Name: Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie nukleäre Dynamiken in Schizosaccharomyces pombe während Mitose und Meiose durch Live-Zell-Mikroskopie untersuchen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtungen unter physiologischen Bedingungen.

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Die Autoren danken Natalia La Fourcade und Mon LaFerte dafür, dass sie die Erstellung dieses Manuskripts zu einem unterhaltsameren Unterfangen gemacht haben. Vielen Dank an die Mitglieder des Forsburg Lab, die mit ihrer Einsicht, Experimentierideen und moralischer Unterstützung zum Abschluss dieser Arbeit beigetragen haben. Dieses Projekt wurde von NIGMS R35 GM118109 bis SLF unterstützt.

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<li>Lee, J. Y., Kitaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%E2%80%99s+guide+to+rigor+and+reproducibility+in+fluorescence+imaging+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A beginner’s guide to rigor and reproducibility in fluorescence imaging experiments.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1519-1525 (2018).</li>
<li>Ohkura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis%3A+an+overview+of+key+differences+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Meiosis: an overview of key differences from mitosis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a015859(2015).</li>
<li>Sabatinos, S. A., Ranatunga, N. S., Yuan, J. P., Green, M. D., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+stress+in+early+S+phase+generates+apparent+micronuclei+and+chromosome+rearrangement+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication stress in early S phase generates apparent micronuclei and chromosome rearrangement in fission yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (19), 3439-3450 (2015).</li>
<li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li>
<li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li>
<li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+%28XPF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li>
<li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li>
<li>Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li>
<li>Forsburg, S. L., Rhind, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+methods+for+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Basic methods for fission yeast.</a> Yeast. 23 (3), 173-183 (2006).</li>
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<li>Tay, Y. D., Leda, M., Goryachev, A. B., Sawin, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+Cdc42+guanine+nucleotide+exchange+factors+for+fission+yeast+cell+polarity+are+coordinated+by+microtubules+and+the+Tea1%E2%80%93Tea4%E2%80%93Pom1+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Local and global Cdc42 guanine nucleotide exchange factors for fission yeast cell polarity are coordinated by microtubules and the Tea1–Tea4–Pom1 axis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), jcs216580(2018).</li>
<li>Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li>
<li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+secretory+cargo+transport+within+the+Golgi+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of secretory cargo transport within the Golgi apparatus.</a> Journal of Cell Biology. , jcb-201807194 (2019).</li>
<li>Kraft, L. M., Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mechanism+for+mitochondria-dependent+dynein+anchoring%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A conserved mechanism for mitochondria-dependent dynein anchoring.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbc-E18 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Live-Zell-Bildgebung während der Mitose und Meiose bietet die Möglichkeit, die Kerndynamik zu untersuchen, ohne die Spalthefephysiologie während der Datenerfassung wesentlich zu stören. Es ist jedoch Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass die Zellen zu den gewünschten Dichten ohne Umweltbelastungen heranwachsen; und für die Meiose, dass die Zellen während der Zeit der terminalen Differenzierung abgebildet werden und nicht zu früh oder spät. Überschüssige zelluläre Smenge, Hunger und unangemessene Wachstumstemperaturen sind häufige Faktoren, die zu unproduzierbaren Beobachtungen beitragen. Darüber hinaus ist es während der Dehnungskonstruktion entscheidend zu testen, dass fluoreszierende Tags die Funktionen von Zielgenen nicht beeinträchtigen und sich nicht auf die allgemeine Zellfitness auswirken. Wenn die Phänotypen von Stämmen, die fluoreszierende Marker tragen, nicht genau untersucht werden, kann dies zu inkonsistenten und unvergleichlichen Ergebnissen über ähnliche Genotypen führen.
