Name: Reinigung von Plateletten aus dem Mausblut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Reinigung von Thrombozyten aus Mausblut mittels Iohexol-Gradientenzentrifugation. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Aktivierung und Aggregation für Studien zur Thrombozytenbiologie.

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Diese Arbeit wurde durch eine Start-up-Finanzierung der Cincinnati Children es Research Foundation und ein Stipendium der Universität von Cincinnati Pilot Translational Granate an M.N. Wir danken dem Cincinnati Children es Hospital Research Flow Cytometry Core für seine Dienste.

Die Blutentnahme von Maus sollte mit entsprechender institutioneller Tierpflege und Zustimmung des Ausschusses durchgeführt werden.
NOTE: Das Platelet-Reinigungsprotokoll wird in einem Strömungsdiagramm in Abbildung1 beschrieben.
1. Sammlung von Blut
<ol><li>25 μL von 3,2% Natriumcitrat (pH 7,2) als Anti-Gerinnungsmittel und 0,4 mM Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) in ein Polypropylen-Rohr geben.</li>
	<li>
Sammeln Sie etwa 200 μL Blut aus der C57BL/6-Maus mit Retro-Orbital-Blutungen. Hinweis: Blut kann von jeder Art von Maus-Stamm gesammelt werden, unabhängig von Alter oder Geschlecht.<ol>
<li>Verwenden Sie 2 mL Isoofluran in jeder Art von Kammer, um die Maus zu betäuben. NOTE: Die Tiefe der Anästhesie wird durch Anzeichen einer erhöhten Atmung und verminderter Bewegung überprüft. Die Maus sollte nicht auf die Bewegung der Anästhesie-Kammer oder auf die Behandlung reagieren. Wenn die Maus auf Bewegung oder Handhabung reagiert, dann braucht es mehr Zeit, um in der Anästhesiekammer zu halten.</li>
		<li>1.2.2 Öffnen Sie entweder das rechte oder das linke Augenlid der Maus und legen Sie ein 7,5 cm großes Kapillarrohr in den Gefäßplexus des Auges.</li>
		<li>Drehen Sie das Kapillarrohr eine halbe Drehung, während Sie Druck auf das Kapillarrohr ausüben, um die Gefäße zu brechen und den Blutfluss zu beginnen. Halten Sie das Tier über die Sammelvial auf den Kopf, um durch Kapillarwirkung gefüllt zu werden.</li>
		<li>Sobald das entsprechende Blutvolumen gesammelt ist, das Kapillarrohr entfernen und das Auge schließen, indem Sie 30 s auf das Augenlid mit Gaze drücken. Sobald die Blutung gestoppt ist, bringe die Maus in ihren Käfig zurück und kontrolliere sie für die Blutung.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Augen auf Traumata 1-2 Tage nach Retro-Orbital-Blutungen. Entfernen Sie jede Maus aus der Studie, die Anzeichen von signifikanten Traumata auf das Auge als Folge des Eingriffs und Euthanierung. NOTE: Die Maus sollte sich keiner Behandlung unterziehen, die Blutplättchen für mindestens zwei Wochen vor der Blutentnahme hemmen kann. Die Blutprobe muss für die Blutreinigung innerhalb einer Stunde nach Blutung der Maus verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Platelet Purifizierung
NOTE: Die Platelet-Reinigung sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um deren Abbau zu verhindern. Achten Sie darauf, dass die Temperatur der Reagenzien und Instrumente zwischen 18 und 22 ° C liegt. Um einen Platzabbau zu verhindern, sollte während des Eingriffs ein schnelles Pipettieren und kräftiges Schütteln vermieden werden.
<ol><li>600 μL Iohexol-Gradientenmittel (12% Iohexol-Pulver in 0,85% Natriumchlorid, 5 mM Tricine, pH 7.2) 11 in ein 1,5 mL Rohr geben.</li>
	<li>200 μL Blutprobe langsam auf die Seite des Rohres auf dem Gradientenmedium mit einer breiten Bohrpfeifenspitze hinzufügen, damit sich Blut und Iohexol-Medium nicht vermischen (Abbildung 2A).</li>
	<li>Zentrifuge die Probe mit Schlauch bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C in einem schwingenden Eimer-Rotor mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung.</li>
