Name: Real-Time, halbautomatisierte Fluoreszenzmessung der Luftbogenoberfläche Liquid pH der primären menschlichen Luftweg-Epithelzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Erfahren Sie eine halbautomatisierte Methode zur Echtzeitmessung des pH-Werts der Luftbogenoberflächenflüssigkeit in primären menschlichen Atemwegsepithelzellen. Diese Technik ermöglicht die Bewertung neuer Therapeutika bei chronischen Atemwegserkrankungen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch zwei Stipendien des CF Trust Strategic Research Centre (SRC003 und SRC013) und ein Stipendium des Medical Research Council (MRC) Confidence in Concept (MC_PC_15030). Unterstützt wurde JG durch ein Stipendium der Medical Research Foundation (MRF-091-0001-RG-GARNE). MB wurde unterstützt von einem Medizinischen Forschungsrat Clinician Scientist Fellowship (MR/M008797/1). IH wurde unterstützt von einem Wellcome Trust Clinical Training Fellowship (203520/Z/16/Z). Die Forschung wurde vom National Institute for Health Research Newcastle Biomedical Research Centre mit Sitz in Newcastle Hospitals NHS Foundation Trust und Newcastle University unterstützt. Die geäußerten Ansichten sind die der Autoren und nicht unbedingt die des NHS, des NIHR oder des Gesundheitsministeriums. Die Primärzellen von Dr. Randell wurden durch das Stipendium der Cystic Fibrosis Foundation (BOUCHE15R0) und das NIH-Stipendium (P30DK065988) unterstützt.

