Name: Analyse der Spliceosomalen snRNA-Lokalisierung in menschlichen Hela-Zellen mit Mikroinjektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Mikroinjektion fluoreszenzmarkierter snRNAs zur Analyse ihrer Lokalisation in Cajal-Körpern von HeLa-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung essenzieller RNA-Sequenzen für den zellulären Transport.

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Diese Arbeit wurde von der Tschechischen Wissenschaftsstiftung (18-10035S), dem Nationalen Nachhaltigkeitsprogramm I (LO1419), der institutionellen Unterstützung (RVO68378050), dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775) und der Karlsuniversität (GAUK 134516). Wir würdigen ferner die Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Prag, Tschechische Republik (unterstützt durch Stipendien (Czech-Bioimaging - LM2015062).

1. Herstellung von snRNAs für die Mikroinjektion
<ol><li>Erstellen Sie eine DNA-Vorlage mit der abendfüllenden oder abgeschnittenen/mutierten Version von snRNA by PCR unter Verwendung eines folgenden PCR-Setups: 98 °C für 60 s, 98 °C für 15 s, 68 °C für 30 s, 72 °C für 1 min, 98 °C für 15 s für 35x und 72 °C für 5 min.</li>
	<li>Die Vorwärtsgrundierung muss eine Promotorsequenz für die In-vitro-Transkription vor dem ersten transkribierten Nukleotid enthalten. Verstärken Sie die U2-SnRNA-Sequenz mit dem Vorwärtsprimer, der den T7-Promotor und den Reverse primer enthält, der mit dem letzten transkribierten Nukleotid endet (Details siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Synthesize snRNA mit einem Kit für kurze RNA-Synthese (siehe Tabelle der Materialien für Details), die T7-RNA-Polymerase enthalten. 1 mM ATP hinzufügen, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0,8 mM UTP, 0,2 mM UTP-Alexa488, 1,8 mM Trimethylguanosin-Kappe analog (m32,2,7G(5')ppp(5')G), 1 ml eines RNA-Inhibitors und 500-700 ng der DNA-Vorlage zum Reaktionsgemisch und inkubieren bei 37 °C über Nacht.</li>
	<li>Fügen Sie 1 L (2U) DNase in die Reaktion ein und brüten Sie weitere 15 min bei 37 °C.</li>
	<li>Isolieren Sie snRNA durch saure Phenol/Chloroform-Extraktion. Entfernen Sie die obere Wasserphase und fügen Sie 1/10 des ursprünglichen Volumens von 3 M Natriumacetat (pH = 5,2), 3 l Glykogen für eine bessere Pellet-Visualisierung und 2,5 Volumen von 100% Ethanol hinzu. 1 h bei -80 °C inkubieren, Zentrifuge 10 min bei 14.000 x g und 4 °C.</li>
	<li>Das Pellet mit 70% Ethanol waschen und in 12 l nukleasefreiem Wasser auflösen. Die übliche RNA-Ausbeute lag bei rund 600 ng/ml. Bei -80 °C lagern.</li>
	<li>Überwachen Sie die Integrität von in vitro transkribierten snRNAs durch Agarose-Gel-Elektrophoresen.</li>
	<li>Vor der Mikroinjektion die RNA auf die Endkonzentration 200 ng/ml in Wasser mit 10 g/l Dextran-TRITC 70 kDa verdünnen.</li>
</ol>2. Zellen
<ol><li>Vor der Verwendung die Deckellipsen mit 1 M HCl für 1 h behandeln, gründlich in destilliertem Wasser waschen und in 100% Ethanol lagern. Die saure Behandlung fördert die Zellhaftung, um das Zellpeeling während oder nach der Injektion zu verhindern. Um die injizierte Zellen leichter zu identifizieren, verwenden Sie einen Deckschein mit einem Raster.</li>
	<li>Seed HeLa oder andere anhantibe Zellen 1 Tag vor der Mikroinjektion auf 12 mm Abdeckungen (Nr. 1 oder Nr. 1.5), um 50% Konfluenz zum Zeitpunkt der Mikroinjektion zu erreichen.</li>
</ol>3. Injektion
HINWEIS: HeLa-Zellen wurden im modifizierten Eagle Medium des Dulbecco (D-MEM, 4,5 g/L D-Glucose mit Phenolrot und Antibiotika) mikroinjiziert. Die Injektion erfolgte mit einem Injektor und einem Mikromanipulator, der mit der sterilen Nadel ausgestattet war (Details siehe Materialtabelle). Das gesamte mikroskopische/mikromanipulatorische System wurde mindestens 4 h lang auf 37 °C vorgeheizt, um Schwankungen einzelner Teile des Mikroskops und des Mikroinjektors zu verhindern.