	<li>Sammeln Sie den größten Teil der platelettreichen Schicht und einen kleinen Bruchteil der platelet-armen Schicht (insgesamt 300 bis 400 μL) mit einer breiten Bohrpfeifenspitze, ohne die RBC und WBC-Schichten zu stören (Abbildung 2B). Übertragen Sie die Plattenprobe auf ein neues Rohr. NOTE: Liegt die Plattenzählung weniger im Blut oder wird ein kleineres Blutvolumen verwendet, kann die plateletarreiche Schicht und die platelettarme Schicht als eine einzige Schicht gesehen werden.</li>
	<li>In einem schwingenden Eimer-Rotor 1 mL PBS in die Platelet-Probe geben, durch Umkehrung und Zentrifuge bei 800 x g für 10 min bei 20 ° C vermischen. Die Lösung komplett ablegen und 200 μL PBS hinzufügen, um die Platten mit mildem Pipettieren wiederzubeleben. NOTE: Dieser Schritt ist optional, da er das Gradientenmedium und Plasma-Proteine entfernt und die Empfindlichkeit von Blutplättchen gegenüber Agonisten wie Thrombin erhöht. Da verschiedene Zentrifugen unterschiedliche Programme haben, kann die langsame Beschleunigung/Verlangsamung durch das Lesen der Bedienungsanleitung der Zentrifuge bestimmt werden.</li>
	<li>Übertragen Sie 30 μL dieser Probe in ein neues Rohr, um Platten zu zählen. Die restlichen Blutplättchen können für biochemische und physiologische Untersuchungen wie Plateletaktivierung, Aggregation, Granulatfreigabe usw. verwendet werden.</li>
	<li>Für die RNA oder Proteinextraktion die Blutplättprobe bei 800 x g für 10 min zentrifugen, um die Blutplättchen zu pülen. Verfall supernatant ganz, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie das gewünschte Volumen von RNA oder Protein-Lysis Puffer hinzu, um die Blutplättchen zu lysern.</li>
</ol>3. Zählung der Platelets
<ol><li>Zählen Sie die ganzen Blutkörperchen ohne Verdünnung und gereinigten Blutplättchen (verdünnt 2 bis 5-fach mit PBS) mit einem automatisierten Zellanalysator. Verwenden Sie 30 bis 50 μL-Proben zum Zählen.</li>
	<li>Berechnen Sie die Gesamtzahl der Blutplättchen, indem Sie sich mit dem Volumen der Probe multiplizieren.</li>
	<li>Berechnen Sie den Anteil der Erträge von gereinigten Blutplättchen.</li>
	<li>Zählen Sie die RBC und WBC in der gereinigten Plattenprobe (verdünnt 50 bis 100-fach mit PBS) mit einem Hämozytometer und Mikroskop.</li>
</ol>4. Platelet-Aktivierung
<ol><li>In einem Rohr 1 bis 2 Millionen gereinigte Blutplättchen in bis zu 100 μL Färbepuffer (PBS mit 2% fetalem Rinderserum, FBS).</li>
	<li>Für eine mehrfache Anzahl von Proben, machen Sie eine Master-Mischung von Antikörpern mit 1 μL (0,5 mg/mL) der folgenden: PE-Cy7 Ratte Anti-Maus TER 119, PE Ratte Anti-Maus CD45, FITC Ratte Anti-Maus-CD41, und APC Ratte anti-mouse/human CD62P (P-selectin) zu erkennen RBC, WBC, Blutplättchen, und Aktivierte Plateletten. Fügen Sie den Master-Mix in die Rohre, um die Zellen zu färben. Thrombin nicht hinzufügen.</li>
	<li>In einem anderen Rohr 1 bis 2 Millionen gereinigte Blutplättchen in bis zu 100 μL Färbepuffer und 0,4 mM GPRP Peptid hinzufügen. Thrombin hinzufügen, um die Blutplättchen zu aktivieren und die Zellen nach Schritt 4.2 zu verfärben. NOTE: GPRP sollte der Probe hinzugefügt werden, bevor Thrombin hinzugefügt wird, um Aggregate oder Kleingebildung durch Plattenaktivierung zu verhindern. Die Thrombin-Konzentration sollte optimiert werden, um eine gute Aktivierung der Blutplättchen zu erreichen. Nach der Aktivierung des Plattenplatzes werden die Ereigniszahlen bei der Erfassung von Proben durch Strömungszytometrie verringert.</li>
	<li>Als positive Kontrolle 1 μL Vollblut in bis zu 100 μL Färbepuffer in einem Rohr und 0,4 mM GPRP Peptid hinzufügen. Thrombin hinzufügen, um die Platelets zu aktivieren. Als negative Kontrolle 1 μL Vollblut in bis zu 100 μL Färbepuffer hinzufügen. Geben Sie Thrombin nicht in negative Kontrollprobe. Verlassen Sie die Zellen nach Schritt 4.2.</li>
	<li>Für die Strömungszytometrie isotype Steuerung, Etikett 5 Rohre mit unbefleckt, PE-Cy7, PE, FITC, und APC. Fügen Sie 100 μL Färbepuffer, 1 μL Blut und 1 μL des jeweiligen Antikörpers zu den beschrifteten Röhren hinzu, um die Zellen zu verfärben.</li>
