Name: Transfer von manipulierten Tumor-assoziierten Neutrophilen in tumortragende Mäuse zur Untersuchung ihres angiogenen Potenzials in Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Erfahren Sie die adoptive Übertragung von NAMPT-inhibierten Tumor-assoziierten Neutrophilen in tumortragende Mäuse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung anti-angiogener Eigenschaften und das Potenzial neutrophiler Immuntherapien.

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Unterstützt wurde unsere Arbeit durch Stipendien der Deutschen Krebshilfe, Fördernummer: 111647, und des Deutschen Forschungsrates (DFG), Fördernummer: JA 2461/2-1.

Alle Verfahren einschließlich Tiergegenständen wurden von den Aufsichtsbehörden GENEHMIGT: LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) und Regierungspräsidium Tübingen, Deutschland. Alle Manipulationen sollten unter sterilen Bedingungen (unter laminarer Durchflusshaube) mit sterilen Reagenzien und Instrumenten (Spritzen, Scheren, Zangen, Einwegsskalpelle, Petrischalen) durchgeführt werden.
ANMERKUNG: Das Gesamtschema des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Herstellung der B16F10 Melanom-Zelllinie
<ol><li>Bereiten Sie mykoplasma-negative Zellen, die zu einer 90% konfluenten Monoschicht (ca. 10 x 106 Zellen/T75-Kolben) angebaut werden, in vollständigem Iscove es Modified Dulbecco es Medium (IMDMc: IMDM + 10% Fetal Bovine Serum (FBS) + 1% Penicillin-Streptomycin) vor.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium, und spülen Sie die Zellen mit Phosphatgepufferter Saline (PBS). Tragen Sie 6 ml einer Zellablösung auf, die proteolytische und kollagenlytische Enzyme enthält (siehe Materialtabelle),und brüten Sie 2 min bei 37 °C.</li>
	<li>Klopfen Sie den Kolben sanft, um die verbleibenden haftenden Zellen von unten zu mobilisieren. Sammeln Sie die Zellsuspension in 15 ml-Röhrchen und Zentrifuge bei 300 x g für 7 min und 20 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Pellet gut in 1 ml PBS wieder aus. 14 ml PBS und Zentrifuge hinzufügen (300 x g und 20 °C für 7 min).</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml PBS wieder auf.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen und setzen Sie sie auf die Konzentration von 3 x 106/ml PBS (für den Schritt 2) oder 6 x 106/ml PBS (für den Schritt 6) für die Injektion wieder aus. Halten Sie Zellen maximal 30 min auf Eis.</li>
</ol>2. Allogenes Tumormodell bei Mäusen
<ol><li>Verwenden Sie 10 weibliche Ifnar1-/- Mäuse, die 8-12 Wochen alt sind und unter spezifisch pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten werden. HINWEIS: Weibliche Mäuse sind in einem subkutanen Modell des Tumorwachstums vorzuziehen, da Männchen aggressiver und daher anfällig für Verstöße an der Tumorstelle sind, was das Tumorwachstum beeinflusst.</li>
	<li>Rasieren Sie die Haut der Maus auf der Flanke mit einem elektrischen Rasierer, und desinfizieren Sie die Haut mit Gewebe nass mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Sammeln Sie die vorbereiteten B16F10 Melanomzellen in einer Konzentration von 3 x 106/ml PBS (siehe Schritt 1) in einer 1 ml Spritze und 0,4 x 19 mm Nadel. 100 ml der Suspension subkutan injizieren.<ol>
<li>Mischen Sie die Zellen vor jeder Injektion gut. Verwenden Sie Nadeln mit einem Durchmesser von nicht weniger als 0,4 mm, um Tumorzellen nicht zu stören.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie bis zu 5 Mäuse in einen Käfig und kontrollieren Sie die Tumorgröße (Länge, Breite und Tiefe) mit einem Bremssattel für 14 Tage. HINWEIS: Gemäß den Tiervorschriften sollte die Tumorgröße 15 mm im Durchmesser nicht überschreiten, Mäuse mit größeren oder nekrotischen/offenen Tumoren sollten vorher geopfert werden.</li>
	<li>Am 14. Tag opfern Sie die Mäuse in der CO2-Kammer.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Haut mit 70% Ethanol und entfernen Sie Tumore mit Schere und Zange in einer sterilen Petrischale. Halten Sie Tumore in einem 50 ml Rohr in vollständig Dulbecco modified Eagle Medium (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin) auf Eis.</li>
</ol>3. TAN-Isolierung
<ol><li>Legen Sie Tumore in sterile 6-Well-Platten, 5 Tumoren pro Brunnen. Tumoren mit einer sterilen Schere in 2-3 mm Stücke schneiden.<ol>