<ol><li>Die Petrischale (30 mm) mit 2 ml Kulturmedien mit dem Deckelin in der Mitte in den Halter des Mikroskops geben. Mit einem Mikrolader 3 l snRNA-Mischung in die Nadel geben. Setzen Sie die Nadel in den Halter des Mikroinjektors in 45° in Bezug auf die Oberfläche der Petrischale ein.</li>
	<li>Um die Nadel zu finden, verwenden Sie ein 10x Langstreckenobjektiv. Stellen Sie zunächst die Geschwindigkeit COARSE auf dem Injektor ein und senken Sie die Nadel, bis sie das Kulturmedium berührt. Finden Sie mit dem Mikroskop-Fernglas den hellen Fleck, der der Ort ist, an dem die Nadel das Kulturmedium berührt.</li>
	<li>Ändern Sie die Geschwindigkeit auf FINE und senken Sie die Nadel weiter, während Sie in das Mikroskop schauen, bis die Spitze der Nadel beobachtet wird. Bewegen Sie die Nadel in der Mitte des Gesichtsfeldes und wechseln Sie zu einem 40-fachen Langstreckenobjektiv.</li>
	<li>Nachdem Sie das Ziel geändert haben, wählen Sie die Zelle aus und bewegen Sie die Nadel über diese Zelle. Stellen Sie den Druck und die Zeit für den Zellkontakt ein (siehe Tipps und Fehlerbehebung im Gespräch).</li>
	<li>Bewegen Sie die Nadel nach unten in die Zelle und setzen Sie dann die untere Grenze für den Mikromanipulator. Achten Sie darauf, die Nadel nicht unter die Zelle zu bewegen.</li>
	<li>Nachdem Sie die untere Grenze gesetzt haben, bewegen Sie die Nadel wieder über die Zelle und drücken Sie die Injektionstaste am Joystick des Injektors. Die Nadel bewegt sich automatisch innerhalb der Zelle an die Stelle, an der die Grenze gesetzt wird, und injiziert das RNA-Gemisch.</li>
	<li>Um zu beenden, drücken Sie die Taste MENU auf dem Injektor und entfernen Sie die Nadel aus dem Halter. Trennen Sie dann das Rohr vom Injektor, bevor Sie den Injektor und den Mikromanipulator ausschalten.</li>
</ol>4. Zellfixierung und Färbung
<ol><li>Nach der Mikroinjektion die Zellen in einen CO2-Inkubator zurückgeben und bei 37 °C für 1 h inkubieren.</li>
	<li>Nach der Inkubation die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalinelösung (PBS) bei Raumtemperatur abspülen, 20 min mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PIPES pH 6.9 fixieren und dreimal mit Raumtemperatur PBS waschen. Wenn nur die snRNA-Lokalisierung analysiert wird, spülen Sie die Zellen kurz in Wasser aus und montieren Sie sie in einem Montagemedium mit DAPI.</li>
	<li>Im Falle einer zusätzlichen Proteinlokalisierung permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5% Triton-X100 in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Nach drei Spülungen mit PBS, inkubieren die Zellen mit primären und sekundären Antikörpern und nach dem letzten Spülen in PBS und kurz spülen in Wasser, in einem Montagemedium mit DAPI montieren.</li>
</ol>5. Mikroskopie
<ol><li>Wenn sie nicht unmittelbar nach der Montage abgebildet werden, lagern Sie die Dias bei 4 °C bis zur Bildgebung.</li>
	<li>Erfassen Sie Bilder mit einem hochwertigen fluoreszenzmikroskopischen System, das mit einem Tauchobjektiv (60X oder 100x/1.4NA) ausgestattet ist.</li>
	<li>Sobald mikroinjizierte Zellen identifiziert sind, sammeln Sie einen Stapel von 20 Z-Abschnitten mit 200 nm z Schritten pro Probe und unterliegen mathematischer Dekonvolution. Anschließend wurden maximale Projektionen oder einzelne z-Stacks vorgestellt.</li>
	<li>Um das fluoreszierende Signal zu quantifizieren, zeichnen Sie Region of Interest (ROI) um einen Cajal-Körper, der durch Coilin-Immunostaining identifiziert wurde. Messen Sie die Intensität des snRNA-Signals im coilindefinierten ROI. Als nächstes bestimmen Sie die Intensität der snRNA-Fluoreszenz im ROI zufällig im Nukleoplasma platziert und berechnen das Verhältnis des RNA-Signals im Cajal-Körper und Nukleoplasma.</li>
</ol>