	<li>Inkubieren Sie Proben, um bei Raumtemperatur im Dunkeln 30 Minuten lang zu flecken.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben, indem Sie 1 mL Färbepuffer zu jedem Rohr hinzufügen. Zentrifuge bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Den Färbepuffer vorsichtig ablegen, ohne das Pellet zu entleeren.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Rohr 300 μL Fleckenpuffer hinzu, mischen Sie milde und übertragen Sie auf ein FACS-Rohr. Die gebeizten Proben im Dunkeln aufbewahren, bis sie mit einem Strömungszytometer analysiert sind.</li>
</ol>5. Flow Cytometry Analysen von Platelets
<ol><li>
Erstellen Sie ein neues Experiment und generieren Sie Log-Forward-Streuung vs Log-seitige Streuplots und weisen Sie Tore für Ter119 PE-Cy7 (RBC), CD45 PE (WBC), CD41 FITC (Blutungen) und CD62P APC (aktivierte Platelets) Populationen nach der Gating-Strategie für die Experimentieren Sie in der FACS DIVA Software.
	<ol>
<li>Öffnen Sie die Bevölkerungshierarchie, indem Sie die Bevölkerungshierarchie unter der Registerkarte Populationen wählen. Bearbeiten Sie die Populationshierarchie, indem Sie die Gating-Strategie überprüfen und die Tore richtig umbenennen.</li>
		<li>Öffnen Sie die statistische Ansicht, indem Sie sich für die Ansicht erstellen von Statistikenentscheiden. Bearbeiten Sie die Statistikansicht nach den Benutzereinstellungen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Statistik-Ansicht klicken und die Ansicht Bearbeiten der Statistik auswählen.</li>
		<li>Wählen Sie eine Farbe für jedes Tor, die den visuellen Aspekt des Layouts durch einen Doppelklick auf das Feld entsprechend der Bevölkerung verbessert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie im Cytometer-Fenster auf die Registerkarte Parameter und passen Sie die Spannungen für Parameter an, um die Population des Interesses auf den Grundstücken darzustellen.</li>
	<li>Passen Sie die Spannungen für jeden der Parameter so an, dass die negative Population von der positiven Population unterschieden werden kann. Bevor Sie die Proben für die Kompensationskontrolle aufnehmen, überprüfen Sie, ob die eingefärbten positiven Kontrollen in der Größenordnung sind (stellen Sie sicher, dass die positiven Spitzen sichtbar sind und nicht zu weit nach rechts). NOTE: Wenn die positiven Spitzen abgefallen sind, sollten die Spannungen angepasst werden, um die positiven Populationen zu sehen.</li>
	<li>Zeichnen Sie die einfarbig gefärbten Zellen für Kompensationskontrollen (unbefleckt, PE-Cy7, PE, FITC und APC).</li>
	<li>Wenn die positiven Kontrolltore nicht richtig aufgestellt sind, passen Sie sie an, indem Sie Spannungen ändern.</li>
	<li>Gehen Sie zum Experiment > Kompensationseinstellung > Kompensation berechnen. Wählen Sie nur im resultierenden Fenster .</li>
	<li>Wechseln Sie zum globalen Arbeitsblatt, indem Sie auf den Knopf "Toggle" oben links im Arbeitsfenster klicken.</li>
	<li>Laden Sie die positive Kontrollprobe und gewinnen Sie genügend Zellen, um die Ausgleichszahlung und die Tore anzupassen.</li>
	<li>Laden Sie die Probe erneut und überprüfen Sie, ob jede Handlung die erwartete Zellpopulation auf der Basis des fluorchromen gefärbten Antikörpers zeigt. Erwerben und erfassen Sie 100.000 Veranstaltungen für Vollblutproben und 10.000 Veranstaltungen für gereinigte Blutplättchen. Laden Sie die Proben einzeln, bis die Akquisition abgeschlossen ist.</li>
	<li>Analysieren Sie die Flow-Zytometrie-Daten mit der Software mit entsprechenden Grundstücken und Toren (Bild 3)</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Häufig werden Blutplättchen durch eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit isoliert, die plateletreichem Plasma liefert, das eine beträchtliche Anzahl von Blutkörperchen, Zellabfall und Plasmaproteinen enthält, die die biochemischen und physiologischen Assays und Bedürfnisse stören können. Weitere Reinigung21. Daher ist es wichtig, eine schnelle und einfache Methode zu verwenden, die reine Blutplättchen ohne größere Verunreinigungen erzeugen kann. Das hier vorgestellte Protokoll beschreib...