<li>Digest mit 1 ml Dispase/Kollagenase D/DNase I Lösung (0,2 mg/0,2 mg/100 mg in 1 ml DMEMc) pro Tumor. Bei 37 °C, 5%CO2 in einem feuchten Inkubator inkubieren und mit einer 10 ml Spritze ohne Nadel alle 15 min 3 mal mischen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um unverdaute Fasern zu entfernen, filtern Netzzellen durch 100 m filtert in 15 ml-Rohre (ein Brunnen pro Filter pro Röhre). PBS zu 15 ml, Zentrifugenrohre bei 460 x g, 4 °C für 5 min hinzufügen und den Überstand entfernen.</li>
	<li>Lyse erythrozyten mit einem Lysepuffer (NH4Cl 150 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3, 20 °C) durch Zugabe von 1 ml in jedes Rohr. Gut mischen und die Lösung aus allen Rohren zu einem kombinieren. Stoppen Sie die Reaktion nach 2 Minuten mit 11 ml eiskaltem (4 °C) DMEMc.</li>
	<li>Zentrifuge bei 460 x g,4 °C für 5 min, und entfernen Sie den Überstand. Das Pellet mit 15 ml kaltem PBS aussetzen. Zentrifuge bei 460 x g,4 °C für 5 min, und entfernen Sie den Überstand.</li>
	<li>Das Pellet in 1 ml PBS wieder aufhängen. Fügen Sie 3 ml Fc-Block-Antikörper (CD16/CD32, Vorrat 0,5 mg/ml) hinzu und tauchen Sie 15 min auf Eis ein.</li>
	<li>Antikörper hinzufügen: 10 ml Ly6G-PE (Lager 0,2 mg/ml) und 10 ml CD11b-APC (Lager 0,2 mg/ml). 20 ml 6-Diamidin-2-Phenylindol-Lebensfähigkeitsfarbstoff (DAPI, Lager 5 mg/ml) hinzufügen und 30 min in der Dunkelheit auf Eis brüten. HINWEIS: Es kann eine weitere Kombination aus Lebensfähigkeitsfarbstoffen und fluoreszierenden Konjugaten von Antikörpern verwendet werden.</li>
	<li>PBS bis 15 ml, Zentrifuge bei 460 x g,4 °C für 5 min hinzufügen und den Überstand entfernen.</li>
	<li>Setzen Sie das Pellet in DMEMc auf die Konzentration ca. 10 x 106/ml aus und halten Sie auf Eis.</li>
	<li>Sortieren Sie CD11b+ Ly6Ghi alive (DAPI-negative) Neutrophile mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (Gating-Strategie siehe Abbildung 2). HINWEIS: Bewahren Sie das Rohr mit Zellaufhängung und das Rohr mit DMEMc für sortierte Zellen bei 4 °C auf. Verwenden Sie die folgenden optimalen Sortiereinstellungen: eine 70-mm-Düse, eine Schwellenrate von maximal 22.000 Ereignissen/Sekunde und eine Durchflussrate von 1-3.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Reinheit der sortierten Neutrophilen mit einem Zytometer auf eine empfohlene Reinheit von >95%.</li>
	<li>Zentrifuge sortierte Neutrophile bei 460 x g, 4 °C für 5 min, und entfernen Sie den Überstand. Setzen Sie die sortierten Zellen in DMEMc auf die Konzentration von 1 x 106/ml aus. HINWEIS: Die erwartete Anzahl von Neutrophilen in einem 14-Tägigen B16F10-Tumor (10 mm Durchmesser) beträgt etwa 3 x 104 Zellen.</li>
</ol>4. NAMPT-Hemmung in TANs in vitro
<ol><li>Fk866 (NAMPT-Hemmer) in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Endkonzentration von 100 mM vorbereiten.</li>
	<li>Samen sortierte Neutrophile (Schritt 3.11) in 2 Brunnen einer 96-Well U-Bodenplatte (1,5 x 105 Neutrophile/Well). Fügen Sie FK866 in den Interventionsbrunnen (Endkonzentration von 100 nM) und eine gleiche Menge DMEMc mit DMSO in den Kontrollbrunnen ein. 2 h bei 37 °C, 5% CO2 in einem feuchten Inkubator inkubieren.</li>
	<li>Zentrifuge bei 460 x g,4 °C für 5 min, und entfernen Sie den Überstand. Resuspend in 200 ml PBS in jedem Brunnen. Wiederholen Sie dies 2 Mal.</li>
	<li>Zentrifuge bei 460 x g,4 °C für 5 min, und entfernen Sie den Überstand. Resuspend in kommerziellen endothelialen Zellwachstumsmedium (ergänzt mit 4 l/mL Endothelzellwachstumsergänzung, 0,1 ng/mL rekombinanter humaner epidermaler Wachstumsfaktor, 1 ng/mL rekombinanter menschlicher Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 90 g/ml Heparin und 1 g/ml Hydrocortison) auf eine Endkonzentration von 0,2 x 106 Zellen/ml (in 0,75 ml) (für Schritt 5) oder in PBS auf die Endkonzentration von 0,6 x 106 Zellen/ml (in 0,25 ml) (für Schritt 6).</li>
</ol>5. Abschätzung der angiogenen Eigenschaften von TANs mit dem Aortenring-Assay
<ol><li>Sezieren Sie die thorakale Aorta von einer männlichen C57BL/6J (WT) Maus. Reinigen und in 0,5 mm Breite Ringe schneiden. Legen Sie alle Ringe in einen Brunnen einer 24-Well-Platte mit 1 ml ergänztem Endothelzellwachstumsmedium. Über Nacht bei 37 °C, 5% CO2 in einem feuchten Inkubator inkubieren. HINWEIS: Die Verwendung von jungen (jünger als 8 Wochen) männlichen Mäusen zur Aortasektion ist vorzuziehen, da sie eine robustere angiogene Reaktion geben15.</li>
	<li>Füllen Sie die Brunnen der 96-Well-Flachbodenplatte mit 50 l löslicher Kellermembranmatrix, lassen Sie das Gel 30 min in einem 37 °C, 5% CO2 feuchten Inkubator setzen, damit die Matrix polymerisieren kann. Bereiten Sie mindestens 3 Brunnen pro Zustand vor.</li>