<ol><li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li>
<li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li>
<li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+bodies%3A+news+insights+into+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curentr+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li>
<li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li>
<li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li>
<li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs%3A+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li>
<li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5%27-to-3%27+exonucleolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li>
<li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+U4%2FU6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir verwendeten Mikroinjektionen von fluoreszierend markierten snRNAs, um Sequenzen zu bestimmen, die für die snRNA-Lokalisierung in nuklearen Cajal-Körpern wichtig sind. Durch die schnelle und recht einfache Vorbereitung von markierten RNAs (Vorbereitung der DNA-Vorlage durch PCR gefolgt von In-vitro-Transkription) bietet die Methode eine effektive Analyse, wie verschiedene Sequenzen zur RNA-Lokalisierung beitragen. In relativ kurzer Zeit konnten wir zehn verschiedene Deletionen oder Substitutionen der U2 snRNA analysie...

DIE RNA-Spleißung ist einer der entscheidenden Schritte in der Genexpression, der durch einen großen Ribonukleoprotein-Komplex, das Spleceoom genannt wird, katalysiert wird. Insgesamt sind mehr als 150 Proteine und 5 kleine nukleare RNAs (snRNAs) in verschiedenen Stadien des Spleißwegs in das Spleißmittel integriert. U1, U2, U4, U5 und U6 snRNAs beteiligen sich an der Spleißung großer GU-AG-Introns. Diese snRNAs verbinden das Sifasam als vorgeformte kleine kernnukleare Ribonukleoproteinpartikel (snRNPs), die snRNA, sieben Sm-Proteine enthalten, die mit snRNA (oder Like-Sm-Proteinen, die mit der U6 snRNA assoziiert werden) und 1-12 Proteine, die für jeden snRNP spezifisch sind, assoziiert werden.
Die Montage von snRNPs umfasst zytoplasmatische und nukleare Stadien. Neu transkribierte snRNA wird in das Zytoplasma exportiert, wo sie einen Ring erhält, der aus sieben Sm-Proteinen zusammengesetzt ist. Der Sm-Ring dient anschließend als Signal für den snRNA-Re-Import zurück in den Kern. Defekte snRNAs, die sich nicht mit Sm-Proteinen verbinden, werden im Zytoplasma1beibehalten. Neu importierte snRNPs erscheinen zuerst im Cajal-Körper, wo sie auf snRNP-spezifische Proteine treffen und ihre Reifung beenden (in Referenz2,3). Wir haben vor kurzem gezeigt, dass die Hemmung der endgültigen Reifungsschritte zur Sequestrierung unreifer SnRNPs in Cajal-Körpern4,5führt. Wir haben ein Modell vorgeschlagen, bei dem die endgültige snRNP-Reifung unter Qualitätskontrolle steht, die die Zugabe von snRNP-spezifischen Proteinen und die Bildung aktiver snRNPs überwacht. Molekulare Details darüber, wie Zellen zwischen richtig zusammengesetzten reifen und aberranten unreifen Partikeln unterscheiden, bleiben jedoch schwer fassbar.
Um snRNA-Sequenzen zu bestimmen, die für die Ausrichtung und Akkumulation von snRNAs in nuklearen Cajal-Körpern unerlässlich sind, haben wir beschlossen, Mikroinjektionen von fluoreszierend markierten snRNAs einzusetzen. Microinjection war eine Methode der Wahl, weil: 1) es erfordert keine zusätzliche Sequenz-Tag, um synthetische snRNAs zu unterscheiden bilden ihre endogenen Gegenstücke, die besonders wichtig für kurze RNAs mit wenig Platz für das Einfügen von zusätzlichen Tag-Sequenz ist; 2) es ermöglicht die Analyse von Sequenzen, die für die Biogenese wichtig sind. Beispielsweise ist die Sm-Sequenz für die Sm-Ringmontage und den erneuten Import in den Kern6unerlässlich. Wenn snRNAs in der Zelle exprimiert werden, werden snRNAs, denen die Sm-Sequenz fehlt, im Zytoplasma abgebaut und erreichen nicht den Kern und die Cajal-Körper7. SnRNAs ohne die Sm-Sequenz können jedoch direkt in den Zellkern injiziert werden und somit eine mögliche Rolle der Sm-Sequenz in der Cajal-Körperlokalisierung sprossiert.
Hier beschreiben wir detailliert eine Mikroinjektionsmethode, die wir angewendet haben, um snRNA-Sequenzen zu bestimmen, die notwendig sind, um snRNAs in den Cajal-Körper5zu zielen. Wir haben gezeigt, dass Sm- und SMN-Bindungsstellen zusammen notwendig und ausreichend sind, um nicht nur snRNAs, sondern auch verschiedene kurze nicht-kodierende RNAs in den Cajal-Körper zu lokalisieren. Basierend auf Mikroinjektionen und anderen Beweisen schlugen wir vor, dass der auf der Sm-Bindungsstelle montierte Sm-Ring das Cajal-Körperlokalisierungssignal ist.