Primäre Nicht-CF (n = 3 Spender, Im Alter von 34, 27 und 23 Jahren) und CF (n = 3 Spender, alle F580del/F508del; 40, 440, 41, unbekannt) waren hAECs ein freundliches Geschenk von Dr. Scott H. Randell (Marsico Lung Institute, The University of North Carolina at Chapel Hill, United States) und waren obtai Im Protokoll #03-1396, das von der University of North Carolina im Chapel Hill Biomedical Institutional Review Board genehmigt wurde. Die Zellen wurden nach den zuvor veröffentlichten Methoden mit den von Fulcher und Randell 35,36beschriebenen Wachstums-und Differenzierungsmedien angebaut.
1. Probenvorbereitung
<ol><li>Wachsen Sie die primären hAECs auf einem Durchmesser von 6,5 mmhalbdurchlässige Stützen (Materialtabelle) für mindestens 28 Tage an derLuft flüssig, wie zuvor beschrieben35,36.</li>
	<li>Bereiten Sie 50 ml sterile Lösung von HCO3 vor -mit Krebs Pufferlösung (HCO 3- KRB,Konzentrationen werden in mM NaHCO3 (25) NaCl (115), KCl (5), CaCl 2 (1), MgCl2 (1), D-glucose-5) gegeben). Und Filtersterilize mit einem 0,2 μm Spritzenfilter.</li>
	<li>Ändern Sie das bäuerliche Medium auf ein frisches Differenzierungsmedium, wie in 1.135,36beschrieben. NOTE: Es hat sich gezeigt, dass die basolaterale Glukosekonzentration ASLpH 33beeinflusst. In dieser Phase kann der Glukosegehalt des Basolateralraums durch gepufferte Lösungen bekannter Glukosekonzentrationen gesteuert werden.</li>
	<li>Waschen Sie die apische Oberfläche der Zellen, indem Sie 150 μL HCO3- KRB hinzufügen und bei 37 ° C 20 Minuten inkubieren, 5% CO2.</li>
	<li>Entfernen Sie die apische Wäsche, ohne das Epithel zu stören, indem Sie es vorsichtig mit einem sterilen Glas Pasteur-Pipet und einer sterilen P200-Pistinspitze, die mit einer Aspirationspumpe verbunden ist, die ein Vakuum in der Sammelflasche erzeugt, saugen. In dieser Phase sollte möglichst wenig Flüssigkeit auf der apischen Oberfläche verbleiben, um die luftflüssigkeitsoberflächliche Schnittstelle wiederherzustellen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen für weitere 30 Minuten bei 37 ° C, 5% CO2.</li>
</ol>2. Hintergrundmessung
<ol><li>Schalten Sie den Plattenleser und den Computer ein.</li>
	<li>Öffnen Sie das Armaturenbrett.</li>
	<li>Klicken Sie auf Spark 10M,öffnen Sie die Temperaturregelung und setzen Sie auf 37 ° C. Öffnen Sie die Gassteuerung und setzen Sie den CO2 bis 5%.</li>
	<li>Warten Sie, bis Temperatur und CO2 ihre Ziele erreicht haben.</li>
	<li>Öffnen Sie die Plattenleser-Schublade, legen Sie die Feuchtigkeitskassette mit 6 ml dH2 O aufjeder Seite gefüllt. Stellen Sie sicher, dass Deckel und Boden der Platte sauber sind – wenn nicht, sauber mit 70% Ethanol auf einem Stück Gewebe-und legen Sie die Platte in die Feuchtigkeitskassette. NOTE: Während des gesamten Experiments wird der Deckel der Gewebekultur auf dem Teller aufbewahrt und nur beim Hinzufügen von Medikamenten oder beim Wechsel des bäuerlichen Mediums entfernt, die in einer Gewebekultur laminare Strömungshaube durchgeführt werden, um die Kulturen in einer sterilen Umgebung zu halten.</li>
	<li>Öffnen Sie den Spot-Methode-Editor und stellen Sie die Parameter auf der Software wie folgt fest:<ol>
<li>Wählen Sie die passende Plattenschablone (für die halbdurchlässigen Stützen mit 6,5 mm Durchmesser, wählen Sie die 24 Brunnenplatten) und die Brunnen, die während dieses Experiments überwacht werden.</li>
		<li>Fügen Sie eine Temperatur und eine CO 2-Steuerung hinzu und stellen Sie sie auf 37 ° C bzw. 5%. Zecken Sie das Warten auf temperature/Gaskästen .</li>
		<li>Fügen Sie ein kinetisches Loop-Panel hinzu und wählen Sie die Dauer als Loop-Typ aus und setzen Sie sie auf 5-10 min. Hinweis: Der Zeitpunkt des kontinuierlichen Lesens hängt von der Anzahl der gut/mierten Bedingungen ab. 5 min ist lang genug für 6-12 Brunnen, während eine Vollplatte mit 24 Bedingungen 10 Minuten kontinuierliche Messungen erfordert.</li>
		<li>In der kinetischen Schleife zwei "Fluoreszenzintensität"-Panels mit Hilfe der Drag-and-Drop-Funktion, die für die pH-empfindlichen bzw. pH-unempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffe eingerichtet wird. Setzen Sie Anregung und Emissionswellenlängen auf 560 bzw. 590 nm, für den pH-empfindlichen Farbstoff bzw. 495 bzw. 520 nm für den pH-unempfindlichen Farbstoff.</li>
		<li>Stellen Sie die Anzahl der Blitze auf 30 und die z-Position auf 33200 für jedes Fluorophor. Hinweis: Die z-Positions-und Gain-Einstellungen sind abhängig von den Eigenschaften des Plattenlesers. Stellen Sie den Gewinn manuell auf einen Wert, der hoch genug zählt, so dass die Unterschiede zwischen den Samples aufgenommen werden, aber niedrig genug, so dass die Zugabe eines Agonisten keine Werte aus dem Bereich der Erkennung generiert.</li>
		<li>Stellen Sie das Multi-Resen pro gut auf den Benutzer, der als Kreistyp von 3 × 3 Größe mit einer Grenze von 4750 μm definiert ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klicken Sie auf den Startknopf, um eine Hintergrundmessung zu erstellen und OK, um den Deckel der Feuchtigkeitskassette zu bestätigen.</li>
	<li>Am Ende der Messung öffnen Sie die Plattenleser-Schublade, nehmen Sie die Platte heraus und legen Sie den Zellsit zurück in den Inkubator, während Sie die fluoreszierende Farbstoffmischung Lösung vorbereiten.</li>
	<li>Bereiten Sie die Leuchtstofffleisch-Mix-Lösung vor, indem Sie 2 μL von 1 mg/mL dextran-gekoppelte pH-sensitive (pHsens) Leuchtstofffarbstoff auf 0,2 μL hinzufügen. Von 10 mg/mL dextrangekoppelten pH-unempfindlichen (phins) fluoreszierenden Farbstoff und 0,8 μL sterilen HCO3- KRB für ein Finale Volumen von 3 μL pro Zustand. Hinweis: Das Gesamtvolumen der Farbstoffmischlösung sollte für n Brunnen + 1 vorbereitet werden, wenn es zwischen 1 und 10 Proben gibt, oder n Brunnen + 2, wenn es zwischen 11 und 24 Proben gibt. Dextran-gekoppelte Farbstoffe werden in filter-steriler HCO3- KRB-Lösung rekonstituiert, bei-20 ° C alitiert und gelagert. Jede Chemikaliekann in dieser Phase für eine 16-24 h Inkubationszeit 37 auf der apischen Oberfläche hinzugefügt werden. Chemikalien sollten als 0,1x aufbereitet werden, da das endgültige Volumen, nach der Aufnahme der überschüssigen Flüssigkeit durch die Kultur, wird etwa 0,3 μL für eine 6,5 mm Durchmesser halbdurchlässige Unterstützung.</li>
	<li>Fügen Sie vorsichtig 3 μL Farbstoffmischung (siehe 2,8) auf die apische Oberfläche der Zellen und inkubieren Sie über Nacht bei 37 ° C, 5% CO2.</li>
</ol>3. Kinetische Messung
<ol><li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1 bis 2.4, um den Plattenleser vorzubereiten.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Open Icon und wählen Sie die Methodendatei aus, die für die Hintergrundmessungen verwendet wird.</li>
	<li>Halten Sie den Loop-Typ im kinetischen Loop-Top als Dauer und setzen Sie ihn auf 08 Stunden. Ändern Sie den Intervall-Typ auf Fixed und setzen Sie ihn auf 5 Minuten. Halten Sie die Fluoreszenz-Intensität der Panels wie bei den Hintergrundmessungen Hinweis: Der Intervalltyp für Hintergrundmessungen ist auf "nicht definiert" gesetzt, um ein kontinuierliches Lesen zu ermöglichen. Auch für kinetische Experimente und Kalibrierungsversuche wird der Intervalltyp mit einem Intervall von 5 min auf "fixiert" gesetzt. Dies lässt sich je nach Ausgestaltung des Experiments und Anzahl der Bedingungen anpassen.</li>
	<li>Öffnen Sie die Teller Lesegeräte; Die Feuchtkassette mit 6 ml dH2 O aufjede Seite geben. Stellen Sie sicher, dass der Deckel und der Boden der Platte sauber sind – wenn nicht, sauber mit 70% Ethanol auf einem Stück Gewebe-und legen Sie die Platte in die Feuchtigkeitskassette mit ihrer Abdeckung.</li>
	<li>Beginnen Sie die Fluoreszenz-Lesungen, indem Sie auf Start klicken. Klicken Sie auf OK, nachdem Sie den Deckel der Feuchtigkeitskassette sicher haben.</li>
	<li>Nach n Zyklen, in der Regel zwischen 12 und 24, was 1 bis 2 Stunden entspricht, klicken Sie auf Pause, um das Experiment zu unterbrechen. Nehmen Sie die Platte heraus und wenden Sie alle Drugs/Agonisten basolateral auf die verschiedenen Proben. Hinweis: Wenn die Zellen aus dem Plattenleser herausgenommen werden, entweicht CO2 , was zu einer Erhöhung des ASL-pH-Wertes führt, wie ein Rückgang der pH-empfindlichen Farbstofffluoreszenz zeigt. Dieser CO2-induzierte pH-Wechsel kehrt sich innerhalb von 10-15 Minuten nach dem Einlegen der Kulturen wieder in den Plattenleser.</li>
	<li>Legen Sie die Platte zurück in die Feuchtigkeitskassette auf das Tablett, positionieren Sie den Feuchtigkeits-Kassettendeckel neu und klicken Sie auf Weiter, um ASL pH weiter zu erfassen und die Wirkung der Drugs/Agonisten auf ASL pH zu überwachen.</li>
</ol>4. In situ pH-Kalibrierung
<ol><li>Den Teller aus dem Teller nehmen.</li>
	<li>Aspiration die basolaterale medium/Lösung.</li>
	<li>Fügen Sie 750 μL und 1 μL hochgepufferte Standardkurvenlösungen in das Basolateralfach bzw. die apische Oberfläche ein. Hinweis: Hochgepufferte Standardkurvenlösungen enthalten (in mM) NaCl (86), KCl (5), CaCl 2 (1,2), MgCl 2 (1.2), NaHEPES oder MES oder Tris (100 mM). Verwenden Sie MES, um Lösungen mit einem pH-Wert von weniger als 7, NaHEPES für Lösungen von pH 7-7.5 und Tris für die Lösung mit pH 8 zu puffern. Klemmen Sie den pH-Wert mit HCl auf den gewünschten Wert.</li>
	<li>Schalten Sie den CO2 auf den Plattenleser oder setzen Sie ihn auf 0,1% und legen Sie die Platte wieder in die Feuchtigkeitskassette.</li>
	<li>Richten Sie den Plattenleser mit den gleichen Parametern ein, wie zuvor beschrieben, aber ohne CO 2 wie in Schritt 3.2.</li>
	<li>Beginnen Sie die Fluoreszenzwerte, alle 5 Minuten für 1-1,5 Stunden.</li>
</ol>5. Bewertung der Wirkung von Farbstoffkonzentration und Aufhängungsvolumen auf Kalibrierungsdaten
<ol><li>Bereiten Sie genug pH-empfindliche und unempfindliche Farbstoffgemisch vor, um die Fluoreszenz auf mindestens 4 verschiedene pH-Werte in 3 verschiedenen Volumina zu erfassen. NOTE: Hier wurde Mix 1 mit 26 μL pH-sensitive (1 mg/mL) und 2,6 μL pH-insensitive (10 mg/mL) und Mix 2 mit 13 μL pH-sensitive (1 mg/mL) und 1,3 μL pH-insensibel (10 mg/mL) vorbereitet.</li>
	<li>Verteilen Sie 2,2 μL oder 1,1 μL Mix 1 bzw. Mix 2 in 12 Brunnen einer 96-Brunnenplatte und fügen Sie genügend Kalibrierungslösungen hinzu, um endgültige Volumina von 50, 100 oder 200 μL zu erhalten und gut zu mischen. NOTE: In diesem Setup werden Fluoreszenzzählungen für Konzentrationen von Farbstoffen von 5 μg/mL (in 200 μL), 10 μg/mL (in 100 oder 200 μL), 20 μg/mL (in 50 oder 100 μL) oder 40 μg/mL (in 50 μL) erfasst.</li>
	<li>Schalten Sie den Plattenleser ein, stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C ein und legen Sie die Platte in den Plattenleser. Schalten Sie den CO2-Controller nicht ein. Achtung: Da es sich um ein kurzes Experiment handelt und nur genügend Zeit benötigt, um die Temperatur auszugleichen, ist die Feuchtigkeitskassette nicht erforderlich.</li>
	<li>Passen Sie die z-Position an und gewinnen Sie für die 96-Brunnenplatte und verwenden Sie die gleichen Parameter wie für das Experiment, das auf halbdurchlässigen Stützen durchgeführt wird.</li>
</ol>6. Datenanalyse
<ol><li>Speichern Sie alle Daten in Tabellenkalkulationen und erstellen Sie eine neue Datei.</li>
	<li>Wählen Sie in der Hintergrunddatei alle mittleren Daten für jede sample/Bedingung für beide Wellenlängen aus, kopieren und fügen Sie sich in die neue Datei ein. Berechnen Sie den mittleren Hintergrund für jeden Brunnen und jede Wellenlänge.</li>
	<li>Wiederholen Sie dies mit den Kalibrierungs-und kinetischen Daten und subtrahieren Sie den Hintergrund von jedem Datenpunkt für jede Wellenlänge.</li>
	<li>Berechnen Sie für jeden Zeitpunkt und jede Probe das Verhältnis zwischen pH-sensibler und pH-unempfindlicher Fluoreszenz</li>
	<li>Wenn alle Proben von einem einzelnen Spender erhalten wurden, berechnen Sie den Mittelwert der Verhältnisse zu jedem Zeitpunkt der Kalibrierkurve NOTE: Es ist wichtig, so viele Kalibrierkurven zu generieren wie Spender oder Basolaterallösungen. In der Tat können diese Parameter die Hintergrundwerte oder die Rate der Aufnahme der Flüssigkeit beeinflussen, was wiederum die Farbstoffkonzentration und damit den berechneten pH-Wert beeinflussen wird.</li>
	<li>Generieren Sie für jeden Zeitpunkt eine Standardkurve aus den Verhältnissen, indem Sie die bekannten pH-Werte auf der x-Achse und die Verhältnisse auf der y-Achse zeichnen.</li>
	<li>Bestimmen Sie den Zeitpunkt, an dem die Verhältnisse stabil sind, passen Sie zu einer linearen Regressionslinie und erhalten Sie die Gleichung für diese Linie.</li>
	<li>Berechnen Sie aus den kinetischen Daten den pH-Wert für jeden Zeitpunkt und zeichnen Sie den pH-Wert auf der y-Achse und die Zeit auf der x-Achse aus. Hinweis: Die Wiederherstellung des pH-Wertes kann berechnet werden, indem man Datenpunkte über die stabile Messung des pH-Wertes vor dem Zusatz eines Agonisten oder eines anderen Eingriffs durchschnitt. Die Wirkung eines Agonisten kann durch die Berechnung der Differenz im pH-Wert vor und nach (einer bestimmten Zeitspanne) der Behandlung oder durch die Anpassung einer nicht-linearen Kurve an die Datenpunkte direkt nach dem Eingriff gekennzeichnet werden. Dies gibt zusätzliche Informationen über den t 1/2 und den Maximalwert. Schließlich können die Versauerungs-oder Alkalinierungsraten auch aus dem Hang einer geraden Linie gewonnen werden, die an den ersten Punkten nach dem Eingriff angebracht ist.</li>
</ol>