	<li>Betten Sie die Ringe in eine lösliche Kellermembranmatrix ein, indem Sie einen Aortenring auf der Oberseite der festen Matrixschicht platzieren, 1 Ring in der Mitte jedes Brunnens. Fügen Sie weitere 50 l lösliche Kellermembranmatrix hinzu, um jeden Ring abzudecken.<ol>
<li>Legen Sie die Platte in einen 37 °C, 5%CO2 feuchten Inkubator für weitere 30 min, um die Polymerisation der zweiten Matrixschicht zu ermöglichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 150 ml/Well des ergänzten Endothelzellwachstumsmediums und 2x104Ifnar1-/- TANs (Kontroll- und FK866-behandelt) hinzu (Schritt 4.4).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte 14 Tage lang bei 37 °C, 5% CO2 in einem feuchten Inkubator.</li>
	<li>Bild mit einem Standard-Phasenkontrastmikroskop und schätzen Sie die endotheliale Verzweigung. Die quantitative Bewertung von gefäßmorphometrischen und räumlichen Parametern einschließlich Verzweigungsindex kann automatisch mit dem bildverarbeitenden Programm für wissenschaftliche Bilder durchgeführt werden. ANMERKUNG: Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3dargestellt.</li>
</ol>6. Adoptivtransfer von behandelten Neutrophilen im allogenen Tumormodell
<ol><li>Bereiten Sie B16F10 Melanomzellen (Schritt 1.6) in PBS in einer Konzentration von 6 x 106 Zellen/ml vor.</li>
	<li>Bereiten Sie 2 Arten von Neutrophilen vor: FK866-behandelte Neutrophile und kontrollieren Sie unbehandelte Neutrophile (Schritt 4.4) in PBS in einer Konzentration von 6 x 105 Zellen/ml. Mischen Sie Neutrophile mit B16F10 Melanomzellen (das endgültige Neutrophil-Zu-Tumor-Zellen-Verhältnis 1:10), um 2 Arten von Zellmischungen zu haben.</li>
	<li>Nehmen Sie 10 weibliche WT-Mäuse 8-12 Wochen alt, 5 in jeder Gruppe. Rasieren Sie die Haut an der Flanke mit einem elektrischen Rasierer und desinfizieren Sie mit 70% Ethanol.</li>
	<li>In beiden Gruppen von Mäusen 100 l der Zellsuspension (Schritt 6.2) subkutan mit einer Insulinspritze und einer Nadel mit 0,4 mm Durchmesser injizieren. Legen Sie 1-5 Mäuse aus der gleichen Gruppe in einen Käfig.</li>
	<li>Am 2. Tag bereiten Sie 2 Arten von Neutrophilen vor: FK866-behandelte Neutrophile und kontrollieren unbehandelte Neutrophile (Schritt 4.4) in PBS in einer Konzentration von 6 x 105 Zellen/ml. Mit einer Insulinspritze und einer Nadel mit einem Durchmesser von 0,4 mm in beide Gruppen von Mäusen in die Schwanzvene injizieren (Schritt 6.4) i.v. Legen Sie Mäuse zurück in den Käfig.</li>
</ol>7. Tumorwachstumsmessung, histologische Untersuchung
<ol><li>Überwachen Sie das Tumorwachstum jeden zweiten Tag. Bewerten Sie die Tumorgröße mit Sätteln und berechnen Sie das Tumorvolumen mit der Formel V=4/3**(h*w2)/8 (h=Höhe, b=Breite, Tiefe= Breite).</li>
	<li>Opfern Sie Mäuse am Tag 14 in der CO2-Kammer. Entfernen Sie Tumore und messen Sie die Tumorgewichte.</li>
	<li>Tumoren in optimaler Schnitttemperaturverbindung in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.</li>
	<li>Die Proben auf -20 °C auftauen und 5 mm Abschnitte mit einem Kryotom vorbereiten. Die Kryocuts 30 min bei 20 °C trocknen lassen. Befestigen Sie die Abschnitte in -20 °C kaltem Aceton für 2 min und lassen Sie sie 30 min bei 20 °C trocknen.</li>
	<li>Block mit Fc-Block Antikörpern (CD16/CD32, Lager 0,5 mg/ml 1:500) in PBS für 1 h bei 20 °C.</li>
	<li>Mit Kaninchen Antimaus Laminin Gamma-Antikörper (1:1500 in PBS, 200 l) für 1 h bei 20 °C. Dreimal mit PBS waschen.</li>
	<li>Fleck mit sekundärem Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (Bestand 0,5 mg/ml, 1:400 in PBS), Anti-Maus-SMA (1:500 in PBS) und 2 l DAPI (Bestand 5 mg/ml, 1:100 in PBS) in einem Endvolumen von 200 l Antikörperlösung. 1 h bei 20 °C bei Dunkelheit inkubieren. Dreimal mit PBS waschen.</li>
	<li>Trockene Rutschen für 20 Minuten bei 20 °C bei Dunkelheit. Montage mit wasserfreiem Montagemedium für die Mikroskopie und Abdeckung mit Einem Deckelschlupf. 1 h in 37 °C trocknen lassen.</li>
	<li>Führen Sie eine mikroskopische Untersuchung durch. Quantifizieren Sie die Vaskularisation durch Zählen der Gesamtzahl (optional Fläche) von Laminin+ Gefäßen und der Anzahl (Fläche) von SMA+ entwickelten Gefäßen. HINWEIS: Um eine Bildanalyse durchzuführen, nehmen Sie alle Bilder unter den gleichen Bedingungen (Licht, Kontrast, Vergrößerung) auf. In diesem Fall werden Verarbeitungsparameter festgelegt, und die Bildverarbeitung wird vollautomatisch. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4 und Abbildung 5dargestellt.</li>
</ol>