Obwohl Mikroskop-Agarose-Pads einfach zu montieren sind, können sie auch eine Hürde darstellen, um wertvolle Bilddaten zu erhalten. Das Erstellen von Agarose-Pads ist so einfach wie das Parallelen von drei Mikroskopdias parallel zueinander, das Dosieren von geschmolzener Agarose auf dem mittleren Dia und das Platzieren eines Dias, das die Oberseite der anderen Dias transquert. Es ist jedoch sinnvoll, ein Schiebegerät zu montieren, das Breitenmodifikationen zur Herstellung widerstandsfähiger, situationsspezifischer Agarose-Pads ermöglicht. Ein einfacher Schieber, der Flexibilität bei der Padbreite bietet, besteht aus einer Plattform (Pipette-Spitzenhalter oder der Bank), zwei Mikroskopschlitten und Laborband, das als Pad-Breiten-Einstellmechanismus fungiert (Abbildung 1A). Die genaue Pad-Dicke hängt von den Anforderungen an die Bildzeit, der Agarose-Marke, der Temperatur, dem Abdeckschversiegelungsmittel, der Verdunstungsrate usw. ab. Daher ist es wichtig, das Bildgebungssystem vor der Datenerfassung zu kalibrieren, um die technische Reproduzierbarkeit zu erhöhen und die Qualität der Live-Zell-Bildgebung1,2,3zu verbessern. Pad-Oberfläche, Steifigkeit und Zusammensetzung sind bei längerer Bildaufnahme unerlässlich. Agarose hat eine geringe Hintergrundfluoreszenz, kann leicht geformt werden und hält bei entsprechender Konzentration strukturellen Verformungen durch Verdunstung stand. Darüber hinaus beeinträchtigt die Kombination von Spalthefemedien mit Agarose nicht die Bildqualität und ermöglicht eine erweiterte Beobachtung mehrerer Milben und Meiosezyklen. Außerdem ist es wichtig, Luftblasen für die Zeitraffermikroskopie zu vermeiden. Innerhalb der Agarose-Pads und innerhalb der Probe dehnen sich die Lufttaschen im Laufe der Zeit aus, was zu Zellverschiebungen und störenden Brennebenen führt. Sofern Zellen effizient durch deckungsfeste Rotation verteilt werden, können Forscher mitotische Prozesse über mehrere Generationen hinweg und meiotische Ereignisse von der Kernfusion bis zur Sporulation verfolgen. Die Herstellung und Auswahl des richtigen Pads für bildgebende Experimente braucht Zeit, um zu meistern, kann aber, sobald es erreicht ist, zu hochinformativen Mikroskopbeobachtungen beitragen.
Wie bei anderen Methoden ist die Live-Zell-Mikroskopie nicht frei von technischen Einschränkungen. Die Verwendung von fluoreszierend markierten Proteinen führt Grenzen für Experimente ein, die den Umfang dessen einschränken, was untersucht werden kann. Fotobleichungen und Fototoxizität sind typische Probleme der längeren Bildaufnahme. Sie können entgegenwirken, indem Zellen zu lange oder zu häufig kurzen Wellenlängen aussetzen. Für Experimente mit GFP, GFP, YFP, mRFP und DsRed, typischen fluoreszierenden Proteinen, die in der Spalthefe-Livezell-Bildgebung verwendet werden, ist es üblich, 5-15% Anregungslicht und 100-500 ms Expositionszeit für Routineexperimente einzusetzen. Diese Parameter ändern sich jedoch entsprechend den spezifischen Versuchsanforderungen des Forschers. Darüber hinaus reichen Z-Stacks, die aus 9-13 Abschnitten mit einem Abstand von 0,5 m mit einem 60-fachen Objektiv bestehen, aus, um die Dicke einer Spalthefezelle aufzulösen. Darüber hinaus ist es wichtig zu bestätigen, dass Fluoreszenzmarker die ordnungsgemäße Regulierung oder Funktion von Zielproteinen nicht stören oder falsche Phänotypen erzeugen. Daher ist es ratsam, Stämme zu konstruieren, die verschiedene Fluoreszenz- und Affinitäts-Tags für dasselbe Zielgen enthalten, um Beobachtungen mit unterschiedlichen Mitteln zu bestätigen. Darüber hinaus liegt es in der Verantwortung der Forscher, dafür zu sorgen, dass experimentelle Parameter experimentell reproduziert werden können und dass die gesammelten Daten für die nachgelagerte Analyse1,3geeignet sind. Keine Technologie kann die bewährte Praxis der sorgfältigen Validierung experimenteller Systeme durch eine sorgfältige Beobachtung und strenge Untersuchung der Linearität bei der Erkennung von Fluoreszenzsignalen ersetzen.