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MB: Nicht im Zusammenhang mit dieser Arbeit: Investigator-geleitete Forschungsstipendien von Pfizer und Roche Diagnostics; Sprechergebühren, die von Novartis, Roche Diagnostics und TEVA an die Newcastle University gezahlt werden. Reisekosten für pädagogische Treffen von Boehringer Ingelheim und Vertex Pharmaceuticals.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die dynamische Messung von ASL pH in primären menschlichen Atemweg-Epithelzellen zur Verfügung. Zu den kritischen Schritten gehören das Abwaschen des Schleims von der apischen Oberfläche der Zellen, die Messung und Subtraktion des Hintergrundes mit den gleichen Parametern wie im Experiment, die Optimierung der z-Position sowie der Gewinn und die Durchführung einer pH-Kalibrierung vor Ort.
Der erste Schritt des Waschen der Zellen ist entscheidend, da eine dicke Schleimschicht (i) verhindern kann, dass die Farbstoffe die Perimisilismisere (PCL) erreichen und (ii) die Erkennung von Veränderungen der Fluoreszenz als Reaktion auf Agonists/Inhibitoren verzögern oder verhindern. Unsere Methode wurde entwickelt, um zu untersuchen, wie primäre hAECs die Aktivität von HCO3- und H+ Transportern als Reaktion auf Agonisten moduliert. Während es interessant sein wird zu untersuchen, wie sich Veränderungen im PCL-pH-Wert auf Veränderungen im SchleimpH-Wert beziehen, ist eine Weiterentwicklung dieses Protokolls notwendig, einschließlich der Verwendung verschiedener molekularer Gewichtsdextrans, um die 2 Schichten und Z-Scans durch die Ganz ASL.
Die Hintergrundmessung ist ein weiterer wichtiger Schritt dieses Protokolls. Die apische Oberfläche der vollständig differenzierten Primärluftwege-Epithelia ist selten völlig flach, was den Lichtweg und damit den Hintergrund beeinflussen wird. Die Sicherstellung, dass die Hintergrundwerte in den gleichen lokalen Punkten der Brunnen durchgeführt werden wie während des Experiments, ist entscheidend für die Reproduzierbarkeit und Stabilität der Aufnahmen.
Die Optimierung der z-Position und des Gewinns sind notwendige Schritte, die für jede unterschiedliche Konzentration von fluoreszierenden Farbstoffen, die verwendet werden, eingerichtet werden müssen. Dadurch wird eine hohe Experimentiervariabilität verhindert. Sobald wir eingerichtet sind, liefert unser Test stabile und reproduzierbare Ergebnisse. Einer der Gründe dafür ist, dass die Farbstoffe auf der apischen Oberfläche auf den Zellen in einem kleinen Flüssigkeitsvolumen, das leicht vom Epithel wieder aufgenommen wird, zugesetzt werden, so dass ein homogen beschriftetes ASL entsteht. Eine andere Methode, um die ASL zu beflecken, die ebenso erfolgreich sein kann, verwendet trockenes Pulver oder eine "Suspendierung" in PFC. Obwohl dies zeitsparend sein könnte (da die Experimente in der Regel innerhalb von 2 Stunden durchgeführt werden), ist es unwahrscheinlich, dass die trockenen Farbstoffe vollständig in der ASL lösen und somit könnten Form Klumpen. So werden unterschiedliche Konzentrationen von pH-empfindlichen Farbstoffen über der Oberfläche der epithelialen Zellen gefunden.
Die pH-Kalibrierung in situ ist ein wichtiger Schritt, um genaue, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Wie im Ergebnisabschnitt gezeigt und erläutert, werden sich die Unterschiede in den ASL-Volumina auf die Fluoreszenzzahlen und damit auf die interpolierten pH-Werte (Abbildung 2 und Abbildung3) auswirken. Während verschiedene Gruppen bisher ASL-pH-Messungen veröffentlicht haben, wurde auch zwischen verschiedenen Studien, die von der gleichen Gruppe8,17veröffentlicht wurden, ein breites Spektrum an Werten erreicht. Wir glauben, dass die Ergebnisse reproduzierbarer werden, wenn sie vor Ort kalibrieren. Im Vergleich zu anderen pH-Kalibrierungstechniken, die die hohe K+/nigericin-Methode(oder mehrere Ionophoren) verwenden, um die Standardkurve 28,29, 30zuerzeugen,hatder hier vorgestellte Test den Vorteil, dass Solange jeder Schritt in einem Sicherheitsschrank durchgeführt wird, können die Zellen, die für ASL pH verwendet werden, gewaschen, aufbewahrt und für andere Experimente wiederverwendet werden, sofern die durchgeführten Behandlungen die Epithelzellen nicht irreversibel beeinflussen.
Die Entwicklung und Optimierung dieses Tests hat reproduzierbare Ergebnisse geliefert, und wir glauben, dass diese Methode anderen Gruppen mit ihrer ASL-pH-Messung helfen wird. Diese Technik hat aber auch einige Einschränkungen durch die Einrichtung und die Art der Zellen, die verwendet werden. Die Überwachung des pH-pH-Wertes über einen längeren Zeitraum als der hier vorgestellte (& gt;8-10 h) könnte sich als schwierig erweisen, da eine langfristig hohe Luftfeuchtigkeit die Geräte beschädigen könnte und die Tatsache, dass die meisten Plattenleser nur die Möglichkeit bieten, kinetische Messwerte über eine Bestimmte Zeit (typischerweise 24 Stunden). Der Einsatz von vollständig differenzierten primären hAECs ist von entscheidender Bedeutung, da verschiedene Differenzierungsstufen den Ausdruck von HCO3- und H+-Transportern beeinflussen. Es gibt jedoch praktisch keine Möglichkeit, das Volumen von ASL in Zellen, die unter Dünnschichtbedingungen gewachsen sind, genau zu kontrollieren. Wie in den Protokoll-und Ergebnisabschnitten angegeben, werden sich die Volumenänderungen auf das Fluoreszenzverhältnis auswirken, und es ist leider davon auszugehen, dass in Zellen, die aus einer einzigen Person stammen, am selben Tag auf verschiedenen halbdurchlässigen Stützen, ASL-Volumina, gesät werden. Wird gleich sein. Ausgenommen aus dieser Einschränkung, wird jeder Agonist oder Inhibitor, der die Flüssigkeitssekretion oder-absorption beeinflussen wird, das ASL-Volumen und vermutlich die Fluoreszenzverhältnisse beeinflussen. In unserem Test wird die Kalibrierkurve jedoch am Ende des Experiments durchgeführt, so dass wir davon ausgehen können, dass diese Volumenänderungen die Kalibrierungsverhältnisse in der gleichen Weise beeinflussen werden wie während des kinetischen Experiments. Aus diesem Grund raten wir Gruppen, die an der Entwicklung dieses Tests interessiert wären, mindestens 2-3 Replikate pro geprüfter Bedingung zu verwenden, da dies die Einrichtung einer Standardkurve für jede Bedingung ermöglichen wird.
Hier stellen wir einen einfachen, halbautomatisierten Test vor, der eine Echtzeitmessung des pH-pH-pH-pH-Wermuttes unter Dünnschichtbedingungen ermöglicht. Sie hat die Fähigkeit, dynamische pH-Reaktionen in vielen Kulturen nahezu zeitgleich zu untersuchen, die einen Vergleich zwischen und innerhalb der Spender ermöglichen. Eine Aufwertung dieser Methode auf ein 96-Brunnenplatten-Format mit polarisiertem System (HTS 96 well plates)38 würde als Medikamentenentdeckungsuntergang noch einen noch höheren Durchsatz bieten. Darüber hinaus haben wir gezeigt, wie diese Technik verwendet werden kann, um die akute Wirkung von Agonisten auf ASLpH zuuntersuchen, und wir haben bereits veröffentlicht, dass diese Methode verwendet werden kann, um die langfristige Wirkung eines apischen Protonenpumpenhemmern auf CF hAECs ASL 39 zu untersuchen. Da sich gezeigt hat, dass pH-Wert Infektionen, Entzündungen, Schleimviskosität und Ionentransport regulieren, wird die Identifizierung molekularer Ziele, die pH-Wert erhöhen können, in den Forschungsbereichen chronischer Lungenerkrankungen wertvoll sein, und diese Technik wird potenziell die Entwicklung des Arzneimittelscreening in der personalisierten Medizin. Da die Dysregulation in der Säure-Base-Homöostase bei anderen Krankheiten eine große Rolle spielt, kann dieses Protokoll mit Optimierungsschritten an verschiedene Geräte (Plattenleser) und Zelltypen, wie andere Epithelzellen, angepasst werden. Extrakelluläre Säure ist ein Merkmal vonKrebs 40,41,42 und dieser Test könnte dabei helfen, festzustellen, wie feste Tumoren einen niedrigen pH-Wert produzieren oder als Test für ein niedrig durchlässiges Arzneimittelscreening verwendet werden könnten. Wiederherstellung der pH-Homöostase. Ebenso wie bei chronischen Atemwegserkrankungen könnte sie auch eine Plattform für die Entwicklung eines personalisierten medizinischen Ansatzes bieten.