<ol><li>Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+responsive+to+endogenous+IFN-beta+regulate+tumor+angiogenesis+and+growth+in+a+mouse+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Trotz der Fortschritte in der chirurgischen und pharmakologischen Krebsbehandlung bleibt eine erfolgreiche Therapie eine Herausforderung. Da Immunzellen bekanntermaßen eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Tumorwachstums spielen, sollten neuartige Methoden etabliert werden, die die Tumorigenizität solcher Zellen hemmen. Hier zeigen wir einen neuartigen Ansatz zur Unterdrückung des Tumorwachstums durch Adoptivtransfer antiangiogenicer Tumor-assoziierter Neutrophile. Selektives Targeting der pro-angiogenen NAMPT-Sign...

Typ-I-Interferone (IFNs) spielen eine wichtige Rolle bei der Stimulierung von Wirtsreaktionen auf Neoplasie, da der Mangel an Typ-I-IFN-Signalisierung zu einem signifikant erhöhten Tumorwachstum führt1. Einer der Mechanismen, die an diesem Prozess beteiligt sind, ist die Regulierung der tumorigenen Aktivität von tumorassoziierten Neutrophilen, die durch koloniestimulierenden Faktor 3-Rezeptor (CSF3R) nachgeschaltete Signalisierung2gesteuert wird. Der koloniestimulierende Faktor 3 (CSF3) oder granulozyten koloniestimulierender Faktor wurde gezeigt, dass die Signalisierung mit Nicotinamidphosphoribosyltransferase (NAMPT) aktiviert wird3,4. NAMPT ist ein ratenbegrenzendes Enzym für die Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Synthese, das die Glykolyse verbessert und DNA-Reparatur, Genexpression und Stressreaktion reguliert, die das Überleben und die Proliferation von Krebszellen fördern5. NAMPT ist bei mehreren Krebsarten überexprimiert, einschließlich Dickdarm-, Eierstock-, Brust-, Magen-, Prostatakrebs- und Gliome6. NAMPT ist nicht nur für Tumorzellen wichtig, sondern auch für eine Vielzahl anderer Zelltypen, die in Tumoren vorhanden sind, wie z. B. myeloische Zellen - es treibt ihre Differenzierungan 4, hemmt die Apoptose und stimuliert die Expression mehrerer Zytokine oder Matrixabbauende Enzyme in Makrophagen7.
Tumorassoziierte Neutrophile stellen wichtige Modulatoren des Tumorwachstums dar. TAN-Funktionen sind stark abhängig von der Verfügbarkeit des Typs I IFN, da diese Zytokine die Antitumoraktivität von Neutrophilen prime. Im Gegenteil, das Fehlen von IFNs unterstützt die tumorgene Aktivierung dieser Zellen, insbesondere ihre pro-angiogenen Eigenschaften. In Übereinstimmung damit entwickeln Mäuse mit einem Mangel an IFNs signifikant größere und besser vaskularisierte Tumoren, die stark mit protumoralen/pro-angiogenen Neutrophilen infiltriert werden1,2,8, 9,10. Wichtig ist, dass solche pro-angiogenen TANs eine erhöhte Aktivität von NAMPT aufweisen, was auf seine wesentliche Rolle bei der Pro-Tumor-Polarisation von Neutrophilen hindeutet.
Die Erschöpfung von Neutrophilen mit Ly6G-Antikörpern oder Hemmung ihrer Migration (CXCR2-Antikörper) führt zu verminderter Tumorangiogenese, Wachstum und Metastasierung1,8. Dennoch sind erzeugte monoklonale Antikörper immunogen, und ihre Verabreichung ist mit einer Reihe von lebensbedrohlichen Nebenwirkungen verbunden11. Die Behandlung mit kleinen Molekülen, wie dem NAMPT-Hemmer FK866, der die neutrophile Tumoriogenität modulieren, könnte helfen, solche Komplikationen zu vermeiden. Leider, pharmakologische systemische Hemmung von NAMPT, neben seiner therapeutischen Wirkung auf das Tumorwachstum, führt zu schweren Nebenwirkungen einschließlich gastrointestinaler Toxizität und Thrombozytopenie. Daher ist die systemische Anwendung von NAMPT-Inhibitoren nicht möglich12,13,14.
Aus diesem Grund schlagen wir hier ein Protokoll vor, bei dem NAMPT-Aktivitäten direkt in isolierten TANs blockiert werden. Solche Anti-Tumor-Neutrophile werden dann adoptiv in einen tumortragenden Wirt übertragen. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, systemische toxische Nebenwirkungen der Verbindungen zu vermeiden, während seine Wirkung auf die Zielzellen erhalten bleibt.