Blutplättchen sind ein Bestandteil des Blutes, der als Initiator der Blutgerinnung als Reaktion auf Schäden im Blutgefäß fungiert. Sie versammeln sich an der Stelle der Verletzung, um die Gefäßwand1zu stopfen. Plattenets sind Zusammenhänge von Zytoplasma, die aus den Megakaryozyten des Knochenmarks unter dem Einfluss von Thrombopoietin abgeleitet werden und in den Kreislauf2gelangen. Sie gelten als metabolisch aktiv und können die extrazelluläre Umgebung durch die Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden erkennen, die zu der Ausbreitung, Aggregation und Hämodizatische Steckerbildung 1, 3führen. Neben der Hämostasis/Thrombose und der Wundheilung4spielen die Platten eine wichtige Rolle bei den Entzündungsreaktionen, der Angiogenese und den Metastatis3,5 , 6,7, 8.
Die Plateletten werden aus dem Blut gereinigt, um ihre biochemischen und physiologischen Eigenschaften zu untersuchen, die frei von anderen Blutbestandteilen sein sollten. Da rote Blutkörperchen (RBC) und weiße Blutkörperchen (WBC) deutlich mehr RNAundProteine enthalten als die Blutplättchen 9,10, kann das Vorhandensein von sogar einer kleinen Anzahl dieser Zellen mit transkriptomischen und proteomischen Analysen der RNA stören Und Proteine, die aus Blutplättchen stammen. Wir fanden heraus, dass gereinigte Blutplättchen, die mit Thrombin-Bind-Antikörper wie Anti-GPIIb/IIIa (JON/A) und Anti-P-Selektin aktiviert wurden, effizienter als Vollblutplüten.
Da die Blutplättchen zerbrechlich sind, ist es wichtig, die Proben möglichst milde zu behandeln. Wenn die Platten aktiviert sind, geben sie ihren Granulatgehalt frei und sinken schließlich ab. Um die funktionellen Eigenschaften der Platelette intakt zu halten, ist es daher wichtig, die Ruhe während der Isolation zu erhalten. Mehrere Protokolle haben die Isolierung von Blutplättchen von menschlichem, Hund, Ratte und nicht-menschlichem Primat mit verschiedenen Methoden1,10,11, 12beschrieben. Einige der Methoden erfordern mehrere Schritte wie das Sammeln von platelettreichem Plasma durch Zentrifugation, Filtration durch Trennsäule, negative Auswahl von Blutplättchen mit RBC-und WBC-spezifischen Antikörper, die mit Magnetperlen konjugiert werden, und so weiter, die Zeitaufwendig und kann Blutplättchen und deren Inhalt abbauen.
Ford und seine Kollegen beschrieben die Platelet-Reinigung aus menschlichem Blut mit Iohexol Medium11. Diese Methode verwendet ein ähnliches Volumen der Blutprobe und Medium während der Reinigung. Da der Mensch ein höheres Blutvolumen erweist, ist es relativ einfach, die Blutplättchen zu reinigen.
Iohexol ist ein universelles Dichtegradienten-inertes Medium, das frei im Wasser löslich ist und bei der Fraktionierung von Nukleinsäuren, Proteinen, Polysacchariden und Nukleoproteinen 13,14verwendet wird. Es hat eine geringe Osmolalität und ist ungiftig, so dass es ein ideales Medium für die Reinigung vonintakten lebenden Zellen 11. Es ist ein nicht-partikelfreies Medium; So kann die Verteilung der Zellen in einem Farbverlauf mit Hämozytometer, Strömungszytometer oder Spektrophotometer bestimmt werden. Es stört nicht die meisten enzymatischen oder chemischen Reaktionen der Zellen oder Zellfragmente nach der Verdünnung.
Die Maus dient als wichtiges Tiermodell für viele menschliche Krankheiten15, 16,17,18. Es gibt ein paar veröffentlichte Artikel, die die Reinigung von Maus-Platten 19,20beschreiben. Allerdings liefert die Maus ein relativ geringeres Blutvolumen, was die Reinigung von Blutplättchen erschwert. Wird das gleiche geringe Volumen an GradientenMittel-und Blutproben verwendet, kann die Plattenschicht nach der Zentrifugation nicht eindeutig von der RBC-WBC-Schicht getrennt werden. In diesem Artikel haben wir eine schnelle und einfache Methode der Maus-Plattenreinigung mit dreifach mehr Iohexol-Gradientenmedium im Verhältnis zum Blutprobenvolumen und der niedrigen Geschwindigkeit Zentrifugation beschrieben. Wir haben auch die gereinigten Blutplättchen mit Thrombin aktiviert und ihre Qualität mit Strömungszytometrie und Mikroskopie untersucht.