<table><tbody><tr><td>ChromaTide Alexa Fluor 488-5-UTP</td><td>ThermoFisher</td><td>C11403</td><td>Stammkonzentration 1 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium - hohe</td><td>Glukose Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>Enthält 4,5 g&frasl; L D-Glukose, Phenolrot und Antibiotika</td></tr><tr><td>FemtoJet Express Injektor</td><td>Eppendorf</td><td>5247000013</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td>Mikroinjektionsnadel von 0,5 &; Mikro; m innen und 0,7 &micro; m Außendurchmesser</td></tr><tr><td>Fluoromont G mit DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Glykogen</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9510</td><td>Stammkonzentration 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Gitterglas Deckgläser</td><td>Ibidi</td><td>10817</td><td>Deckgläser mit Gitter, keine direkte Erfahrung damit</td></tr><tr><td>InjectMan NI 2 Mikromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5181000017</td><td></td></tr><tr><td>m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethylierte Kappe Analogon</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-853-1</td><td>Stammkonzentration 40 mM</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 Transkriptionskit</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Deckglas 12 mm, Nr. 1</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>111520</td><td>Für Routinearbeiten</td></tr><tr><td>Mikroskop Deckglas 12 mm, Nr. 1,5</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>117520</td><td>Für hohe Bilder mit Auflösung</td></tr><tr><td>Mikroskop DeltaVision</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Für die Bilderfassung</td></tr><tr><td>Mikroskop DMI6000</td><td>Leica</td><td></td><td>Für Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 32% ige Lösung EM grade</td><td>EMS</td><td>15714</td><td>Gelöst in PIPES bis zur Endkonzentration 4</td></tr><tr><td>%Phenol:Chloroform 5:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Primer für die U2-Amplifikation: Vorwärts: 5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, Rückseite: 5&acute; TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>T7 rpromotor-Sequenz kursiv</td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA-Polymerase</td><td>BioLab</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>Stammkonzentration 40 mM</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat Dextran 65-85 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1162</td><td>In Wasser gelöst, Stammkonzentration 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Serva</td><td>37240</td><td>In Wasser gelöst, Stammkonzentration 10%</td></tr></tbody></table>

analyse der spliceosomalen snrna-lokalisierung in menschlichen hela-zellen mit mikroinjektion

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Die Biogenese von spliceosomalen snRNAs ist ein komplexer Prozess, der sowohl nukleare als auch zytoplasmatische Phasen einbezieht, und der letzte Schritt findet in einem nuklearen Kompartiment namens Cajal-Körper statt. Sequenzen, die eine direkte snRNA-Lokalisierung in diese subnukleare Struktur direkt machen, sind jedoch bis vor kurzem nicht bekannt. Um Sequenzen zu bestimmen, die für die Akkumulation von snRNAs in Cajal-Körpern wichtig sind, verwendeten wir mikroinjection von fluoreszierend markierten snRNAs, gefolgt von ihrer Lokalisierung in Zellen. Zuerst bereiteten wir snRNA-Deletionsmutanten, synthetisierte DNA-Vorlagen für die In-vitro-Transkription und transkribierte SnRNAs in Gegenwart von UTP in Verbindung mit Alexa488. Beschriftete snRNAs wurden mit 70 kDa-Dextran konjugiert mit TRITC gemischt und mikroinjiziert in den Kern oder das Zytoplasma menschlicher HeLa-Zellen. Die Zellen wurden für 1 h inkubiert und fixiert und das Cajal-Körpermarker-Spulen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz visualisiert, während SnRNAs und Dextran, die als Marker der nuklearen oder zytoplasmatischen Injektion dienen, direkt mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet wurden. Diese Methode ermöglicht effiziente und schnelle Tests, wie verschiedene Sequenzen die RNA-Lokalisierung in Zellen beeinflussen. Hier zeigen wir die Bedeutung der Sm-Bindungssequenz für die effiziente Lokalisierung von snRNAs in den Cajal-Körper.

