Name: Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Erfahren Sie eine schnelle Methode zur Isolation primärer adulten Fibroblasten mit Ultraschall und enzymatischer Verdauung. Dieses Protokoll minimiert Bakterienkontaminationen und ist ideal für Einsteiger in der Zellbiologie.

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Wir danken Frau Romy Kempe und Frau Annett Opitz für die fachkundige technische Unterstützung. Wir danken auch Herrn Bjoern Binnewerg für die IT-Unterstützung. Unterstützt wurde diese Arbeit durch Stipendien des Förderkreises Dresdner Herz-Kreislauf-Tage e.V., b) "Habilitationsförderprogramm für Frauen", Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus Dresden und c) Else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus Dresden. Wir sind dankbar für die Finanzierung und die Unterstützung.

Das folgende Protokoll folgt den institutionellen Tierpflegerichtlinien der Technischen Universität Dresden (Aktenzeichen: T 2014/4) sowie den international anerkannten Tierpflegerichtlinien (FELASA)17. Abbildung 1 visualisiert den Prozess der Zellisolierung.
1. Vorbereitung des Setups, des Materials und der Medien
<ol><li>Bereiten Sie Zellkulturmedium, PBS-Lösung, Kollagenase-Mischstofflösung (rekonstituieren 50 mg lyophilisierte Kollagennase-Mischung in 12 ml sterilem Reinstwasser) und 0,25% Trypsinlösung.</li>
	<li>Das Medium, das PBS und die Trypsin-Lösung auf 37 °C aufwärmen.</li>
	<li>Das Ultraschall-Wasserbad auf 37 °C vorheizen.</li>
	<li>Desinfektionszange, ein Edelstahlspachtel, Skalpelle (2x Skalpelle pro Organ) und 2 Glasbecher mit 70% Ethanol und legen diese Materialien unter die Zellkulturhaube.</li>
	<li>Füllen Sie einen Becher mit 70% Ethanol und den anderen mit sterilem Wasser oder PBS-Lösung. Diese Becher sind erforderlich, um das Instrument nach jeder Orgelprozession zu desinfizieren und zu waschen.</li>
	<li>Sterile 15 ml Kunststoffrohre mit kaltem PBS auf nassem Eis aufstellen. Die Anzahl der Röhren hängt von der Anzahl der Organe ab, von denen Sie Fibroblasten isolieren möchten.</li>
</ol>2. Maussektion und Organentfernung
<ol><li>Tragen Sie zwei Paar Handschuhe übereinander, so dass das erste Paar entfernt werden kann, sobald das Tier seziert wurde. HINWEIS: Dieses Verfahren verhindert, dass sich Bakterien aus fell und hautaus über die Organe ausbreiten.</li>
	<li>Euthanisieren Sie die Maus (z. B. Zervixdislokation) und heften Sie den Kadaver mit Nadeln an jedes Glied an ein Polystyrolpad.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Mauskarkasse mit 70% Ethanolspray. Stellen Sie sicher, dass das Fell in Ethanol getränkt ist, damit das Haar nicht aufwirbelt.</li>
	<li>Schneiden Sie das Fell direkt über dem Urogenitaltrakt mit chirurgischen Zangen und atraumatischen Scheren. Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie vom Punkt des anfänglichen Schnitts bis zum Hals (3 - 4 cm) und fügen Sie Reliefschnitte an den Gliedmaßen hinzu. VORSICHT: Perforieren Sie die Muskelschicht bei diesem Schritt nicht, um eine bakterielle Kontamination zu vermeiden!</li>
	<li>Pin die Haut an das Polystyrol-Schaumpad, um optimalen Zugang zur Muskulatur zu haben, die die Bauchhöhle bedeckt.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Bauchmuskulatur zweimal mit 70% Ethanol. Lassen Sie das Ethanol trocknen, bevor Sie zum nächsten Schritt weiterfahren.</li>
	<li>Entfernen Sie das erste Paar Handschuhe. Verwenden Sie einen neuen, sterilen Satz Von Zangen und Scheren.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bauchhöhle und den Thorax, indem Sie die Muskelschicht mit einer chirurgischen Schere einschneiden, um die Organe der Wahl sanft zu entfernen. Halten Sie das Organ daher vorsichtig mit chirurgischen Zangen (das Organ nicht durchbohren, minimalen Druck verwenden) und schneiden Sie die zuliefernden Blutgefäße in der Nähe des Einstiegspunkts am Organ mit einer Schere.</li>
	<li>Legen Sie die Organe in die sterilen Schläuche, die kalte SPBS enthalten. Schließen Sie die Rohre fest. Legen Sie die Rohre auf nasses Eis, bis Sie mit Schritt 3.1 fortfahren.</li>
</ol>3. Gewebeminzierung, Verdauung und Zellextraktion
<ol><li>Übertragen Sie die Rohre unter die sterile Zellkulturhaube. VORSICHT: Tragen Sie ein frisches Paar Handschuhe und desinfizieren Sie die Schläuche mit 70% Ethanol, bevor Sie sie unter die Haube übertragen!</li>
	<li>Nehmen Sie das Organ mit steriler Zange aus dem 15 ml-Rohr. Legen Sie das Organ auf die Hälfte einer sterilen 6 cm Petrischale und waschen Sie das Organ kurz mit PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen. Übertragen Sie die Orgel auf die zweite Hälfte der Petrischale, entfernen Sie überschüssige PBS.</li>
	<li>Hacken Sie das Gewebe mit zwei sterilen Skalpellen. Die verbleibenden Gewebefragmente sollten nicht größer als 1 - 2 mm sein.</li>
	<li>Übertragen Sie das gehackte Gewebe mit dem sterilen Spachtel in ein neues steriles 15 ml-Rohr und fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsinlösung hinzu. Legen Sie die Röhre 5 min bei 37 °C in einen Zellkultur-Inkubator.</li>
	<li>Wirbeln Sie das Rohr sanft (ca. 1400/min) für 10 s.</li>
	<li>Stoppen Sie die Trypsin-Reaktion unter der Zellkulturhaube, indem Sie 4 ml FCS-haltiges Zellkulturmedium (Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM), z.B.) hinzufügen.</li>
	<li>Fügen Sie jeder Röhre, die Herz- oder Lungengewebe enthält, 250 l Kollagenase-Mischlösung und für Niere bzw. Leber 100 l Kollagennase-Mischlösung hinzu.</li>
	<li>Legen Sie die Schläuche in ein Ultraschall-Wasserbad (37 °C) und aktivieren Sie den Ultraschall-Sonicator 10 min. HINWEIS: Das in diesem Protokoll verwendete Ultraschall-Wasserbad hat eine Betriebsfrequenz von 35 kHz und eine maximale Leistung von 320 W.</li>
	<li>Wirbeln Sie die Rohre sanft (ca. 1400/min) für 10 s.</li>
	<li>Legen Sie die Schläuche 10 min wieder in das Ultraschall-Wasserbad.</li>
	<li>Wirbel sanft (ca. 1400/min) für 10 s.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Rohre mit 70% Ethanol und übertragen Sie sie unter die sterile Zellkulturhaube.</li>
	<li>Filtern Sie die Lösung mit einem 40-mm-Netz in ein neues steriles 15 ml-Rohr.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 x g für 5 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml frischem Medium wieder auf.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in ein geeignetes Zellkulturgefäß (z.B. 6-Well-Platte) und legen Sie das Gefäßüber Nacht bei 37 °C und 5% CO2 in den Zellkultur-Inkubator.</li>
	<li>Am nächsten Tag entfernen Sie das Medium, waschen Sie 3 mal mit PBS, dann fügen Sie frisches Medium hinzu (das zusätzliche Volumen hängt vom Zellkulturgefäß der Wahl ab, 2 ml pro Brunnen einer 6-Well-Platte usw.).</li>
	<li>Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag. HINWEIS: Fibroblasten können nach Erreichen des optischen Zusammenflusses von 90% (in der Regel nach 5-7 Tagen) geteilt werden.</li>
</ol>