<table><tbody><tr><td>APC Ratte Anti-Maus/Mensch CD62P (P-Selektin)</td><td>Thermoscientific</td><td>17-0626-82</td><td>Thrombozyten-Aktivierungsmarker</td></tr><tr><td>Eppendorf-Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-166</td><td>Röhrchen für Zentifugen</td></tr><tr><td>FACS DIVA Software</td><td>BD Biosciences</td><td>Nicht-Katalogartikel</td><td>Analyse von Blutplättchen und Vollblut</td></tr><tr><td>FACS-Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>352008</td><td>Röhrchen für den Fluss Zytomterie</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td>Inhaltsstoff für Färbepuffer</td></tr><tr><td>FITC Ratte Anti-Maus CD41</td><td>BD Biosciences</td><td>553848</td><td>Thrombozytenmarker</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>Nicht-Katalogartikel</td><td>Analyse von Blutplättchen und Vollblut</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo, Inc.</td><td>Analyse</td><td>von Blutplättchen und Vollblut</td></tr><tr><td>Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)</td><td>EMD Millipore</td><td>03-34-0001</td><td>Verhindern Sie die Bildung von Blutplättchengerinnseln</td></tr><tr><td>Hämatokrit Kapillarröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362566</td><td>Blutentnahme Kapillarröhrchen</td></tr><tr><td>Hemavet</td><td>Drew Scientific</td><td>Nicht-Katalogartikel</td><td>Blutzellanalysator</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>Zellzählkammer</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Zur Betäubung von Mäusen</td></tr><tr><td>Mikroskop (Olympus CKX41)</td><td>Olympus</td><td>Nicht-Katalogartikel</td><td>Zellüberwachung und -zählung</td></tr><tr><td>Nycodenz (Histodenz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td>Gradient Medium</td></tr><tr><td>PE Ratte Anti-Maus CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>561087</td><td>WBC Marker</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Anti-Maus für Ratten TER 119</td><td>BD Biosciences</td><td>557853</td><td>Erythrozytenmarker</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 200 & Mikro; L, mit breiter Bohrung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-1A</td><td>Übertragen von Blut- und Thrombozytenproben</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 1000 & Mikro; L, mit breiter Bohrung</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21-236-2C</td><td>Transfer von Blut- und Thrombozytenproben</td></tr><tr><td>Phosphat-Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14040-117</td><td>Puffer zum Waschen und Verdünnen</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Physiologische Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-688-26</td><td>Antikoagulans</td></tr><tr><td>Färbepuffer</td><td>In-house</td><td>Nicht-Katalogartikel</td> Wasch<td>- und Verdünnungspuffer</td></tr><tr><td>Steile Wasser</td><td></td> Inhouse-Non-Katalog-Artikel <td></td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75253839/433607</td><td>Schwingrotorzentrifuge</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Enzyme Research Laboratoty</td><td>HT 1002a</td><td>Thrombozytenaktivierung Agonist</td></tr><tr><td>Tricin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td>Puffer für Nycodenz Medium</td></tr></tbody></table>