Schließlich ist es wichtig, Mikroskopiedaten in Formaten zu analysieren, die keine Rohbilder ändern. Fidschi bietet ausgezeichnete Dokumentationstools, um Rohdatenmessungen nachzuverfolgen, und ermöglicht es Forschern, verschiedene Zellparameter in einer einzigen Sitzung zu untersuchen. Diese Funktionen, sowie seine Fülle an Online-Tutorials und umfangreiche Literaturberichterstattung, machen Fidschi zu einem wichtigen Werkzeug für die Messung, Analyse und Präsentation von Live-Zell-Bildgebungsdaten, die die nukleare Dynamik von Spalthefe in Mitose und Meiose beschreiben.

Die Live-Zell-Mikroskopie ermöglicht es Forschern, die Kerndynamik zu untersuchen, ohne Spalthefezellen abzutöten, und eliminiert die Notwendigkeit tödlicher Fixierungen und Flecken. Es ist möglich, die Stabilität, Bewegung, Lokalisierung und das Timing von fluoreszierend markierten Proteinen zu beobachten, die an wichtigen Ereignissen wie Chromosomenreplikation, Rekombination und Segregation beteiligt sind, zusätzlich zu der Membran und dem Zytoskelett Bewegungen. Durch die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit und ungiftige Signalerkennung gibt es ein minimales physiologisches Eindringen. Bei sachgemäßer Behandlung kann diese Mikroskopiemethode verwirrende Effekte reduzieren, die sich aus der erweiterten technischen Handhabung oder aus der falschen chemischen Reaktivität ergeben. Darüber hinaus können Forscher während eines Experiments relevante Beobachtungen von Spalthefe-Ernährungs- und Stresszuständen, proliferativer Effizienz und apoptotischem Status machen, die auf unangemessene bildgebende Parameter oder abnorme Zellphysiologie hinweisen1 ,2,3.
Mitose und Meiose zeichnen sich durch nukleare und zelluläre Teilung aus. Bei der Meiose wird im Gegensatz zur Mitose der genetischeGehalt halbiert, da Elternzellen Tochterzellen 4 hervorrufen. Da die Live-Zell-Bildgebung zusätzlich zur räumlichen Beziehung eine zeitliche Dimension bietet, können viele Zellen in Echtzeit untersucht werden. Die Live-Zell-Mikroskopie hat es den Forschern ermöglicht, die Dynamik der Kernteilung mit fluoreszierenden Tags für Histone5, Kohäsin-Untereinheiten6, Mikrotubuli7, Zentromere8, Kinetochores9, Komponenten von Spindelpolkörper (SPB)10und die des Chromosomen-Passagierkomplexes (CPC)11. Außerhalb des Chromosomensegregationsapparates hat die Live-Zell-Bildgebung auch das Verhalten von Proteinen erfasst, die notwendig sind, aber nicht direkt an der Chromosomensegregation beteiligt sind. Die Funktion dieser Proteine hat gezeigt, dass die Replikation, Chromosomenrekombination, Kernbewegung und Chromosomenbindung an Mikrotubuli12,13,14beeinflussen. Diese Beobachtungen haben zu einem besseren Verständnis zellulärer Ereignisse beigetragen, deren funktionelle Komponenten nicht für biochemische oder genetische Untersuchungen geeignet waren. Mit neuen Fortschritten in der Mikroskopietechnologie werden Einschränkungen wie schlechte Auflösung, Photobleaching, Phototoxizität und Fokusstabilität abschwächen, wodurch bessere Echtzeitbeobachtungen der mitotischen und meiotischen Kerndynamik erleichtert werden1, 2,3. Meiose ist eine besondere Herausforderung, da es sich um einen terminalen Differenzierungspfad handelt, der eine genaue Aufmerksamkeit auf das Timing erfordert.