Das Ufay-Epithel wird von einer dünnen (~ 10 μm) Flüssigkeitsschicht bedeckt, die als Luftwegoberflächenflüssigkeit (ASL) bezeichnet wird. Die Zusammensetzung und Tiefe (Hydration) dieser ASL ist streng reguliert und kontrolliert die Effizienz der Atemwege durch die Mucociliary Rolltreppe1,2,3,4. In den letzten Jahren wurde die Bedeutung des ASLH +/HCO3- Inhalt von verschiedenen Gruppen aufgrund seiner Fähigkeit, ASL-Hydratation5, Atemwegentzündung 6 und Infektion 7 zu regulieren,nachgewiesen, 8 sowie Schleimviskosität8,9. Wichtig ist, obwohl es einige Kontroversen gibt, viele Studien berichteten von einer Dysregulation des pH-Wertes bei chronischen Atemwegserkrankungen wie Asthma10, 11, 12,COPD11, Bronchiectasis11, chronische Rhinosinusitis13,14 und zystische Fibrose (CF)5, 9,15,16, 17,die Andeuten, dass Therapien, die ASL-pH-Wert wiederherstellen, nützlich sein könnten, um mehrere Arten von chronischen Atemwegserkrankungen zu behandeln. CF ist die häufigste autosomal-rezessive genezessive Erbkrankheit in kaukasischen Populationen und ist auf Mutationen im CF Transmembran-Leitungshandlungsregler (CFTR) zurückzuführen. Dieses Gen kodiert einen Anionkanal (HCO3- und Cl-), der eine entscheidende Rolle im Ionen-und Flüssigkeitstransport und bei der HomöostaseüberEpithelia 18 spielt. Obwohl CF eine Multiorganerkrankung ist, ist die Lungenpathologie die Hauptursache für MorbiditätundMortalität 19,20und wenn man bedenkt, dass der primäre Defekt in CFein beeinträchtigter Transport von Cl-und HCO3-ist, Man kann vermuten, dass extrazelluläre Flüssigkeit pH bei Menschen mit CF wird dysreguliert im Vergleich zu Menschen, die nicht CF haben. So ist die Messung von ASL pH ein aktueller Bereich der CF-Forschung und verschiedene Gruppen haben Techniken entwickelt, um ASL pH in CF zu messen Airways.
In vivo wurde der pH-Wert der Luftfahrt mit verschiedenen Techniken gemessen, von Mikrosonden (Glasfaser-, Gold-oder Mobidiumsonden)5,21,22, 23,24 biszu pH-Messungen von Erwartbares Material oder ausgeatmete Atemkondensat (EBC)10,11,12,25,26,27. Im Forschungsbereich CF wird der pH-Wert aufgrund seiner möglichen klinischen Implikationen umfassend untersucht. Theoretisch könnte eine alkalische Verbesserung der Atemwege die bakterielle Tötung erhöhen und die Homöostase der Schleimhaut und der Atemwege insgesamt verbessern. In vivo/ex-vivo-Studien wird jedoch von einer breiten Palette von pH-Werten berichtet, und bis heute sind die Ergebnisse nicht schlüssig, was das Vorhandensein eines Unterschieds im pH-Wert zwischen Nicht-CF-und CF-Luftwegen betrifft. Anfang der 2000er Jahre meldeten verschiedene Gruppen den pH-Wert der EBC. In nicht erkrankten Gruppen lagen die pH-Werte zwischen 4,6 und 8,5, aber interessanterweise wurde EBC pH bei Verschärfungen bei Menschen mit CF12,27saurergefunden. In jüngerer Zeit haben in vivo Messungen der ASL in Mensch und Tier Modelle der CF berichtet widersprüchliche Ergebnisse 16,17, 21,22,23 , 24 und es ist immer noch unklar, ob CF-Atemwege saurer sind als nicht-CF-Luftwege.
Da sich in vivo die Messung des unteren ASL-pH-Wertes als schwierig erwiesen hat, da die Atemwege sehr gering sind und das Vorhandensein von Schleimhautstecker bei Krankheiten besteht, haben sich viele Gruppen an In-vitro-Experimente gewandt, um ASL-pH-Maßnahmen zu messen, vor allem mit drei verschiedenen Methoden. Der erste Ansatz verwendet dextrangekoppelte zell-impernbare pH-empfindliche Fluoreszenzfarbstoffe,die als Trockenpulver hinzugefügt werden, entweder direkt in die ASL oder durch die Verwendung einer Inertflüssigkeit namens Perfluorkohle (PFC)5,8,16 , 17 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. Diese Technik bietet jedoch wenig Kontrolle über die genaue Menge des Farbstoffs, der den Kulturen zugesetzt wird, und birgt die Gefahr von Farbstoffaggregaten und großen Konzentrationsunterschieden zwischen Proben und/oder Experimenten und sogar innerhalb derselben Probe. . Es wurde auch in der Regel mit einem konfokalen Mikroskop durchgeführt, das seine Anwendbarkeit einschränkt und in vielen Fällen eine detaillierte Überwachung mehrerer Proben und Veränderungen der Aufzeichnungsbedingungen verhindert. Die zweite Methode zur Messung von ASL pH ist der Einsatz von pH-empfindlichen Mikroelektroden5,15. ASL-pH-Messungen sind daher nicht von der fluoreszierenden Farbstoffkonzentration abhängig und sollten robustere und reproduzierbare Ergebnisse liefern. Diese Methode erlaubt jedoch keine dynamischen Echtzeitmessungen des ASL-pH-Wertes und ist auch nicht einfach, mehrere Messwerte unter verschiedenen Bedingungen durchzuführen. Es handelt sich auch um ein arbeitsintensives, komplexes Verfahren, das eine spezielle Ausrüstung (Mikroelektrodenfabrikation/elektrophysiologische Aufzeichnungsgeräte) und eine Schulung für die Sammlung der Proben für die anschließende pH-Messung und-Kalibrierung erfordert. Darüber hinaus haben diese beiden Techniken auch einige Ungereimtheiten in der Fähigkeit gezeigt, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen: Mit der pH-empfindlichen Leuchtstofffarbstoffmethode, Tang et al. berichtete Werte von 7,35 für Nicht-CF ASL und 7.0für CF ASL 8, während in einem mehr Zuletzt wurde der ASL pH von der gleichen Gruppe mit 6,9 und 6,4 für Nicht-CF und CF,jeweils 17, bewertet. In ähnlicher Weise gaben Mikroelektrodenmessungen in einer Studie von 2003 15 Werte von 6,4 in non-CF ASL und 6,1 in CF ASL, während die gleiche Gruppe in einer Studie von 20135Werte von 6,7 für Nicht-CF ASL und 6,45 für CF ASL meldete. Schließlich fügen die Forscher im dritten Ansatz eine relativ große Menge schwach gepufferter Lösungen auf die apische (Schleimhaut) Oberfläche der Kulturen hinzu, wodurch dünne Filmbedingungen zerstört werden und die ASL-Zusammensetzung verändert wird, und möglicherweise auch ihre Regulierung. Der pH-Wert wird dann entweder mit pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffen 33, durch eine pH-stat-Tittrationsmethode in einer Ussing-Kammer13, 14,gemessenoder erfordert, dass der verdünnte ASL aus den Kulturen entfernt und pH mit einem pH gemessen wird. Elektrode,Analysator oder Lackmu-Streifen 34. Eine weitere Schwierigkeit bei der genauen Messung des ASL-pH-Wertes ist die Etablierung einer möglichst genauen Standardkurve. In der Tat, ob die Messwerte mit einer Elektrode durchgeführt werden, die den Unterschied des elektrischen Potenzials über ein Harz oder mit pH-empfindlichen Leuchtstofffarben messen wird, werden beide Ansätze durch die lokale Mikroumgebung der Proben beeinflusst werden. gemessen. Genauer gesagt kann die Dissoziationskonstante (Kd) der Farbstoffe je nach Temperatur, ionischer Stärke, Viskosität sowie möglichen Wechselwirkungen des Farbstoffs mit zellulären Bestandteilen wie Proteinen und potentiellem Schleim erheblich variieren.
Um zu versuchen, viele dieser technischen Probleme zu überwinden und eine dynamischere, einfachere und höhere Durchsatzmethode zu entwickeln, haben wir eine In-vitro-Technik entwickelt, die ASL pH in primären hAEC-Kulturen mit einem zellimpernlichen pH-sensiblen Leuchtstofffarbstoff in einem handelsüblichen Plattenleser. Die Methode erzeugt reproduzierbare, dynamische, halbautomatische Echtzeitmessungen des ASL pH voll differenzierter 3D-Zellkulturen unter Dünnschichtbedingungen. Durch den Einsatz eines mehrwell-Plattenlesers kann dieser halbautomatische Test nahezu gleichzeitige pH-Messungen für bis zu 24 Bedingungen über 12 h durchführen und die Wirkung verschiedener Agonisten oder Inhibitoren überwachen. In diesem Beitrag beschreiben wir die Methodik im Detail und berichten repräsentative Ergebnisse unter positiven und negativen Kontrollbedingungen, die die Technik bestätigen.