reinigung von plateletten aus dem mausblut

Purification of Platelets from Mouse Blood

Die Plateletten werden von Vollblut gereinigt, um ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen, die frei sein sollten von roten Blutkörperchen (RBC), weißen Blutkörperchen (WBC) und Plasma-Proteinen. Wir beschreiben hier die Reinigung von Blutplättchen aus dem Mausblut mit dem Dreifach mehr Iohexol-Gradientenmittel im Verhältnis zum Blutprobenvolumen und der Zentrifugation in einem schwingenden Eimer-Rotor bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C. Die Erträge der gereinigten Blutungen lagen bei 18,2-38,5%, und die gereinigten Blutplättchen befanden sich in einem ruhenden Zustand, der keine nennenswerte Anzahl von RBC und WBC enthielt. Die gereinigten Blutplättchen, die mit Thrombin behandelt wurden, zeigten bis zu 93% Aktivierung, was auf ihre Lebensfähigkeit hinweist. Wir haben bestätigt, dass die gereinigten Blutplättchen mit Hilfe von Strömungszytometrie und mikroskopischer Auswertung ausreichend rein sind. Diese Blutplättchen können für die Genexpression, Aktivierung, Granulatfreigabe, Aggregation und Haftungsanalysen verwendet werden. Diese Methode kann zur Reinigung von Blutplättchen aus dem Blut anderer Arten auch verwendet werden.

Die Zusammenfassung der Plattenreinigung wird in einem Strömungsdiagramm beschrieben (Abbildung 1). Zu den Schritten gehören die Blutentnahme von der Maus mit Retro-Orbitalblutungen in Anwesenheit eines Gerinnungshaus, die Zugabe von Blutprobe auf das Iohexol-Gradientenmedium, Zentrifugation in einem schwingenden Eimer-Rotor bei 400 x g für 20 min bei 20 ° C. Die Qualität der gereinigten Blutplättchen wurde nach der Färbung mit Antikörper mit Mikroskopie und Strömungszytometrie bewe...

Hier wurde in Anwesenheit eines Antikoagulanten Mausblut gesammelt. Die Blutplättchen wurden mit einer niedrigen Drehzahlenzentrifugation durch Iohexol-Gradientenmedium gereinigt. Die Blutplättchen wurden mit Thrombin aktiviert, um zu untersuchen, ob sie lebensfähig sind. Die Qualität der gereinigten Blutplättchen wurde durch Strömungszytometrie und Mikroskopie analysiert.

Reinigung von Plateletten aus dem Mausblut

Platelets are purified from whole blood to study their functional properties, which should be free from red blood cells (RBC), white blood cells (WBC), ...