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine relativ einfache Methode zur Untersuchung der Kerndynamik von Echtzeitspalthefe bei Mitose und Meiose zu präsentieren. Um dies zu erreichen, ist es notwendig, Zellen zu verwenden, die nicht Umweltbelastungen ausgesetzt waren, Agarose-Pads vorzubereiten, die längeren Bildgebungen standhalten können, und Zellen an Dichten zu montieren, die die Visualisierung von Einzelzelldynamik erleichtern. Darüber hinaus verwendet dieses Protokoll Zellen, die fluoreszierend markierte Proteine tragen, die als nützliche Marker für die Kernkinetik (Hht1-mRFP oder Hht1-GFP), Chromosomensegregation (Sad1-DsRed), Zytoskelettdynamik (Atb2-mRFP), Aktivierung in G1/S (Tos4-GFP) und Kohäsionsstabilität in der Meiose (Rec8-GFP). Diese Methode führt auch zusätzliche kernnukleare und zytosolische Marker ein (Tabelle I), die in verschiedenen Kombinationen verwendet werden können, um Fragen zu bestimmten zellulären Prozessen zu beantworten. Darüber hinaus werden grundlegende Fidschi-Tools vorgestellt, um Forschern bei der Verarbeitung von Live-Zell-Bildern und der Analyse verschiedener Arten von Daten zu helfen. Die Stärke dieses Ansatzes ergibt sich aus der Verwendung von Echtzeitbeobachtungen der Proteindynamik, des Timings und der Stabilität, um Prozesse zu beschreiben, die für die ordnungsgemäße Ausführung von Mitose und Meiose integral sind.

<table><tbody><tr><td>60x Plan Apochromat Objektiv</td><td>Olympus</td><td>AMEP4694</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A-8751</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>7558B</td><td>IB4917-10 kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>Bauchtänzerin Rotator</td><td>Stovall</td><td>US Patent #4.702.610</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B-4501</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma</td><td>B-6768-5kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H20,Sigma</td><td></td> <td>C3306-500G</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma</td><td>C-0759</td><td></td></tr><tr><td>Convolve 3D-Software-Plug-in</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap HQ CCD-Kamera</td><td>Roper</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot; 5H20,END</td><td></td> <td>CX-2185-1</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision Dekonvolutions-Fluoreszenzmikroskop</td><td>GE Healthcare/Applied Precision</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Diffraction PSF 3D Software Plug-in</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen</td><td>Sonnenaufgang</td><td>2023; 1kg</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&middot; 6H2O</td><td>END</td><td>FX9259-04</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Barnstead</td><td>Thermo Lyne</td><td></td></tr><tr><td>Histidin</td><td>Sigma</td><td>H8125-100g</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Dekonvolutionssoftware</td><td>SVI</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Dekonvolutionssoftware</td><td>Bitplane</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Shell lab</td><td>#3015</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Iteratives Dekonvolve 3D-Software-Plug-in</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckvadt</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Sigma</td><td>L7387-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Leucin</td><td>Sigma</td><td>L8912-100g</td><td></td></tr><tr><td>Lysin</td><td>Sigma</td><td>L5626-500g</td><td></td></tr><tr><td>Malzextrakt (ME)</td><td>MP</td><td>4103-032</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H20</td><td>AMRESCO</td><td>0288-500G</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4,</td><td>Mallinckvadt</td><td>6192-02</td><td></td></tr><tr><td>Molybdische Säure</td><td>Sigma</td><td>M-0878</td><td></td></tr><tr><td>Na2S04 </td><td>Mallinckvadt</td><td>8024-03</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinsäure,Sigma</td><td></td> <td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>Pantothensäure</td><td>Sigma</td><td>P-5161</td><td></td></tr><tr><td>Paraffinwachs</td><td>Fisher</td><td>s80119WX</td><td></td></tr><tr><td>Pombe Glutamat Medium (PMG)</td><td>Sunrise</td><td>2060-250</td><td></td></tr><tr><td>softWorx v3.3 Bildverarbeitungssoftware</td><td>GE Healthcare</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sporulation Medium Pulver</td><td>Sunrise</td><td>1821-500</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturgesteuerte Zentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Allwgra 6KR Xentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>AMRESCO</td><td>0847-500g</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Equaline</td><td>F79658</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt plus Nahrungsergänzungsmittel (JA)</td><td>Sunrise</td><td>2011-1kg</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&middot; 7H2O</td><td>J.T.Baker</td><td>4382-04</td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung der mitotic and meiotic fission yeast nuclear dynamics durch fluoreszenz-livezellmikroskopie

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Die Live-Zell-Bildgebung ist eine Mikroskopietechnik, mit der die Zell- und Proteindynamik in lebenden Zellen untersucht wird. Diese bildgebende Methode ist nicht toxisch, stört in der Regel nicht die Zellphysiologie und erfordert eine minimale experimentelle Handhabung. Die niedrigen technischen Interferenzen ermöglichen es Forschern, Zellen über mehrere Zyklen der Mitose hinweg zu untersuchen und die Meiose von Anfang bis Ende zu beobachten. Mithilfe von fluoreszierenden Tags wie Green Fluorescent Protein (GFP) und Red Fluorescent Protein (RFP) können Forscher verschiedene Faktoren analysieren, deren Funktionen für Prozesse wie Transkription, DNA-Replikation, Kohäsion und Segregation wichtig sind. In Verbindung mit der Datenanalyse mit Fidschi (einer kostenlosen, optimierten ImageJ-Version) bietet die Live-Zell-Bildgebung verschiedene Möglichkeiten zur Bewertung von Proteinbewegungen, Lokalisierung, Stabilität und Timing sowie nuklearer Dynamik und Chromosomensegregation. Wie bei anderen Mikroskopiemethoden wird die Live-Zell-Bildgebung jedoch durch die intrinsischen Eigenschaften des Lichts begrenzt, die die Auflösungsleistung bei hohen Vergrößerungen begrenzen und auch empfindlich auf Photobleichungen oder Phototoxizität bei hoher Wellenlänge reagieren. Frequenzen. Mit einiger Sorgfalt können die Forscher diese physikalischen Einschränkungen jedoch umgehen, indem sie sorgfältig die richtigen Bedingungen, Dehnungen und fluoreszierenden Marker auswählen, um eine angemessene Visualisierung von mitotischen und meiotischen Ereignissen zu ermöglichen.

Hier präsentieren wir Live-Zell-Bildgebung, eine ungiftige Mikroskopiemethode, die es Forschern ermöglicht, das Proteinverhalten und die Kerndynamik in lebenden Spalthefezellen während Derose und Meiose zu untersuchen.