<table><tbody><tr><td>0,2 &Mikro; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>Starlab</td><td>E4780-1226</td><td></td></tr><tr><td>6,5 mm Transwell mit 0,4 & Mikro; m Pore Polyester Membran Einsatz</td><td>Corning</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>CFTRInh172</td><td>RnD Systems (Tocris)</td><td>3430</td><td>Stammkonzentration: 50 mM; Endkonzentration: 20 &Mikro; M</td></tr><tr><td>Costar 24-Well-Clear-TC-behandelte Multi-Well-Platten</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>dextrangekoppelter pH-unempfindlicher Fluoreszenzfarbstoff: AlexaFluor488-dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>Stammkonzentration: 1 mg/ml; Endkonzentration: 0,67 mg/ml</td></tr><tr><td>dextrangekoppelter pH-empfindlicher Fluoreszenzfarbstoff: pHrodo-dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>P10361</td><td>Stammkonzentration: 1 mg/ml; Endgültige Konzentration: 0,67 mg/ml</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>RnD Systems (Tocris)</td><td>1099</td><td>Stammkonzentration: 50 mM; Endkonzentration: 10 &Mikro; M</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 Well Platten</td><td>Cellstar</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Humidity Kassette</td><td>TECAN</td><td>30090495</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaHepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser: TECAN SPARK 10M TECAN</td><td></td><td>30086375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Universal pH Elektroden DJ 113</td><td>VWR</td><td>662-1385</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time, halbautomatisierte fluoreszenzmessung der luftbogenoberfläche liquid ph der primären menschlichen luftweg-epithelzellen

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In den letzten Jahren wurde die Bedeutung der Schleimhautoberfläche pH-Wert in den Atemwegen durch ihre Fähigkeit, die Flüssigkeit (ASL) der Atemwege zu regulieren, die Flüssigkeit, die Viskosität und die Aktivität der antimikrobiellen Peptide, Schlüsselparameter, die bei der angeborenen Verteidigung der Lunge. Dies ist von primärer Relevanz im Bereich chronischer Atemwegserkrankungen wie der zystischen Fibrose (CF), wo diese Parameter dysreguliert sind. Während verschiedene Gruppen ASL pH sowohl in vivo als auch in vitro untersucht haben, berichten ihre Methoden von einer relativ breiten Palette von ASL-pH-Werten und sogar widersprüchlichen Befunden über etwaige pH-Unterschiede zwischen NichtCF und CF-Zellen. Darüber hinaus liefern ihre Protokolle nicht immer genügend Details, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, die meisten sind niedriger Durchsatz und erfordern teure Geräte oder Fachwissen, um sie umzusetzen, was sie in den meisten Labors schwierig zu etablieren macht. Hier beschreiben wir einen halbautomatisierten Leuchtstoffplattenleser-Assay, der die Echtzeitmessung von ASL pH unter Dünnschichtbedingungen ermöglicht, die der In-vivo-Situation näher kommen. Diese Technik ermöglicht stabile Messungen für viele Stunden von mehreren Atemwegskulturen gleichzeitig und, was wichtig ist, können dynamische Veränderungen im ASL-pH-Wert als Reaktion auf Agonisten und Inhibitoren überwacht werden. Um dies zu erreichen, werden die ASL der vollständig differenzierten primären menschlichen Atemwegepithelzellen (hAECs) über Nacht mit einem pH-empfindlichen Farbstoff befleckt, um die Rücknahme der überschüssigen Flüssigkeit zu ermöglichen, um dünne Folienbedingungen zu gewährleisten. Nachdem die Fluoreszenz in Anwesenheit oder Abwesenheit von Agonisten überwacht wird, wird die pH-Kalibrierung vor Ort durchgeführt, um die Volumen-und Farbstoffkonzentration zu korrigieren. Die beschriebene Methode bietet die erforderlichen Kontrollen, um stabile und reproduzierbare ASL-pH-Messungen zu machen, die letztlich als Medikamentenentdeckungsplattform für die personalisierte Medizin verwendet werden könnten, sowie an andere epitheliale Gewebe und experimentelle Zustände, wie entzündliche and/oder Wirt-Erreger-Modelle.