Blutplättchen sollten frei von Blutzellen und Proteinen sein, wenn sie ihre biochemischen und physiologischen Eigenschaften untersuchen. Deshalb haben wir ein Protokoll entwickelt, um Blutplättchen aus Mausblut zu reinigen. Diese Technik kann Thrombozyten mit Iohexol Gradienten medium und Low-Speed-Zentrifugation reinigen, was zu einer klaren Trennung der Blutplättchen von anderen Blutbestandteilen.Um die Blutplättchen zu reinigen, verwenden Sie eine Breitbohrpipettenspitze, um 200 Mikroliter frisch geerntetes Vollblut langsam an der Seite eines 1,5-Milliliter-Rohrs auf 600 Mikroliter Iohexol-Gradientenmedium zu schichten, ohne zu mischen. Nach der Zentrifugation in einem Schwingen-Bucket-Rotor, um die Blutplättchen zu isolieren, verwenden Sie eine neue Breitbohrpipettenspitze, um den größten Teil der plättchenreichen Schicht und einen kleinen Bruchteil der thrombozytenarmen Schicht zu sammeln, ohne die weiße Blutkörperchen- oder Rotblutzellschicht zu aspitrieren. Fügen Sie die Thrombozytenprobe in ein neues Rohr und fügen Sie einen Milliliter PBS zu den Thrombozyten hinzu.Mischen Sie die Thrombozyten durch Inversion, bevor Sie eine weitere Zentrifugation durchführen. Dann setzen Sie das Pellet in 200 Mikroliter PBS mit leichter Pipettierung wieder auf. Zur Thrombozytenaktivierung ein- bis zweimal 10 auf die sechs Thrombozyten in ein neues Rohr mit 100 Mikroliter Färbepuffer geben.Fügen Sie ein- bis zweimal 10 zu den sechs Blutplättchen zu einem anderen Rohr mit 100 Mikroliter Färbepuffer, ergänzt mit 0,4-Millimolar GPRP-Peptid. Fügen Sie Thrombin mit dem GPRP-Peptid in die Röhre, um die Blutplättchen zu aktivieren, und fügen Sie den von Interesse sindden Antikörpercocktail in beide Röhren ein. Als Positivkontrolle fügen Sie einen Mikroliter Vollblut in bis zu 100 Mikroliter Färbepuffer in eine Röhre mit 0,4-Millimolar-GPRP-Peptid ein, und fügen Sie Thrombin hinzu, um diese Blutplättchen zu aktivieren.Als Negativkontrolle, fügen Sie einen Mikroliter Vollblut in bis zu 100 Mikroliter Färbung Puffer. Dann färben Beide Steuerschläuche mit dem Antikörpercocktail. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln die Proben mit einem Milliliter frischer Färbepuffer pro Tube waschen.Die Pellets in 300 Mikroliter frischer Färbepuffer aussetzen. Übertragen Sie dann die Zellproben in einzelne lichtgeschützte Durchflusszytometrie-Analyseröhren. Um die Thrombozytometrie durch Flusszytometrie zu analysieren, erstellen Sie ein neues Experiment und generieren logarithmische Vorwärtsstreuung im Vergleich zu logarithmischen Seitenstreupunktdiagrammen.Nachdem Sie die Spannungen bei Bedarf angepasst haben, notieren Sie die einfarbig gefärbten Zellen für die Kompensationssteuerungen. Führen Sie nun die Positivkontrollprobe aus, um genügend Zellen zu erhalten, um die Kompensation und die Tore anzupassen. Erfassen und zeichnen Sie dann 100.000 Ereignisse für jede Vollblutprobe auf, und analysieren Sie die Flusszytometriedaten mithilfe der entsprechenden Plots und Gates.Wenn das Blut langsam auf das Medium zugesetzt wird, bilden das Iohexol-Gradientenmedium und die Blutprobe zwei separate Schichten in der Röhre. Nach der Zentrifugation enthält die obere, strohfarbene Schicht das Plasma, aber keine intakten Blutkörperchen. Die zweite, weißliche, plättchenreiche Schicht enthält den Großteil der Thrombozyten.Die dritte, transparente Schicht ist die blutbadige Schicht und befindet sich direkt über der roten Blutkörperchen und dem weißen Blutkörperchen Pellet. Vollblut zeigt unterschiedliche Populationen von roten Blutkörperchen, weißen Blutkörperchen und Blutplättchen auf einer logarithmischen Vorwärtsstreuung versus Seitenstreupunktdiagramm. Gereinigte Blutplättchen weisen jedoch eine ausgeprägte Population mit einer vernachlässigbaren Anzahl roter oder weißer Blutkörperchen auf.Vollblutproben enthalten Ter119-positive rote Blutkörperchen und CD45-positive weiße Blutkörperchen, die in gereinigten Thrombozytenproben fast fehlen. Unbehandelte gereinigte Thrombozyten drücken fast keine Aktivierungsmarker aus, die ihren Ruhezustand bestätigen, während gereinigte thrombinbehandelte Thrombozyten in der Regel eine 71%P-Selectin-Expression aufweisen. Die mikroskopische Auswertung unbehandelter gereinigter Thrombozytenproben zeigt keine Thrombozytenaggregation.Nach der Aktivierung mit Thrombin weisen die Thrombozyten jedoch eine robuste Aggregation auf, die ihre Lebensfähigkeit nach der Reinigung, wie nachgewiesen, weiter bestätigt. Schichtdiebe der Blutprobe sorgfältig auf das Iohexol-Medium, und beim Sammeln der Blutplättchen, achten Sie darauf, sorgfältig zu aspirieren, um nicht die roten Blutkörperchen und weißen Blutkörperchen Schichten für eine erfolgreiche Thrombozytenreinigung zu sammeln. Diese Methode kann auch für die Thrombozytenreinigung von anderen Arten verwendet werden.Die gereinigten Blutplättchen können für Genexpression, Aktivierung, Aggregation, Granulatfreisetzung und Adhäsionsstudien verwendet werden.

purification-of-platelets-from-mouse-blood

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt eine Technik zur Differenzierung von Megakaryozyten und zur Bildung von Blutplättchen. Hämatopoetische Stammvorläuferzellen – isoliert aus menschlichem Nabelschnurblut – differenzieren sich in Gegenwart von Thrombopoietin zu reifen Megakaryozyten. Die reifen Megakaryozyten produzieren zytoplasmatische Fortsätze, die als Proplättchen bezeichnet werden und aus denen einzelne Blutplättchen hervorgehen.