Um die SnRNA-Lokalisierung und die Rolle der Sm-Bindungsstelle im Cajal-Körper-Targeting zu überwachen, haben wir eine DNA-Vorlage mit dem T7-Promotor und entweder der in voller Länge U2-SnRNA oder U2-SnRNA ohne die sieben Nukleotide (AUUUUUG) vorbereitet, die die Sm-Bindungsstelle bilden. snRNAs wurden in vitro transkribiert, isoliert und mit TRITC-gekoppeltem Dextran-70kDa gemischt. Wir haben das In-vitro-Transkribierte snRNA mikroinjiziert in den Zellkern oder das Zytoplasma von HeLa-Zellen.
<p class="jove_content...

Biogenese von spliceosomals snRNAs ist ein komplexer Prozess mit verschiedenen Zellkompartimenten. Hier haben wir Mikroinjektionen von fluoreszierend gekennzeichneten snRNAs eingesetzt, um deren Transport innerhalb der Zelle zu überwachen.

Analyse der Spliceosomalen snRNA-Lokalisierung in menschlichen Hela-Zellen mit Mikroinjektion

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

Hier haben wir Mikroinjektionen von fluoreszierend markierten RNAs eingesetzt, um RNA-Sequenzen zu detektieren, die für die Lokalisierung von kurzen nuklearen RNAs in nukleare Strukturen, cajal-Körper genannt, unerlässlich sind. Diese Technik hat zwei große Vorteile. Erstens kann es für kurze RNAs angewendet werden, die sonst schwer zu beschriften und zu verfolgen sind.Und zweitens ermöglicht es ein schnelles Screening verschiedener Sequenzen und das Testen ihrer Rolle bei der RNA-Lokalisierung. Einen Tag vor der Mikroinjektion, Samen HeLa oder andere haftende Zellen auf 12 Millimeter Abdeckungen, um 50% Konfluenz zum Zeitpunkt der Mikroinjektion zu erreichen. Legen Sie zunächst einen vorbereiteten Deckel in die Mitte einer Petrischale, fügen Sie Zellen und zwei Millimeter Kulturmedien hinzu.Am nächsten Tag die zellgefüllte Petrischale auf eine Mikroskopbühne legen. Mit einem Mikrolader drei Mikroliter der snRNA-Mischung in die Nadel laden und die Nadel in einem Winkel von 45 Grad in bezug auf die Oberfläche der Petrischale in den Halter des Mikroinjektors einbauen. Verwenden Sie ein 10-faches Fernziel, um die Nadel zu finden.Stellen Sie zunächst die Geschwindigkeit grob auf dem Injektor ein und senken Sie die Nadel, bis sie das Kulturmedium berührt. Finden Sie mit dem Mikroskop-Fernglas den hellen Fleck, an dem die Nadel das Kulturmedium berührt. Ändern Sie die Geschwindigkeit zu fein und weiter senken Sie die Nadel, während Sie in das Mikroskop schauen, bis die Spitze der Nadel beobachtet wird.Bewegen Sie die Nadel in der Mitte des Gesichtsfeldes und wechseln Sie zu einem 40-fachen Langstreckenobjektiv. Danach wählen Sie die Zelle aus und bewegen Sie die Nadel über die Zelle. Stellen Sie den Druck und die Zeit für den Zellkontakt ein.Bewegen Sie die Nadel nach unten in die Zelle und setzen Sie dann die untere Grenze des Mikromanipulators. Das Festlegen der unteren Grenze ist der kritischste Teil des Protokolls. Da die Deckbedeckungsoberfläche nicht perfekt ist und jede Zelle anders ist, müssen Sie die untere Grenze während der Injektionssitzung mehrmals festlegen.Als nächstes bewegen Sie die Nadel wieder über die Zelle und drücken Sie die Injektionstaste auf dem Joystick des Injektors. Die Nadel bewegt sich automatisch innerhalb der Zelle an die Stelle, an der die Grenze festgelegt ist, um das RNA-Gemisch zu injizieren. Zum Abschluss drücken Sie die Menütaste am Injektor und entfernen Sie die Nadel aus dem Halter.Trennen Sie dann das Rohr vom Injektor, bevor Sie den Injektor und den Mikromanipulator ausschalten. Nach der Mikroinjektion die Zellen in einen Kohlendioxid-Inkubator zurückbringen und bei 37 Grad Celsius für eine Stunde brüten. Als nächstes spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS bei Raumtemperatur ab.Fixieren Sie die Zellen für 20 Minuten mit 4%Paraformaldehyd in 0,1 Molarenrohren bei pH 6,9. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit Raumtemperatur PBS. Wenn nur die snRNA-Lokalisierung analysiert wird, spülen Sie die Zellen kurz in Wasser aus und montieren Sie sie in einem Montagemedium mit DAPI.Im Falle einer zusätzlichen Proteinlokalisierung, permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,5%Triton X-100 in PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS und färben Sie sie mit den entsprechenden primären und sekundären Antikörpern, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann dreimal mit PBS abspülen und einmal in Wasser abspülen.Montieren Sie die Zellen anschließend in einem Montagemedium mit DAPI. Wenn Sie bildbereit sind, verwenden Sie ein high-End Fluoreszenzmikroskopisch-System mit einem Tauchobjektiv, um die Bilder zu erfassen. Sobald die mikroinjizierten Zellen identifiziert sind, sammeln Sie einen Stapel von 20 Z Abschnitten mit 200 Nanometer Z Schritten pro Probe und unterliegen mathematischer Dekonvolution.Um das fluoreszierende Signal zu quantifizieren, öffnen Sie zuerst das Mikroskopiebild in ImageJ und teilen Sie Kanäle in Fenster auf. Synchronisieren Sie Fenster mit dem Werkzeug "Synchronisieren des Fensters". Als nächstes zeichnen Sie die Region des Interesses um einen Cajal-Körper, der durch Coilin-Immunostaining identifiziert wird.Messen Sie die Intensität des snRNA-Signals im coilindefinierten ROI. Bestimmen Sie die Intensität der snRNA-Fluoreszenz im ROI, die zufällig im Nukleoplasma platziert wird. Speichern Sie Messwerte und berechnen Sie das Verhältnis des RNA-Signals im Cajal-Körper und Nukleoplasma.In dieser Studie werden fluoreszierend markierte snRNAs mikroinjiziert, um ihren Transport innerhalb der Zelle zu überwachen. Um zu testen, ob die SM-Site für die Akkumulation des Cajal-Körpers wichtig ist, wird snRNA, der die SM-Site fehlt, direkt in den Kern mikroinjiziert. Die Injektion in das Zytoplasma dient als Kontrolle, während snRNA in voller Länge mikroinjiziert wird, um als positive Kontrolle zu dienen.Nach der Inkubation werden mikroinjizierte Zellen fixiert und das Cajal-Körpermarker-Spulen durch indirekte Immunfluoreszenz visualisiert. Die volle SnRNA in Cajal Körpern nach nuklearen und zytoplasmatischen Injektionen angesammelt. Im Gegensatz dazu blieb snRNA ohne sM-Site nach der Mikroinjektion in dieses Fach im Zytoplasma, während die kerntechnische Mikroinjektion von snRNA ohne die SM-Site zeigt, dass die SM-Bindungssequenz für die Lokalisierung des Cajal-Körpers wichtig ist, da diese snRNA im Kern verbleibt, sich aber nicht in Cajal-Körpern ansammelt.Manchmal scheitert die Mikroinjektion in nur ein Zellfach und ausgetrickste Dextran 70 Kilodalton findet sich sowohl im Kern als auch im Zytoplasma. Diese Zellen werden aus der weiteren Analyse verworfen. Trotz der Tatsache, dass die fluoreszierend markierten snRNAs vor der Injektion bei negativen 80 Grad Celsius gespeichert werden, kann es zu einem RNA-Abbau kommen.Degradierte snRNA, die in das Zytoplasma injiziert wird, wird nicht in den Zellkern transportiert und bleibt im Zytoplasma lokalisiert. Solche snRNA sollte verworfen und neue snRNA synthetisiert werden. Es ist wichtig, die Injektions- und Ausgleichsdrücke für Ihren Zelltyp richtig einzustellen.Und wie bereits gesagt, ist die Einstellung der richtigen Untergrenze für die Zellinjektion für eine gute Mikroinjektion unerlässlich. Bitte beachten Sie, dass das bei der RNA-Isolation verwendete Phenol-Chloroform gefährlich ist und dass die Mikroinjektionsnadel ein scharfes Objekt ist. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit diesen Materialien.