Die oben beschriebene Technik ermöglicht die dynamische Messung von ASL pH in bis zu 24 separaten primären hAECs Kulturen. Abbildung 1 zeigt ein Schema der Hauptschritte und der Einrichtung. Die abendverzierten Zellen werden in einen CO2 -und temperaturgesteuerten Plattenleser gelegt, in dem alle 5 Minuten Fluoreszenz von dextran-gekoppelten pH-empfindlichen und pH-unempfindlichen Farbstoffen aufgezeichnet wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische ASL-pH-Messmethode. Nach dem Waschen der Kulturen und der Durchführung einer Hintergrundlektüre werden die primären menschlichen Atemweg-Epithelzellen (hAECs) ASL über Nacht bei 37 ° C, 5% CO2mit dextran gekoppelten pH-empfindlichen und pH-unempfindlichen Farbstoffgemisch beladen. Am darauffolgenden Tag wird die Platte auf eine Temperatur und CO2-gesteuerter Plattenleser übertragen und die Fluoreszenz von beiden Farbstoffen wird im Laufe der Zeit aufgezeichnet. Nach dem Experiment wird eine In-situ-Kalibrierung durchgeführt und Daten analysiert und im Laufe der Zeit als ASL-pH dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
Zunächst untersuchten wir die Auswirkungen verschiedener Volumina und Farbstoffkonzentrationen auf die Fluoreszenzzahlen und damit auf das Verhältnis 560/495. In der Tat ist der Zweck, den pH-unempfindlichen Farbstoff zu addieren, die Variabilität in der ASL-Beladung zu korrigieren. Es war jedoch wichtig, diese Annahme zu testen und zu bewerten, ob wir eine Standard-Kalibrierungskurve verwenden können, die in Ermangelung von Zellen in einer 96-Brunnenplatte für alle Experimente und Zelltypen durchgeführt wurde. Wir haben die Fluoreszenzzahlen von über 1 h in 50, 100 oder 200 μl Kalibrierungslösungen (bei pH 5,6,6,7 oder 8) mit 5, 10, 20 oder 40 μg/mL Farbstoffen überwacht. Die Ergebnisse werden in Abbildung 2A-C dargestelltund zeigen, dass bei dem gleichen pH-Wert und der gleichen Farbstoffkonzentration das gemeldete pHsens/pHins-Emissionsverhältnis (560/495 auf der y-Achse) je nach Volumen (Abbildung2A) unterschiedlich ist. Zusätzlich ergeben unterschiedliche Farbstoffkonzentrationen bei gleichem pH-Wert und gleichem Volumen unterschiedliche Verhältniswerte (Abbildung 2B). Daher wirken sich Veränderungen der Volumen-oder Farbstoffkonzentration auf den absoluten Wert des pH-Wertes aus dem Emissionsverhältnis aus. Abbildung 2C zeigt , dass die Zeit für die Temperaturausgleich etwa 15-20 min beträgt. Um die Wirkung von Farbstoffkonzentration und-volumen auf die Emissionsverhältnisse zu bestätigen, haben wir Fluoreszenz von Farbstoffen aufgenommen, die in der ASL der primären Nicht-CF und CF hAECs vor Ort geladen wurden. Wir haben dann die Kalibrierung durchgeführt und die Ergebnisse analysiert, indem wir (1) aus allen Proben eine globale Standardkurve generiert haben oder (2) für jeden Zelltyp (Non-CF und CF) zwei unabhängige Standardkurven erzeugt haben. ASL pH von beiden Zelltypen wurden dann mit der Zeit (Abbildung 3A, B) und durchschnittlich (Abbildung 3C) gezeichnet. Die pH-Werte, die aus einer einzigen globalen Standardkurve gewonnen wurden, zeigten einen signifikanten Unterschied zwischen den nicht-CF-und den CF-Kulturen (Abbildung 3A,C), während ASL-pH-Wert bei der Berechnung aus dem pH-Wert nicht signifikant zwischen CF und Nicht-CF hAECs unterschied. Unabhängige Standardkurven (Abbildung 3B,C). Diese Ergebnisse zeigen, wie wichtig es ist, unabhängige Kalibrierkurven für jedes Experiment und im Rahmen des Experiments, für jede Spenderprobe zu erzeugen, denn wenn die Kalibrierkurven zusammen gemittelt wurden, wurden in den CF-Kulturen höhere pHsens/pins-Verhältnisse gefunden. , mit einem saureren pH-Wert (Abbildung 3C).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig2v4.jpg"> Abbildung 2: Optimierung der pH-Kalibrierung in vitro. Verschiedene Lösungsvolumina des bekannten pH-Wertes, die unterschiedliche Farbkonzentrationen enthielten, wurden auf eine 96-Brunnenplatte geladen und die Fluoreszenz wurde über1 h aufgezeichnet. Die Ratios wurden mit pH-Wert für Zeit-Punkt 24 min. (C) Die Neigung der Veränderung der Fluoreszenz wurde für jede Lösung berechnet und als Funktion der Zeit (in min) gezeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig3.jpg"> Abbildung 3: Optimierung der Analyse der pH-Kalibrierung auf primären hAECs vor Ort. (A) repräsentative Spuren des ASL-pH-Wertes, die aus einer einzigen Standardkurve stammen, die Daten aus Nicht-CF und CF-Kulturen durchschnitt. B) repräsentative Spuren des ASL-pH-Wertes, die aus einer unabhängigen Standardkurve gewonnen werden, die an Nicht-CF oder CF-Kulturen durchgeführt wird. Jeder Datensatz wurde aus der eigenen Kalibrierkurve berechnet. C) Bewertung der Unterschiede im ASL-pH-Wert zwischen NichtCF und CF-Kulturen als Funktion der Kalibrierung. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM aus n=3 Experimenten dar, 2-Wege ANOVA, Sidak es multiple Vergleiche Test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
Um unsere Technik weiter zu validieren, brauchten wir dann eine positive Kontrolle, um zu zeigen, dass die Technik in der Lage war, eine "erwartete" Veränderung des ASL-pH-Wertes zu erkennen. Da das Vorhandensein eines saureren ASL in CF-Zellen immer noch umstritten ist, haben wir den cAMP-Agonisten Forskolin als positive Kontrollbedingung eingesetzt, um die HCO3- Sekretion durch CFTR zu stimulieren. Die zu erwartenden Ergebnisse würden eine forskolininduzierte Alkalinisierung des ASL in Nicht-CF-Zellen zeigen, die in CF-Zellen je nach Schwere der Mutationen weitgehend reduziert oder abgeschafft würde. Abbildung 4A zeigt repräsentative Spuren des ASL-pH-Wertes von Nicht-CF-Zellen und CF-Zellen im Laufe der Zeit und Abbildung 4B zeigt die Mitteldaten des ASL-pH-Wertes vor und nach der Behandlung mit Forskolin in beiden Zelltypen. Aus diesen Ergebnissen können wir unterschiedliche Informationen erhalten. Erstens war der ruhende ASL-pH-Wert, wie bereits in Abbildung 3B,Cgezeigt, nicht zwischen Nicht-CF und CF-Epithelie zu unterscheiden. Zweitens zeigten die ersten 3-4 Zeitpunkte nach dem Aussetzen des Experiments zur Behandlung der Zellen mit Forskolin einen großen Anstieg des pH-Wertes, der sich innerhalb von ~ 15 min erholte. Dies war auf den Rückgang der CO2-Konzentration zwischen dem Plattenleser zurückzuführen (5%) Und der Sicherheitsschrank für Gewebekultur (~ 0%). Nach der Henderson Hasselbalch Gleichung entspricht ein pH-Wert von 7 in einer 5% CO 2-Umgebung einer Konzentration von HCO 3- von ~ 9,3 mM. Wenn die Zellen aus dem Plattenleser entfernt werden, führt ein Rückgang der CO2-Konzentration auf 0% theoretisch zu einer Erhöhung des pH-Wertes von &amp; gt;8. Abbildung 4A zeigt, dass ASL pH auf ~ 7.8 anstieg, was durch den Zeitverzug der Neupositionierung der Platte im Plattenleser (d.h . in einer 5% CO2-Umgebung ) erklärt werden kann. Schließlich, wie vorhergesagt, die Zugabe von Basolateral 10 μM forskolin (Fsk) deutlich erhöht ASL pH nur in Nicht-CF-Kulturen. Wie verschiedene Gruppen gezeigt haben, dass es einen Unterschied in der Gleichgewichtung ASL pH zwischen CF und Nicht-CF-Epithelie gibt, wollten wir weiter untersuchen, ob es in unseren Experimenten keinen pH-Unterschied gibt und welche Rolle CFTR spielt. Dazu haben wir mit dem speziellen CFTR-Inhibitor CFTR inh172 (172) nicht-CF-Kulturen vorinkubiert. Wie im Protokollabschnitt 2.8 angegeben, wurde der Farbstoffmix wie oben angegeben vorbereitet und der Inhibitor bei einer Konzentration von 0,1X = 2 μM hinzugefügt. Der Literatur zufolge beträgt die ASL-Höhe der Nicht-CF-Zellen etwa 10 μm. Bei einer halbdurchlässigen Stütze von 6,5 mm Durchmesser ist das theoretische Volumen des ASL daher × 3,25 2 = 0,3 μL. Durch die Zugabe von 3 μL Farbstoff + 172 bei 2 μM wird die Konzentration des Inhibitors nach der Aufnahme der überschüssigen Flüssigkeit theoretisch 20 μM (1x, gewünschte Konzentration) betragen. Repräsentative Spuren in Abbildung 4C und eine mittlere Zusammenfassung in Abbildung 4D zeigen, dass 172 den ASL-pH-Wert nicht reduziert hat, sondern die forskolinbedingte Erhöhung des ASL-pH-Werses verhindert hat, was unsere Ergebnisse bestätigt, die wir aus Nicht-CF gegen CF gewonnen haben. Kulturen und die weitere Validierung unserer Technik.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig4v5.jpg"> Abbildung 4: Dynamische ASL-pH-Messung als Reaktion auf CFTR-Aktivierung durch Forskolin. (A) Repräsentative Spuren der Wirkung von Forskolin (Fsk, 10 μM) auf die Kinetik des ASL pH im Laufe der Zeit in Nicht-CF und CF hAECs. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM von n=3 Experimenten dar. (B) Zusammenfassung der Wirkung von Fsk auf ASL pH in Nicht-CF und CF Kulturen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD aus n=69 Nicht-CF-Kulturen und 35 CF-Kulturen dar (2-Wege-ANOVA, Sidak es multiple Vergleiche Test). C) Repräsentative Spuren der Wirkung von CFTRinh172 (172,20 μM) auf den von der Fsk-induzierten Anstieg des ASL-pH-Wertes bei den nicht-CF-HAECs. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM aus n=5 Experimenten dar. D) Zusammenfassung der Wirkung von 172 auf die Fsk-induzierte Alkalinisierung des ASL in nicht-CF-Kulturen. Die Daten stellen den Mittelwert ± SEM aus n=5-Experimenten dar (2-Wege-ANOVA, Sidak es multiple Vergleiche Test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>
Schließlich können, wie es im Protokollabschnitt 6.8 heißt, die Raten der sauren Kalkalinisierung berechnet werden, indem eine lineare Regression an die ursprünglichen Zeitpunkte nach dem Eingriff angesetzt wird. Abbildung 5A zeigt, dass das Entfernen der basolateralen HCO 3- haltige Lösung (HCO3- KRB) und deren Ersetzung durch eine HEPES-gepufferte Lösung, in Ermangelung von CO2,zu einer deutlichen Versauerung des ASL führte. Dies steht im Einklang mit dem Mangel an HCO 3- hemmend transpigem HCO3- Sekret, das die konstitutive Protonensekretion durch diese Atemwegszellen ermöglicht, ASL pH15, 17 stetig zu reduzieren. Interessanterweise war die anfängliche Versauerungsrate von Nicht-CF-Zellen deutlich langsamer als die CF-Kulturen(Abbildung 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig5.jpg"> Abbildung 5: Dynamische Änderungen im ASL-pH-Wert als Reaktion auf HCO3- Entfernung. (A) Repräsentative Spuren, die die Wirkung von HCO3- Entfernung auf die Kinetik des ASL pH im Laufe der Zeit in Nicht-CF und CF hAECs zeigen. Die anfänglichen Versauerungsraten wurden über die Steigung einer geraden Linie erreicht, die nach dem Entfernen von HCO3zu 7 Zeitpunkten montiert war. Die Daten stellen die Mittel ± SEM von n=6 und 7 Experimenten auf NichtCF und CF-Kulturen dar. B) Zusammenfassung der Anfangsraten der Versauerung nach HCO3- Entfernung. Die Daten stellen die Mittel ± SEM von n=6 und 7 Experimenten über NichtCF bzw. CF-Kulturen dar (Mann-Whitney-Test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Wir stellen ein Protokoll vor, um dynamische Messungen der Atemwegsflüssigkeit pH unter Dünnschichtbedingungen mit einem Plattenleser zu machen.