Eine in vitro Methode zur Differenzierung von Megakaryozyten und zur Thrombozytenbildung

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll zur Reinigung von Blutplättchen aus murinem Vollblut und deren anschließende Aktivierung mit dem Thrombozytenagonisten Thrombin. Bei der Analyse mit Durchflusszytometrie werden die gereinigten Ruhethrombozyten anhand der Expression ihres Zelloberflächenmarkers CD41 charakterisiert, während gereinigte aktivierte Blutplättchen sowohl die Oberflächenmarker CD41 als auch CD62P koexprimieren.

Reinigung und Aktivierung von Blutplättchen aus murinem Vollblut

In diesem Video demonstrieren wir die Isolierung von zytotoxischen Neutrophilen hoher Dichte und Neutrophilen niedriger Dichte aus dem Blut einer tumortragenden Maus durch diskontinuierliche Saccharosegradientenzentrifugation.

Isolierung von zytotoxischen Neutrophilen aus tumortragendem Mausblut

Blut-Leukozyten und Blutplättchen können als Marker der Gesamt bioenergetischen Gesundheit einer Person verwendet werden und so das Potenzial haben, pathologische Prozesse und die Auswirkungen der Behandlung zu überwachen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zu isolieren und zu messen, die Funktion der Mitochondrien und die oxidative Burst in diesen Zellen.

Bioenergetik und die Oxidative Burst: Protokolle für die Isolierung und Bewertung der menschlichen Leukozyten und Thrombozyten

Eine hochreine Bevölkerung von Megakaryozyten erhalten Sie bei Kabel Blut stammenden CD34+ Zellen. Eine Methode für die CD34+ Isolation und Megakaryocyte Zelldifferenzierung wird hier beschrieben.

Megakaryocyte Differenzierung und Thrombozyten-Formation von Human Cord Blood abgeleitet CD34 Zellen+

Leukozyten Interaktion eifrig mit vaskulären Zellen und Blutplättchen nach Schiff Wand Unfall oder während einer Entzündung. Hier beschreiben wir einen unkomplizierten Laminar-Flow-based Assay zur Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Leukozyten und ihre zellulären Partner zugrunde liegen.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

Hier wird ein Protokoll zum Anhängen von Peptid CD47 (pepCD47) an Metallstents mit Polybisphosphonatchemie vorgestellt. Die Funktionalisierung von Metallstents mit pepCD47 verhindert die Anhaftung und Aktivierung von Entzündungszellen und verbessert so deren Biokompatibilität.

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Dieses Protokoll beschreibt detailliert alle Schritte zur Gewinnung von Leukofilter-abgeleiteten CD34+ hämatopoetischen Vorläufern und deren In-vitro-Differenzierung und Reifung zu proplatlettragenden Megakaryozyten, die in der Lage sind, Blutplättchen im Kulturmedium freizusetzen. Dieses Verfahren ist nützlich für die eingehende Analyse zellulärer und molekularer Mechanismen, die die Megakaryopoese kontrollieren.

Leukodepletion Filter-abgeleitete CD34+ Zellen als Zellquelle zur Untersuchung der Megakaryozytendifferenzierung und Thrombozytenbildung

Die Bildung von prokoagulanzien Blutplättchen wurde mit einem erhöhten Thromboserisiko korreliert. Hier wird ein präzises Protokoll zur Isolierung von gewaschenen Blutplättchen aus menschlichem Blut vorgestellt, das dazu bestimmt ist, die Exposition von Phosphatidylserin und Mikrovesikelfreisetzung zu quantifizieren, die charakteristische Merkmale von Prokoagulanzienthrombozyten sind.

Charakterisierung von Prokoagulanzien-Thrombozyten durch Messung der Phosphatidylserin-Exposition und der Mikrovesikelfreisetzung aus humanen gereinigten Blutplättchen

Der Thrombozytenstoffwechsel ist von Interesse, insbesondere da er sich auf die Rolle der Hyper- und Hypoaktivität von Blutplättchen bei Blutungen und thrombotischen Erkrankungen bezieht. Die Isolierung von Blutplättchen aus dem Plasma ist für einige metabolische Assays notwendig. Hier wird ein Verfahren zur Isolierung intrazellulärer Metaboliten aus gewaschenen Blutplättchen vorgestellt.

Vorbereitung von gewaschenen menschlichen Blutplättchen für quantitative Stoffwechselflussstudien

Erfahren Sie die Reinigung von Thrombozyten aus Mausblut mittels Iohexol-Gradientenzentrifugation. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Aktivierung und Aggregation für Studien zur Thrombozytenbiologie.

Reinigung von Plateletten aus dem Mausblut

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