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Die Live-Zellmikroskopie ermöglicht es Forschern, die Kerndynamik von Spalthefe bei Mitose und Meiose in Echtzeit zu untersuchen. Die Stärke dieser Methode liegt in der Untersuchung nuklearer Prozesse in lebenden Zellen unter normalen physiologischen Bedingungen, wodurch toxische Fixierungen und Flecken überflüssig werden. Diese Technik befasst sich mit Fragen im Zusammenhang mit Protein-Timing, Stabilität und Mobilität, die möglicherweise nicht für genetische oder biomechanische Manipulationen geeignet sind.Es ist wichtig, vor der Bildgebung genau auf die Gesundheit und Fitness von Spalthefezellen zu achten. Untersuchen Sie immer Morphologie und Wachstumsmerkmale, um die Konsistenz der Ergebnisse über Experimente hinweg zu gewährleisten. Dieses Protokoll zeigt die relativ einfache Möglichkeit, Mikroskopdias vorzubereiten, die bei korrekter Beherrschung die Konsistenz und Reproduzierbarkeit einer längeren Live-Zell-Bildgebung verbessern können.Um zellstoffabhängig von der kryogenen Aufwachplatte zu beginnen, streichen Sie sie auf JA-Platten und bebrüten sie bei 25 Grad Celsius oder 32 Grad Celsius, je nach Hefegenotyp, um Spalthefestämme aus der kryogenen Konservierung aufzuwecken. Verwenden Sie dann eine sterile Schleife, um Zellen aus einzelnen Kolonien in den erwachten Spalthefestämmen zu pflücken und sie in Reagenzgläser mit drei Millilitern YES flüssigem Medium zu impfen. Die Rohre bei 150 bis 220 U/min in einen Shaker geben, um über Nacht bei 25 oder 32 Grad Celsius zu wachsen, bis zur Späten Logphase mit einem gewünschten optischen Dichtewert von 0,7 bis 1,0.Übertragen Sie 10 Mikroliter der Kultur auf ein Mikroskopschlitten. Setzen Sie einen Deckelschlupf auf und legen Sie ihn unter ein Mikroskop, um nach der richtigen Zellmorphologie und dem Ernährungszustand zu suchen. Um ein Mikroskop-Dia für Mitose oder Meiose-Analyse zunächst zwei Gramm Agarose in den 500-Milliliter-Kolben mit 100 Millilitern entweder minimalen Medium plus Ergänzungen für Mitose oder flüssiges sporförmiges Medium für Meiose hinzufügen.Erwärmen Sie die Agarose-Lösung in einer Mikrowelle mit 60% Leistung in 10-Sekunden-Schritten oder legen Sie das Becherglas in einem 55 Grad Celsius Wasserbad für 10 Minuten. Wirbeln Sie die Lösung, um ein effizientes Schmelzen zu gewährleisten. Richten Sie zwei Mikroskopschlitten auf einem Pipettenspitzenhalter ein, wobei der obere Schlitten auf zwei Stapeln Laborband an beiden Enden ruht, um eine Querform zu bilden.Passen Sie den Abstand zwischen den beiden Dias auf mehr als zwei Millimeter an, um in den folgenden Schritten ein dickes Pad für eine längere Bildgebung zu bilden. Nach dem Abkühlen der geschmolzenen Agarose für eine Minute bei Raumtemperatur, entfernen Sie den oberen Schieber und verwenden Sie eine breite Bohrung Pipettenspitze, um 50 bis 100 Mikroliter auf dem unteren Schlitten zu verteilen, um einen Punkt zu machen. Bevor die Agarose abkühlt, legen Sie die obere Rutsche oben auf, um ein Streupad von etwa einem und 1/2 bis zwei Zentimetern Durchmesser zu erzeugen.Eine optimale Live-Zell-Bildgebung ist für nachfolgende Datenverarbeitungsschritte von entscheidender Bedeutung. Achten Sie darauf, Luftkugeln in der geschmolzenen Agarose zu beseitigen und ein dünnes Pad für Bildgebungszeiträume von mehr als vier Stunden zu erstellen. Zur Untersuchung mitotischer Ereignisse wachsen Zellen aus Starterkulturen entweder in flüssigem EMM oder PMG plus Ergänzungen über Nacht.Übertragen Sie einen Milliliter der Kultur in eine Küvette und messen Sie das Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 595 Nanometern. Das Zellwachstum gilt als Mid-Log-Phase, wenn die optische Dichte 0,4 erreicht. Zentrifugieren Sie dann einen Milliliter der Zellsuspension bei 1, 375 mal g für eine Minute.Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in minimalem Medium plus Ergänzungen zu einem endgültigen Volumen von 100 Mikroliter. Um meiotische Ereignisse zu bilden, wachsen Zellen aus Starterkulturen in minimalen Medien plus Ergänzungen über Nacht. Das Zellwachstum gilt als Spätpunktphase, wenn die optische Dichte bei 595 Nanometern zwischen 0,7 und eins liegt.Als nächstes erhalten aus den späten Log-Kulturen 500 Mikroliter jeder Mate-Typ-Stamm, H negativ und H positiv, und kombinieren, um eine Ein-Milliliter-Zellsuspension zu machen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1, 375 mal g für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter flüssigen Maltose-Extrakt.Wiederholen Sie die Maltose Extrakt waschen drei weitere Male, um eine effiziente Nährstoffentfernung zu gewährleisten. Nach dem letzten Maltose-Extrakt waschen Sie die Zellen in einem Milliliter Maltose-Extrakt wieder aussetzen und übertragen Sie die Mischung in einen 50-Milliliter-Kolben mit neun Milliliter Maltose-Extrakt. 12 bis 16 Stunden bei 22 bis 25 Grad Celsius bei einer minimalen Drehzahl zwischen 50 und 100 Umdrehungen pro Minute inkubieren.Das Auftreten vieler runder Spalthefeklumpen, die aus einer reichlichen Selbstflokulation resultieren, deutet auf eine effiziente Paarung hin. Als nächstes nehmen Sie eine Ein-Milliliter-Probe der Paarungskultur und Zentrifuge bei 1, 375 mal g für eine Minute. Entfernen Sie 750 Mikroliter des Überstandes und suspendieren Sie die Zellen im verbleibenden Überstand.Wirbel kräftig für fünf Sekunden, um die Klumpen zu stören. 20 Mikroliter einer mitotischen oder meiotischen Zellsuspension auf einem 2%Agarose-Pad verteilen. Entfernen Sie überschüssiges Medium, indem Sie das Dia umkehren und zwei bis drei Sekunden lang auf das fusselfreie Papiertuch legen.Drehen Sie die Folie und legen Sie vorsichtig einen Glasdeckel auf der Oberseite des Pads, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen zu erzeugen. Um eine Zellmonoschicht zu erstellen, drehen Sie den Coverslip im Uhrzeigersinn mit dem Zeigefinger für eine volle Drehung für Mitosezellen oder zwei volle Umdrehungen für Meiosezellen. Stellen Sie sicher, dass sich die Zellmaterie über das Agarose-Pad verteilt, was eine bessere Trennung einzelner Zellen oder Asci ermöglicht.Mit Hilfe eines kleinen Holzstabes geben geschmolzene Kohlenwasserstoff Dichtmittel entlang der Ränder des Deckelrutsches, um jedes Agarose-Pad zu versiegeln. Sobald das Agarose-Pad versiegelt ist, legen Sie es auf die Mikroskop-Bühne. Schalten Sie die Temperaturkammer ein und stellen Sie sie auf die gewünschte Temperatur ein.Legen Sie eine Platte mit einem nassen Papiertuch in die Kammer, um die Feuchtigkeit des Mikroskopsystems zu kontrollieren. Lassen Sie es für 10 bis 15 Minuten unter den entsprechenden bildgebenden Bedingungen ausdemieren. Dadurch können sich alle verbleibenden Luftblasen auflösen und alle Agaroseverschiebungen in letzter Minute auftreten.Verwenden Sie das 40X-Ziel, um geeignete Bildfelder zu finden. Wechseln Sie zum 60X-Ziel, um mit der Datenerfassung zu beginnen. Wählen Sie in der Software, die die Mikroskopfunktion steuert, die Mikroskopfiltersätze aus, die am besten zu den unter Beobachtung stehenden Fluorophoren passen.Passen Sie die Anregungswellenlängen an die verwendeten Fluorophore an, verwenden Sie die niedrigste Anregungsleistung, die ein konsistentes Signal erzeugt, und verwenden Sie Belichtungszeiten von vier bis acht Stunden, um akzeptable, aber quantifizierbare und reproduzierbare Bildgebungsdaten zu generieren. Sammeln Sie mindestens sechs Erfassungszeitpunkte pro Stunde. Wählen Sie in der Bildsammlungssoftware mindestens einen Fluoreszenzkanal aus, von dem datenerfasst werden soll, und verwenden Sie einen Z-Bestand aus 13 Abschnitten mit 0,5 Mikrometer