<table><tbody><tr><td>15 ml</td><td>Tuben Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Deutschland</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Tuben Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Deutschland</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>5ml / 10ml / 25ml sterile Tipps für die automatische Pipette</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Deutschland</td><td>6006180 / 607180 / 760180</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Zellkulturplatten mit flachem Boden</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Deutschland</td><td>833.920</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Flat-Bottom Zellkulturplatten</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Deutschland</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>96 Well U-Bottom Zellkulturplatten</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Deutschland</td><td>65018</td><td></td></tr><tr><td>AMG EVOS fl digitales inverses Mikroskop</td><td>AMG, Bothel, U.S.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-CD11b</td><td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td><td>553312-Klon</td><td>M1/70, APC-konjugiert, 0,2 mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-Maus-Ly6G</td><td>BioLegend, Kalifornien, USA</td><td>127608</td><td>Klon 1A8, PE-konjugiert, 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>BD FACS AriaII</td><td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td><td></td><td>Zellsortierer</td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Vogel Deutschland, Kevelaer, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Casy Zellzähler</td><td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics 50&micro; m / 100 &Mikro; m Sterilfilter</td><td>Sysmex Partec GmbH, Görlitz, Deutschland</td><td>04-004-2327 / 04-004-2328</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Rotina 420 R</td><td>Andreas Hettich, Tuttlingen, Deutschland</td><td>4706</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase D</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dilaktat)</td><td>BioLegend, Kalifornien, USA</td><td>422801</td><td>Lagerbestand: 5mg/ml</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>D4818-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA</td><td>41966-029</td><td>DMEM komplett: DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethylsufoxid)</td><td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Deutschland</td><td>WAK-DMSO-10</td><td>CryoSure-DMSO</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzell-Wachstumsmedium</td><td>PromoCell, Heidelberg, Deutschland</td><td>c-22010</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetales Rinderserum)</td><td>Biochrom, Berlin, Deutschland</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Fc-Block (Anti-Maus CD16/32)</td><td>BD Pharmingen, Becton Dickinson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td><td>553142</td><td>Klon 2.4G2, Lagerbestand: 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>FK 866 Hydrochlorid</td><td>Axon Medchem, Groningen, Niederlande</td><td>Axon 1546</td><td>Lagerbestand: 100 mM</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L</td><td>Abcam, Cambridge, Großbritannien</td><td>ab97075</td><td>Cy3-konjugiert, Lagerbestand: 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2-Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td></td><td></td>51026334</tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA</td><td>12440-053</td><td>IMDM komplett: IMDM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin</td></tr><tr><td>Isis GT420 Rasierer</td><td>B. Braun Asculap, Suhl, Deutschland</td><td>90200714</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix Basalmembran</td><td>Corning Life Sciences, Amsterdam, Niederlande</td><td>7205011</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom Kryostat Microm HM 505 N</td><td>Microm International GmbH, Walldorf, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoklonales Anti-Aktin, & alpha;-Glatte Muskulatur</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>F3777</td><td>FITC-konjugiert, keine Angaben zur Stammkonzentration</td></tr><tr><td>Nadeln 0,4 mm x 16 mm</td><td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>Neomount</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>HX67590916</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, USA</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetus automatische Pipette</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te, Eberstadt, Deutschland</td><td>9907200</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Eindeckmittel gegen Ausbleiche mit DAPI</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Maus Laminin gamma 1 Kette</td><td>Immundiagnostik, Bensheim, Deutschland</td><td>AP1001.1</td><td>Keine Informationen über die Bestandskonzentration</td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.</td><td>A1105-01</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell zur sterilen Entsorgung (Nr. 15)</td><td>MedWare, Naples, U.S.</td><td>120920</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen 1 ml</td><td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td><td></td><td></td>303172</tr><tr><td>Spritzen 10 ml</td><td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>T75 sterile Zellkulturflaschen</td><td>Sarstedt AG & Co., N&uuml; mbrecht, Deutschland</td><td>833.911.302</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek, Torrance, USA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver.Z1 Inverses Mikroskop mit optischem Schnitt von ApoTome</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transfer von manipulierten tumor-assoziierten neutrophilen in tumortragende mäuse zur untersuchung ihres angiogenen potenzials in vivo