Real-Time, halbautomatisierte Fluoreszenzmessung der Luftbogenoberfläche Liquid pH der primären menschlichen Luftweg-Epithelzellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Unser Protokoll ist das erste, das die dynamische Messung der Luftweg-Oberflächenflüssigkeit oder ASL-pH-Wert in Echtzeit sowohl unter Ruhe- als auch nach Agonisten- oder Inhibitorbehandlung ermöglicht. Diese Methode hilft, Ionenkanäle und Transporter zu identifizieren, die an der extrazellulären pH-Regulierung beteiligt sind, und könnte auf andere Zellsysteme angewendet werden, in denen dies wichtig ist, wie Krebs. Im Vergleich zu zuvor veröffentlichten Methoden ist diese neue Technik relativ einfach durchzuführen.Es erfordert keine spezielle Ausrüstung. Und kann ASL pH-Messungen gleichzeitig in mehreren Kulturen unter Luftflüssigkeitsschnittstelle oder Dünnschichtbedingungen durchführen. Wichtig ist, dass diese neue Technik das Potenzial hat, die Auswirkungen neuer Therapeutika zu bewerten, nicht nur bei Mukoviszidose, sondern auch bei anderen chronischen Atemwegserkrankungen wie Asthma und COPD.Waschen Sie nach mindestens 28 Tagen Kultur die apikale Oberfläche einer menschlichen Atemwegsepithelzellkultur mit 150 Mikrolitern Bicarbonat, die Krebs-Pufferlösung enthalten, 20 Minuten lang auf dem Zellkultur-Inkubator. Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine sterile Glaspipette mit einer sterilen P200-Pipettenspitze, die mit einer Aspirationspumpe verbunden ist, um die Wäsche sorgfältig zu saugen, ohne das Epithel zu stören. Es sollte so wenig Flüssigkeit wie möglich auf der apikalen Oberfläche vorhanden sein, um die Luftflüssigkeitsschnittstelle wiederherzustellen.Dann geben Sie die Zellen für 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator zurück. Um eine Hintergrundmessung durchzuführen, schalten Sie den Plattenleser und den Computer ein. Klicken Sie nach dem Öffnen des Armaturenbretts auf Spark 10M und legen Sie die Temperaturregelung auf 37 Grad Celsius fest.Öffnen Sie dann die Gassteuerung und stellen Sie das Kohlendioxid auf 5%Wenn die Temperatur und das Gas ihre Ziele erreicht haben, öffnen Sie die Plattenleserschublade und legen Sie eine Feuchtigkeitskassette ein, die mit sechs Millilitern destilliertem Wasser auf jeder Seite gefüllt ist. Bestätigen Sie, dass der Deckel und der Boden der Zellkulturplatte sauber sind und legen Sie die Platte auf die Feuchtigkeitskassette, legen Sie den Deckel wieder auf und schließen Sie die Schublade. Öffnen Sie den Spark-Methoden-Editor, wählen Sie die entsprechende Plattenvorlage aus und wählen Sie die Bohrungen aus, die während des Experiments überwacht werden sollen.Fügen Sie ein Temperatur- und Kohlendioxid-Bedienfeld hinzu und stellen Sie die Panels auf 37 Grad Celsius bzw. 5 % fest. Dann markieren Sie das Warten auf Temperatur-/Gasboxen. Fügen Sie ein kinetisches Schleifenbedienfeld hinzu, und wählen Sie die Dauer als Schleifentyp aus.Legen Sie die Dauer auf fünf Minuten fest, und legen Sie den Intervalltyp des Experiments auf nicht definiert fest, um einen kontinuierlichen Messwert zu erhalten. Verwenden Sie innerhalb der kinetischen Schleife die Drag-and-Drop-Funktion, um zwei Fluoreszenzintensitätspanels hinzuzufügen, die individuell für die pH-empfindlichen und pH-unempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffe eingestellt werden. Stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlänge für den pH-empfindlichen Farbstoff auf 560 bzw. 590 Nanometer fest.Und 495 bzw. 520 Nanometer für den pH-unempfindlichen Farbstoff. Stellen Sie die Anzahl der Blitze auf 30 und die Z-Position auf 33, 200 für jedes Fluorophor. Legen Sie den Mehrfachlese-Code pro Bohrung auf benutzerdefinierte Sendefläche fest, als drei mal drei durch Kreis mit einem Rahmen von 4, 750 Mikrometern.Klicken Sie auf Starten, um den Hintergrundmesswert zu initiieren, und klicken Sie auf OKAY, um zu bestätigen, dass der Deckel der Feuchtigkeitskassette vorhanden ist. Übertragen Sie die Platte am Ende der Messung vom Plattenleser in einen Gewebekultur-Sicherheitsschrank und fügen Sie der apikalen Oberfläche der Zellen drei Mikroliter frisch zubereiteter dextran-gekoppelter Fluoreszenzfarbstofflösung hinzu. Dann kehren Sie die Platte über Nacht zum Zellkultur-Inkubator zurück.Öffnen Sie für die Kinetikmessung die Für die Hintergrundmessungen verwendete Methodendatei. Wenn alle Parameter eingestellt sind, öffnen Sie die Plattenleserschublade und legen Sie die Feuchtigkeitskassette ein. Legen Sie die saubere Platte in die Feuchtigkeitskassette mit ihrer Abdeckung und klicken Sie auf Start, um die Fluoreszenzmessungen zu initiieren.Klicken Sie dann auf okay, um zu bestätigen, dass der Deckel der Feuchtigkeitskassette an Ort und Stelle ist. Nach mindestens 12 Zyklen, klicken Sie auf Pause, um das Experiment zu unterbrechen und entfernen Sie die Platte, um alle Medikamente oder Agonisten auf die entsprechenden Proben aufzutragen. Geben Sie die Platte auf die Feuchtigkeitskassette auf dem Fach zurück und positionieren Sie den Deckel der Feuchtigkeitskassette neu, bevor Sie auf "Weiter" klicken, um den PH-Wert von ASL weiter aufzuzeichnen und die Wirkung der Behandlung zu überwachen.Für die in situ pH-Kalibrierung die Platte aus dem Plattenleser entfernen und die basolaterale Lösung ansaugen. Fügen Sie dem basolateralen Fach 750 Mikroliter hochgepufferter Standardkurvenlösung und der apikalen Oberfläche einen Mikroliter Lösung hinzu. Schalten Sie das Kohlendioxid am Plattenleser aus und geben Sie die Platte an die Feuchtigkeitskassette zurück.Stellen Sie dann den Plattenleser mit den gleichen Parametern ein, wie gezeigt, aber ohne Kohlendioxid, und starten Sie die Fluoreszenzmessungen alle fünf Minuten für ein bis eineinhalb Stunden. Wählen Sie für die Datenanalyse alle Mittelwertdaten für jede Probe und bzw. die Bedingung für beide Wellenlängen in der Hintergrunddatei aus, und kopieren Sie die Daten und fügen Sie sie in eine neue Datei ein. Berechnen Sie dann den mittleren Hintergrund für jeden Brunnen und jede Wellenlänge.Nach dem Kopieren und Einfügen der Kalibrier- und kinetischen Daten auf die gleiche Weise subtrahieren Sie den Hintergrund von jedem Datenpunkt für jede Wellenlänge. Berechnen Sie für jeden Zeitpunkt und jede Probe das Verhältnis zwischen dem pH-empfindlichen und dem pH-unempfindlichen Fluoreszenz. Generieren Sie für jeden Zeitpunkt eine Standardkurve aus den Verhältnissen und zeichnen Sie die bekannten pH-Werte auf der x-Achse und die Verhältnisse auf der y-Achse.Bestimmen Sie den Zeitpunkt, zu dem die Verhältnisse stabil sind, passen Sie eine lineare Regressionslinie an und erhalten Sie die Gleichung für diese Linie. Berechnen Sie dann den pH-Wert für jeden Zeitpunkt und zeichnen Sie den pH-Wert auf der y-Achse und die Zeit auf der x-Achse. In diesem repräsentativen Vorversuch ohne Zellen bei gleichem pH-Wert und gleicher Konzentration unterschieden sich die pH-empfindlichen und pH-unempfindlichen Emissionsverhältnisse je nach Volumen des Farbstoffs.Darüber hinaus lieferten unterschiedliche Farbkonzentrationen bei gleichem pH-Wert und gleichem Volumen unterschiedliche Verhältniswerte, was darauf hindeutet, dass Veränderungen der Volumen- oder Farbstoffkonzentration den absoluten Wert des aus dem Emissionsverhältnis berechneten pH-Wertes beeinflussen. Darüber hinaus beträgt die für den Temperaturausgleich benötigte Zeit ca. 15 bis 20 Minuten, unabhängig von Farbstoffvolumen oder Konzentration. DIE asL-pH-Werte, die aus einer einzigen globalen Standardkurve gewonnen wurden, zeigen einen signifikanten Unterschied zwischen nicht-mukovenen Fibrose- und Mukoviszidose-Kulturen.Während sich der ASL-pH-Wert nicht signifikant zwischen Mukoviszidose und nicht-mukovender Fibrose menschlicher Atemwegsepithelzellen unterscheidet, wenn der pH-Wert aus unabhängigen Standardkurven berechnet wird. Daher ist es wichtig, für jedes Experiment und in jedem Experiment, für jede Spenderprobe unabhängige Kalibrierkurven zu generieren, da bei zusammen gemittelten Kalibrierkurven höhere pH-empfindliche, pH-unempfindliche Verhältniswerte in Mukoviszidosekulturen gefunden werden, die auf einen saureren pH-Wert hinweisen. Wie erwartet, erhöht die Zugabe von basolateralem Forskolin den ASL-pH-Wert nur in nicht-mukovischen Fibrosekulturen signifikant.Da diese Zellen unter sterilem Zustand gehalten wurden, können sie gewaschen, wieder gefüttert und einige Tage später für zukünftige Experimente verwendet werden. Alle biologischen menschlichen Exemplare sollten als potenziell gefährlich angesehen werden. Achten Sie also darauf, je nach Proben die entsprechende Einschließungs- und persönliche Schutzausrüstung zu verwenden.Es ist wichtig, die Hintergrundmessungen und die pH-Kalibrierungen für jeden Satz von Proben durchzuführen, um die Variabilität zwischen den Spendern zu reduzieren und die Genauigkeit zu verbessern.