Abstand.Laden Sie in der Fidschi-Software ein dekonvolvedes Bild hoch, indem Sie die Funktion Bio-Formats Importer unter dem Plug-In-Menü auswählen. Wählen Sie im Popup-Fenster Importoptionen Hyperstack, Standardfarbmodus aus, aktivieren Sie Autoscale und drücken Sie die Schaltfläche OK. Stellen Sie sicher, dass das angezeigte Fenster die richtige Anzahl von Fluoreszenzkanälen und Zeitrahmen enthält, indem Sie seitlich auf den entsprechenden Balken unten scrollen.Speichern als Tiff-Datei, die keine Daten komprimiert. Verwenden Sie dann im Menü Analysieren die Option Messungen festlegen, um verschiedene Parameter auszuwählen. Beispiel: Bereich, Min max Grauwert, Integrierte Dichte, mittlerer Grauwert, Median, Stapelposition, Umfang und Anzeigebeschriftung.Wählen Sie Farbe und klicken Sie auf das Kanalwerkzeug. Überprüfen Sie im Popup-Fenster Kanäle den Farbkanal, für den Intensität oder Fläche gemessen wird. Wählen Sie Bild, dann Tippen und klicken Sie auf 32-Bit.Wählen Sie die Funktionen Anpassen und Schwellenwert im Menü Bild aus. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Dunkles Hintergrund, wählen Sie die Standardmethode aus, und wählen Sie Rot aus, um die Interessensignale zu überlagern. Verwenden Sie das Zauberstab-Tool, um jede Struktur von Interesse hervorzuheben, und drücken Sie den Buchstaben T auf der Tastatur, um den ausgewählten ROI zum Popup-ROI-Managerfenster hinzuzufügen.Öffnen Sie anschließend den ZIP-ROI-Ordner, um den ROI-Manager zu laden, und klicken Sie auf jede ROI-Idliste im linken Seitenbereich. Wählen Sie Messen im Menü Analysieren aus, und wiederholen Sie diesen Befehl für jeden ROI-Bezeichner, um die Objekte zu quantifizieren, die für alle Slices des Image-Stacks von Interesse sind. Speichern Sie die Ergebnisse als CSV-Datei für die statistische Analyse.In dieser Studie, wenn Zellen aufgrund von Nährstoffbeschränkung oder Überwucherung verhungern, werden sie überschüssige Vakuolen und verminderte Zellgröße zeigen. Logarithmische Zellen zeigen aktive DNA-Replikation und Zellteilung sowie pannukleare Tos4-GFP-Expression und Sad1-DsRed-Foci-Trennung. Wenn sie sich nicht paaren, wie es der Fall ist, wenn Zellen nicht ausreichend an Stickstoff verhungern, wird sie daran gehindert, in die Meiose einzutreten.Es wird ein Paar Spaltzellen gezeigt, die sich einer Karyogamie unterziehen. Die robuste Flockung der Paarungszellsuspension erhöht die Zell-zu-Zell-Interaktion und weist somit auf eine erfolgreiche Paarung und effiziente meiotische Induktion hin. Zygotische Asci nehmen mehrere Formen an, einschließlich der Zick-Zack- und Bananenzellformen.Bei der Mitose, wenn Zellen von der Metaphase zur Telophase übergehen, beinhaltet die erste Veränderung eine Kontraktion der kerntechnischen Größe in der Metaphase, während die zweite die Zellspaltung während der Anaphase zeigt. Neben der gemeinsamen Trennung sergregiöser Zellen weisen meiotische Zellen bei der homologen Rekombination eine kernnukleare Oszillation auf und eine weitere Reduktion der Nukleoside am Ende der Anaphase II.It liegt in der Verantwortung der Forscher, sicherzustellen, dass Experimentierparameter experimenteübergreifend reproduziert werden können und dass die gesammelten Daten für die nachgelagerte Analyse geeignet sind. Die Live-Zell-Bildgebung hat es den Forschern ermöglicht, die Mechanik der nuklearen Teilung bei Mitose und Meiose genau zu untersuchen.Da fluoreszierende Tags und Mikroskopfähigkeiten die Anzahl und Art der Prozesse verbessern, die wir beobachten können, wird es zunehmen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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