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Der Beitrag von Neutrophilen zur Regulierung der Tumorgenese wird immer mehr beachtet. Diese Zellen sind heterogen und können je nach Tumormilieu pro- oder antitumor-Kapazität besitzen. Eines der wichtigen Zytokine, die neutrophile Funktionen in einem Tumorkontext regulieren, sind Typ-I-Interferone. In Gegenwart von Interferonen, Neutrophile gewinnen Anti-Tumor-Eigenschaften, einschließlich Zytotoxizität oder Stimulation des Immunsystems. Umgekehrt führt das Fehlen einer Interferon-Signalisierung zu einer ausgeprägten Pro-Tumor-Aktivität, die durch eine starke Stimulation der Tumorangiogenese gekennzeichnet ist. Kürzlich konnten wir zeigen, dass pro-angiogene Eigenschaften von Neutrophilen von der Aktivierung von Nicotinamidphosphoribosyltransferase (NAMPT) Signalweg in diesen Zellen abhängen. Die Hemmung dieses Weges bei tumorassoziierten Neutrophilen führt zu ihrem potenten antiangiogenen Phänotyp. Hier zeigen wir unser neu etabliertes Modell, das die In-vivo-Bewertung des tumorgenen Potenzials manipulierter tumorassoziierter Neutrophilen (TANs) ermöglicht. Kurz darauf können pro-angiogene tumorassoziierte Neutrophile von tumortragenden Interferon-Mäusen isoliert und durch Blockierung der NAMPT-Signalisierung zu antiangiogenem Phänotyp repolarisiert werden. Die angiogene Aktivität dieser Zellen kann anschließend mit einem Aortenring-Assay bewertet werden. Antiangiogene TANs können in tumortragende Wildtyp-Empfänger übertragen werden und das Tumorwachstum sollte 14 Tage lang überwacht werden. Am Tag werden 14 Mäuse geopfert, Tumore entfernt und mit ihrer Vaskularisation geschnitten. Insgesamt bietet unser Protokoll ein neuartiges Werkzeug zur In-vivo-Bewertung der angiogenen Kapazität von Primärzellen, wie tumorassoziierten Neutrophilen, ohne künstliche neutrophile Zelllinienmodelle verwenden zu müssen. Vc