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Research

Forschung

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Biochemistry

Biochemie

Die Erkenntnisse und Schlussfolgerungen in diesem Bericht sind die der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die Ansichten der Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Technik für die Entnahme von ungestörten Schleimhaut Flüssigkeit aus den oberen Atemwegen. Es kann verwendet werden, die Quantifizierung der in Vivo -Level von Protein Mediatoren wie Zytokine und Chemokine, bei Patienten aller Altersgruppen durchführen.

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

Wir beschreiben ein Protokoll für ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell infizierter Atemwege, mit CFBE41o- Zellen, THP-1 Makrophagen und Pseudomonas aeruginosa, die an der Luft-Flüssig-Schnittstelle eingerichtet wurden. Dieses Modell bietet eine neue Plattform, um gleichzeitig die Wirksamkeit von Antibiotika, die Epithelbarrierefunktion und entzündungshemmende Marker zu testen.

P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

Beschrieben wird die Zellkultur und Expositionsmethode eines In-vitro-Bronchialmodells für eine realistische, wiederholte Inhalationsexposition gegenüber Partikeln für Toxizitätstests.

Ein Luft-Flüssig-Interface-Bronchial-Epithelmodell für realistische, wiederholte Inhalationsexposition gegenüber Luftpartikeln für Toxizitätstests

Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Expansion und Differenzierung nasaler Epithelzellen zu organotypischen Atemwegsepithelzellmodellen und die Quantifizierung der Zilienschlagfrequenz mittels Live-Cell-Bildgebung und maßgeschneiderten Skripten.

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Jüngste Fortschritte bei humaninduzierten pluripotenten Stammzelldifferenzierungsprotokollen ermöglichen die schrittweise Ableitung organspezifischer Zelltypen. Hier stellen wir detaillierte Schritte zur Erhaltung und Expansion von iPSC-abgeleiteten Atemwegsbasalzellen und deren Differenzierung zu einem mukoziliären Epithel in Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen zur Verfügung.

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Präparation und strukturelle Bewertung von Epithelzell-Monoschichten in einer physiologisch dimensionierten mikrofluidischen Kulturanlage

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Bestimmung der Ziliarfunktion und Membranundurchlässigkeit des pseudostratifizierten Lungenepithels der Atemwege

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Messung der Stickstoffmonoxidproduktion in Maus-Tracheal-Epithelzellkulturen, die an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche differenziert wurden

Erfahren Sie eine halbautomatisierte Methode zur Echtzeitmessung des pH-Werts der Luftbogenoberflächenflüssigkeit in primären menschlichen Atemwegsepithelzellen. Diese Technik ermöglicht die Bewertung neuer Therapeutika bei chronischen Atemwegserkrankungen.

Real-Time, halbautomatisierte Fluoreszenzmessung der Luftbogenoberfläche Liquid pH der primären menschlichen Luftweg-Epithelzellen (Video) | JoVE Journal

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