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RNA in situ Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Visualisierung von RNAs in Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie die Kombination von RNAscope ISH mit immunhistochemischer oder histologischer Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden kann, um mRNAs, die an Axonen lokalisiert sind, in Schnitten des Gehirns von Mäusen und Menschen zu detektieren.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

Eine in Situ Hybridisierung (ISH) Protokoll, die kurze antisense Oligonukleotide verwendet, um alternative Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitte erkennen wird beschrieben.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Hier beschreiben wir einen in Situ Hybridisierung Test sensitiver und spezifischer Nachweis von Sequenzen so kurz wie 50 Nukleotide mit Einzel-Nukleotid-Auflösung auf die einzelne Zelle Ebene ermöglicht. Assays, die manuell oder automatisch ausgeführt werden kann, kann Visualisierung von Splice-Varianten, kurze Sequenzen und Mutationen im Zusammenhang mit Gewebe ermöglichen.

Visualisierung von genetischen Varianten, kurze Ziele und Punktmutationen in Zusammenhang mit morphologischen Gewebe mit einem RNA In Situ Hybridisierung Assay

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte erforderlich, um ein Modellsystem, in dem die Transkription des endogenen Gens von Interesse bedingt gesteuert werden kann, in lebenden Tieren oder Zellen mit verstärkten Lac Repressor und/oder Tet Aktivator Systeme generieren.

In-vivo Anwendung der REMOTE-Steuerung für die Manipulation von endogenen Genexpression

Um die Zahl der mRNAs in einzelnen Eizellen, einzelnes Molekül RNA Fluoreszenz in-situ reproduzierbar zu zählen war Hybridisierung (RNA-Fisch) für nicht-anhaftende Zellen optimiert. Eizellen wurden gesammelt, mit der Abschrift spezifische Sonden hybridisiert und quantifiziert, mit einem Bild Quantifizierung Software.

Verwendung von einzelnen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SM-Fisch), Quantify und Localize mRNAs in murinen Eizellen

Dieses Protokoll stellt ein schnelles und nützliches Werkzeug zur Bewertung der Rolle eines Proteins mit uncharakterisierter Funktion bei der alternativen Spleißregulation nach chemotherapeutischer Behandlung dar.

Verwendung des E1A Minigene Tools zur Untersuchung von mRNA-Spleißänderungen

Dieses Protokoll beschreibt einen Minigene-Reporter-Assay zur Überwachung der Auswirkungen von 5'-Spleißstellenmutationen auf das Spleißen und entwickelt Suppressor U1 snRNA zur Rettung der mutationsinduzierten Spleißhemmung. Die Reporter- und Suppressor-U1-snRNA-Konstrukte werden in HeLa-Zellen exprimiert, und das Spleißen wird durch Primer-Extension oder RT-PCR analysiert.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte, inputarme Probenvorbereitung für die Einzelkernsequenzierung, einschließlich der Dissektion von Maus-Superior-Cervix- und Sternganglien, Zelldissoziation, Kryokonservierung, Nukleusisolierung und Hashtag-Barcoding.

Low-Input-Nukleus-Isolierung und Multiplexing mit Barcode-Antikörpern sympathischer Mausganglien für die Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung

Erfahren Sie die Mikroinjektion fluoreszenzmarkierter snRNAs zur Analyse ihrer Lokalisation in Cajal-Körpern von HeLa-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung essenzieller RNA-Sequenzen für den zellulären Transport.

Analyse der Spliceosomalen snRNA-Lokalisierung in menschlichen Hela-Zellen mit Mikroinjektion

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