Mit dem hier beschriebenen Verfahren wurden Ifnar1-/- Neutrophile von Tumoren isoliert und mit DemAmpT-Hemmer FK866 für 2 h behandelt. Unbehandelte Ifnar1-/- Neutrophile wurden als Kontrolle verwendet. Die Wirksamkeit der Behandlung wurde mit dem Aortenring-Assay bewertet, der die wichtigsten Schritte der Angiogenese (Matrixdegradation, Migration, Proliferation, Reorganisation) widerspiegelt. Wir konnten nachweisen, dass FK866-behandelte Neutrophi...

Hier zeigen wir das therapeutische Potenzial antiangiogener Tumor-assoziierter Neutrophilen nach ihrer Übertragung in tumortragende Mäuse. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um neutrophile Aktivität ex vivo zu manipulieren und anschließend ihre Funktionalität in vivo bei der Entwicklungvon Tumoren zu bewerten. Es ist ein geeignetes Modell für die Untersuchung potenzieller neutrophiler Immuntherapien.

Transfer von manipulierten Tumor-assoziierten Neutrophilen in tumortragende Mäuse zur Untersuchung ihres angiogenen Potenzials in Vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Unser Protokoll bietet ein neuartiges Werkzeug zur Bewertung des angiogenetischen Potenzials tumorassoziierter Primärneutrophilen in vivo, ohne künstliche neutrophile Zelllinienmodelle verwenden zu müssen. Die direkte Hemmung der Nicotinamidphosphoribosyltransferase, kurz NAMPT, bei tumorassoziierten Neutrophilen mit ihrem anschließenden Adoptivtransfer in tumortragende Tiere ermöglicht die Manipulation von Neutrophilen ohne systemische toxische Nebenwirkungen. Wir zeigen das therapeutische Potenzial manipulierter antiangiogener tumorassoziierter Neutrophilen nach der Übertragung in tumortragende Wirte für die Untersuchung potenzieller neutrophiler Immuntherapien in verschiedenen Krebsmodellen.Um ein allogenes Tumor-Maus-Modell einzurichten, rasieren Sie die Haut von 10 acht bis 12 Wochen alten weiblichen Interferon alpha und Beta-Rezeptor-Untereinheit 1 Knockout-Mäuse mit einem elektrischen Rasierer und desinfizieren Sie die Haut mit 70%Ethanol, dann dreimal 10 bis zu den sechs B16F10 Melanomzellen pro Milliliter PBS in eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 0,4 mal 19-Millimeter-Nadel laden und 100 Mikroliter der Suspension subkutan an einer hinteren Flanke in jede rasierte Tier.

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Research

Forschung

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Krebsforschung

Dieses Video zeigt einen Assay zur Erzeugung von anti-angiogenen tumorassoziierten Neutrophilen (TANs). Bei der Entnahme eines murinen Melanomtumors, der pro-angiogene TANs enthält, werden die einzelnen Zellen mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert und mit einem Inhibitor der Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase (NAMPT) behandelt, um die Fähigkeit zur Stimulierung der Angiogenese zu verringern.

