Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Wir bieten produzierende Blutzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass wir konsistente und präzise Erträge hämogener Endothelzellen erhalten. Wir erwarten, dass unsere Plattform breite Anwendungen bei der Überwachung von Krankheiten und beim Screening auf therapeutische Verbindungen ermöglichen wird.

Diese Technik ist besonders vorteilhaft für die Hämatologie und ImmunologieForschung. Die Methode kann auf genetische Interventionen oder Genbearbeitung menschlicher Blutkörperchen angewendet werden. Es ermöglicht eine einfache Induktion von Vektoren in hämogene Endothelzellen.

Der wichtigste Punkt ist die LM511-E8-Beschichtung zur Eingabe von PSC-Kolonien. Wir empfehlen nicht, die Beschichtung zu überspringen oder durch eine andere Matrix zu ersetzen. Visuelle Demonstrationen sind wichtig, da wir zeigen möchten, wie die Zellen mit einem Dissoziationspuffer abspült werden und wie Platten mit LM511-E8 beschichtet werden.

Wachsen Sie menschliche pluripotente Stammzellen oder hPSCs auf eine LM511-E8-beschichtete Sechs-Well-Platte in mTeSR1-Medium auf 70 bis 80 % Konfluenz. Vier Tage vor der hämogenen Induktion das Medium ansaugen und zweimal mit PBS waschen. Spülen Sie die Zellen mit Dissoziationslösung, und inkubieren bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten.

Setzen Sie die Zellen im PSC-Wartungsmedium wieder auf und übertragen Sie die Suspension in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für drei Minuten. Aspirieren Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in PSC-Beschichtungsmedium wieder aus.

Die PSC-Aufhängung entsprechend den Manuskriptanweisungen auf ein mikrofabriziertes Kunststoffgefäß aufteilen und über Nacht inkubieren. Drei Tage vor der hämogenen Induktion die PSC-Sphäroide vorsichtig in ein 15-Milliliter-Konikonrohr pipetten und zwei Minuten bei Raumtemperatur ausstoßen, um durch die Schwerkraft auszufallen. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Sphäroide in Sphäroid-Beschichtungsmedium wieder auf.

Verteilen Sie die Suspension in eine LM511-E8 beschichtete 10-Zentimeter-Kulturschale mit einer Dichte von vier Sphäroiden pro Quadratzentimeter und brüten für drei Tage. Nach drei Tagen, aspirieren Sie das Medium, fügen Sie Tag Null Differenzierung Medium, und Kultur der Zellen für zwei Tage in einem hypoxischen Inkubator. Dann aspirieren Sie das Tages-Null-Medium, fügen Sie Tag zwei Differenzierung medium, und Kultur für weitere zwei Tage.

Zwei Tage später das Medium ansaugen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Spülen Sie die Zellen mit Dissoziationslösung und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Nach der Inkubation dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie sie sanft in einem Millimolar EDTA wieder aufsetzen.

Übertragen Sie die Suspension in ein 50 Milliliter konisches Rohr, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für drei Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit 300 Mikrolitern magnetischen Trennpuffer wieder auf. Fügen Sie 100 Mikroliter CD34-positive Mikroperlen zu den Zellen hinzu und mischen Sie sie vorsichtig durch Pipettieren.

Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten, dann verwenden Sie ein 40 Mikrometer Zellsieb, um die Suspension zu dehnen und trennen Sie die CD34-positiven Zellen mit einem magnetischen Separator. Geben Sie 0,5 Milliliter 5 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin-Beschichtungslösung in jeden Brunnen einer 24-Well-Kulturplatte und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten. In der Zwischenzeit zentrifugieren Sie die sortierten CD34-positiven Zellen bei 200 mal G für drei Minuten, und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter EHT-Medium wieder auf.

Bestimmen Sie die lebensfähige Zelldichte mit einem Zellzähler, und passen Sie die Zelldichte auf 200 000 Zellen pro Milliliter an, indem Sie EHT-Medium hinzufügen. Die Beschichtungslösung aus den fibronectinbeschichteten Brunnen ansaugen und entsorgen und 0,5 Milliliter CD34-positive Zellsuspension in jeden Brunnen geben. Inkubieren Sie die Zellen im hypoxischen Inkubator für eine Woche.

Um die schwimmenden Zellen zu sammeln, übertragen Sie das Kulturmedium auf ein 15 Milliliter konisches Rohr und Zentrifugen bei 200 mal G für drei Minuten. Dann den Überstand ansaugen. Um die anhaftenden Zellen zu sammeln, waschen Sie sie zweimal mit 0,5 Milliliter PBS und spülen Sie sie mit dissoziierendem Puffer.

Die überschüssige Flüssigkeit ansaugen und die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius bebrüten. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter Facs-Puffer wieder aus, und mischen Sie die schwebenden und anhaftenden Zellen. Zentrifugieren Sie die Mischzellen bei 200 mal G für drei Minuten, dann aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 50 Mikroliter Facs Puffer.

Anti-CD34- und Anti-CD45-Antikörper in 50 Mikroliter Facs-Puffer verdünnen; den Zellen hinzufügen und die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Dann waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, Zentrifugieren bei 200 mal G für drei Minuten nach jeder Wäsche. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 0,5 Milliliter Facs Puffer mit 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Dappy wieder aus.

Messen Sie den CD34- und CD45-Ausdruck nach Durchflusszytometrie. Um die hämatopoetischen Zellen zu sammeln, übertragen Sie das Kulturmedium auf eine 15 Milliliter konische Röhre. Sammeln Sie die verbleibenden Zellen, indem Sie den Brunnen zweimal mit PBS abspülen.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G für drei Minuten, dann aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren in einem Milliliter EHT Medium. Nach dem Zählen der Zellen, fügen Sie 10 000 Zellen zu drei Millilitermethylcellulose-Raummedien, ergänzt mit Antibiotika, und verwenden Sie eine 16-Spur-Spritze, um fünfmal zu mischen. Geben Sie die gesamte Medienaufhängung in jeden Brunnen einer Sechs-Well-Platte.

Um die Zellen feucht zu halten, fügen Sie Wasser oder PBS zu den leeren Brunnen auf der Platte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für zwei Wochen, um sicherzustellen, dass die Schale nicht gestört wird, da Kolonien bewegungsempfindlich sind. Zählen Sie nach zwei Wochen die Kolonien unter dem Mikroskop.

Zell morphologisch wechseln von endothelialer zu hämatopoetischen Zellen bei Stimulation mit dem hämatopoetischen Cocktail. Hematopoetische Zellkolonien entstehen in der Kultur. Hämatopoetische Vorläuferzellen exprimieren CD34 und CD45, daher wird die Durchflusszytometrie verwendet, um das Vorhandensein von hämatopoetischen Zellkolonien durch die Analyse der Expression von CD34 und CD45 zu bestätigen.

Ein koloniebildender Einheitstest zeigte die Erzeugung von Granulozyten oder Makrophagenkolonien aus den CD34-positiven und CD45-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen. Die Koloniezahl wurde auf 38 koloniebildende Einheiten pro 10.000 Zellen geschätzt. Die wichtigsten Schritte sind die Auszählung von PSC-Sphäroiden.

Wir haben festgestellt, dass die Oberflächenmetrik der determinantesten Faktor für die Effizienz dieses Protokolls ist. Diesem Verfahren kann die standardisierende Produktion von inergischen Zellen wie natürlich vorkommenden Zellen und Makrophagen folgen. Diese Plattform ermöglicht es Forschern, wichtige deterministische Faktoren in der humanen hämatopoetischen Entwicklung zu erforschen.