliter elektrophysiologische BAF-Lösung enthält. Übertragen Sie das Deckglas mit Zellen sofort in die MPP-Durchflusskammer.Übertragen Sie den Deckelglaskreis auf das rechteckige Deckglas, Stück D, das auf Stück C der MPP-Durchflusskammer haftet. Fügen Sie die BAF-Lösung hinzu, um den Deckglaskreis und die Zellen vollständig zu untertauchen. Anschließend positionieren Sie den Deckelglaskreis auf Stück D so, dass die Zellen im Einklang mit den Schlitzöffnungen des Stücks B sind. Stellen Sie sicher, dass der Abdeckungsglaskreis durch Lösungsglashaftung an Stück D haftet, um eine Störung der Position des Abdeckungsglaskreises durch die Strömungsanwendung zu vermeiden.Montieren Sie dann die MPP-Durchflusskammer, indem Sie die Teile in der entsprechenden Reihenfolge zusammenschrauben. Übertragen Sie die Kammer auf die Mikroskopstufe und durchdringen Sie die Kammer sofort mit BAF-Lösung. Als nächstes identifizieren Sie eine gesunde Zelle mit einem dunklen Rand und einem offensichtlichen Kern für das Experiment.Vermeiden Sie Zellen, die zu bluben scheinen, oder Zellen, die mit anderen Zellen in Kontakt stehen. Um die Scherspannung zu steuern, richten Sie ein Schwerkraft-Perfusionssystem ein, indem Sie einen 30-Milliliter-Spritzenzylinder an ein Drei-Wege-Luer-Schloss mit Mikrobohrrohr anschließen. Als nächstes befestigen Sie den abgestuften Zylinder mit doppelseitigem Klebeband am Faraday-Käfig, der das Elektrophysiologie-Rig umgibt.Vor dem Einsetzen der Schläuche in die MPP-Kammer, füllen Sie die Spritze und Schläuche mit BAF-Lösung. Legen Sie dann die Schläuche in das MPP-Flusskammer-Einlassloch des Stücks A.Pre-fill der MPP-Durchflusskammer mit Lösung, so dass sie im Vakuumbehälter entfernt wird. Stoppen Sie den Fluss in die Kammer und füllen Sie den abgestuften Zylinder bis zur Obersten Marke auf.Berechnen Sie den Durchfluss manuell mit einer Stoppuhr, indem Sie die Lösung in einer bestimmten Spritzenzylinderhöhe durch die Kammer fließen lassen. Heben oder senken Sie die Spritze, um den Durchfluss zu ändern, und berechnen Sie die Scherspannung in einer parallelen Kammer mit dieser Gleichung. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis ein gewünschtes Maß an Scherspannung gefunden wird.Anschließend wird eine montierte Kammer mit haftenden Zellen in die Mikroskopstufe des Elektrophysiologie-Rigs übertragen. Und legen Sie die mit BAF-Lösung vorgefüllten Schläuche in das Loch des Stückes A ein. Dann füllen Sie die Kammer und waschen Sie die Zellen gleichzeitig mit 10 Milliliter BAF-Lösung. Sobald die gewünschte Patchkonfiguration erfolgreich erreicht ist, lassen Sie die Kanalströme in einem statischen Bad bei Raumtemperatur stabilisieren.Sobald sich die Ströme stabilisiert haben, tragen Sie die Scherung schrittweise auf, so dass sich der erhöhte Strom vor dem nächsten Schritt der Scherspannung stabilisiert. Entfernen Sie die Scherexposition gegenüber den Zellen, indem Sie den Fluss in die Kammer stoppen, sodass mechanosensitive Kanalströme zu den im statischen Bad beobachteten Basisströmen zurückkehren können. Hier ist eine repräsentative Rohaufzeichnung des Kirstroms aus einer primären mausmesenterischen Endothelzelle mit bemerkenswertem linearen Austrittsstrom zu sehen.Eine Rampe von negativen 140 bis positiven 40 Millivolt wurde auf den Patch über 400 Millisekunden angewendet. Leckstrom verhindert die Analyse der realen Kir-Kanalaktivität. Um Leckstrom zu subtrahieren, berechnen Sie zunächst die lineare Neigungsleitfähigkeit des Leckstroms.Mehrere G-Neigung durch entsprechende Spannungen der gesamten Rohspur, um Leckstrom auf den Rohdaten zu zeichnen. Die Linie sollte das nach außen gerichtete lineare Leck genau überlagern. Dann subtrahieren Sie den geplotteten Leckstrom von der gesamten Spur, so dass der lineare Außenstrom etwa null Picoampere pro Picofarad beträgt und der reale Kir-Strom analysiert werden kann.Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist, das Deckglas in der Kammer richtig zu positionieren, so dass Zellen für Experimente zugänglich sind. Achten Sie außerdem darauf, dass der Abdeckschlupf angemessen an Stück D haftet, so dass der Flüssigkeitsfluss das Abdeckungsglas, das Zellen enthält, nicht stört.

electrophysiological-recordings-single-cell-ion-currents-under-well

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt den Prozess der whole-cell voltage clamp Aufnahmen in der Netzhaut Scheibe der aquatischen Tiger Salamander. Wir zeigen die Herstellung der Scheibe als auch, wie man Patch Clamp Messungen während visueller Stimulation der Netzhaut führen.

Ganzzellableitungen of Light evozierten exzitatorischen synaptischen Ströme in der Netzhaut Scheiben

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