Generierung von anti-angiogenen tumorassoziierten Neutrophilen

Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die durch den den Tumor umgebenden Gewebes sowie lokale pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren beeinflusst wird. Daher kann orthotrope Pritzer, anstatt subkutanen Modellen nützlich sein, um Krebsprogression in einer Weise, dass eine bessere ahmt menschlichen Pathologie studieren.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Neutrophile spielen nicht nur eine wichtige Rolle bei der Abwehr des Wirts gegen eindringende Mikroorganismen, sondern sind auch an der Immunüberwachung von Tumorzellen beteiligt. Hier beschreiben wir Techniken im Zusammenhang mit der Isolierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften und Methoden zur Überwachung der Funktion von Anti-Tumor-Neutrophilen in vitro und in vivo.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften

Eine orthotope Brustkrebs primären Tumormodell und die operative Entfernung des Primärtumors Maus Lebensdauer zu verlängern spontane Metastasierung zu erzeugen, werden beschrieben. Das Tumorwachstum und Progression werden überwacht und durch Luciferase Fluoreszenzbildgebung quantifiziert.

Ein orthotopen Mausmodell des Spontan Metastasierung von Brustkrebs

Hier beschreiben wir das Modell und den Ansatz zur Untersuchung der Funktionen von Lungenalveolarmakrophagen bei der Metastasierung von Krebs. Um die Rolle dieser Zellen bei der Metastasierung zu demonstrieren, wurde das syngene (4T1) Modell des Brustkrebses in Verbindung mit der Depletion von Alveolarmakrophagen mit Clodronat-Liposomen verwendet.

Untersuchung der Rolle von Alveolarmakrophagen in Metastasierung von Brustkrebs

Dieses Manuskript bietet eine Beschreibung der Methodik, die zur Etablierung von Transduktions-Transplantations-Mausmodellen verwendet wurde. Es wird detailliert über technische Fehler berichtet, die bei der Durchführung von Knochenmarktransplantationen vermieden werden sollten. Es sollte ein klares Verständnis für die Bedeutung eines hohen Virustiters, Transfektion/Transduktion und Bestrahlung gewonnen werden.

Transduction-Transplantation Maus-Modell der myeloproliferativen Neoplasien

Dieses Protokoll beschreibt die intravitalen Bildgebung von transgenen Mäusen zellspezifische fluoreszierenden Marker zum Ausdruck zu bringen. Intravitalen Bildgebung stellt eine nicht-invasive Methode für hochauflösende Beobachtungen an lebenden Tieren mit implantierbaren Windows durch die mikroskopische Visualisierung von Prozessen möglich ist. Diese Methode ist besonders nützlich, um längs Prozesse zu studieren.

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Wir beschreiben zwei Methoden zur Beurteilung der transienten vaskulären Permeabilität im Zusammenhang mit der Tumormikroumgebung der Metastasenfunktion (TMEM) und der Krebszellintravasation unter intravenöser Injektion von hochmolekularem Dextran (155 kDa) bei Mäusen. Die Methoden umfassen intravitale Bildgebung bei lebenden Tieren und feste Gewebeanalyse mittels Immunfluoreszenz.

Beurteilung der Tumormikroumgebung von Metastasierung Doorway-Vermittelte Vaskuläre Durchlässigkeit im Zusammenhang mit der Krebszellverbreitung mit Intravital Imaging und Fixed Tissue Analysis

Hier stellen wir ein Tumortransplantationsprotokoll zur Charakterisierung von tumorinhärenten und peripherieabgeleiteten tumorinfiltrierten Lymphozyten in einem Maustumormodell vor. Die spezifische Verfolgung des Zustroms von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen mit Durchflusszytometrie zeigt die Dynamik der phänotypischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen während der Antitumor-Immunantwort.

Tumortransplantation zur Beurteilung der Dynamik tumorinfiltrierender CD8+ T-Zellen in Mäusen

Dieser Artikel beschreibt einen Workflow von Techniken, die zum Testen neuartiger Kandidatenmediatoren von Melanommetastasen und deren Wirkmechanismus eingesetzt werden.

Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Erfahren Sie die adoptive Übertragung von NAMPT-inhibierten Tumor-assoziierten Neutrophilen in tumortragende Mäuse. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung anti-angiogener Eigenschaften und das Potenzial neutrophiler Immuntherapien.

Transfer von manipulierten Tumor-assoziierten Neutrophilen in tumortragende Mäuse zur Untersuchung ihres angiogenen Potenzials in Vivo (Video) | JoVE Journal

Transfer von manipulierten Tumor-assoziierten Neutrophilen in tumortragende Mäuse zur Untersuchung ihres angiogenen Potenzials in Vivo

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