<ol><li>Baum, J., Duffy, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+myofibroblasts%3A+what+are+we+talking+about%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).</li>
<li>Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+identity+of+cardiac+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Redefining the identity of cardiac fibroblasts.</a> Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).</li>
<li>Weissman-Shomer, P., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+fibroblasts+senscence+in+vitro%3A+pattern+of+cell+division+and+life+span+as+a+function+of+cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).</li>
<li>Angello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+potential+and+the+duration+of+the+cell+cycle+in+human+fibroblasts%3A+coordinate+stimulation+by+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fibroblasts+in+vitro+senesce+with+a+donor-specific+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length.</a> FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).</li>
<li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes%3A+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> International Journal of Molecular Medicine. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li>
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<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Kuenzel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+epigenetic+silencing+of+polo-like+kinase+2+promotes+fibrosis+in+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation.</a> bioRxiv. , 445098(2018).</li>
<li>Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+fibroblasts+and+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li>
<li>Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+physiological+functions+and+ion+currents+in+atrial+fibroblasts+from+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation.</a> Physiological Reports. 4 (2), (2016).</li>
<li>Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes%2C+Endothelial+Cells%2C+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).</li>
<li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li>
<li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li>
<li>El-Armouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+inhibitor-1-deficient+mice+are+protected+from+catecholamine-induced+arrhythmias+and+myocardial+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy.</a> Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).</li>
<li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+Guidelines+and+Recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).</li>
<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), 2033(2010).</li>
<li>Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts+differentiate+from+fibroblasts+when+plated+at+low+density%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).</li>
<li>Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblasts+in+cell+culture+systems%3A+myofibroblasts+all+along%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).</li>
<li>Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484</a> (2019).</li>
<li>Coppé, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li>
<li>Singh, M., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+of+fibroblast+cells+from+goat+skin+explants+in+three+different+culture+media+and+the+establishment+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).</li>
<li>Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+removal+of+fibroblasts+from+human+tissue+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems.</a> Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).</li>
</ol>

Es gibt keine Interessenkonflikte zu erklären.

Im Vergleich zu verewigten Fibroblasten-Zelllinien bieten primäre Fibroblasten mehrere Vorteile. Sie lassen sich kostengünstig in hoher Qualität und Quantität isolieren. Darüber hinaus bieten Primärkulturen die Möglichkeit, Zellen von mehreren Individuen zu untersuchen, was die Zuverlässigkeit der erhaltenen Ergebnisse erhöht und die Wahrscheinlichkeit verringert, nur Zellkulturartefakte zu studieren. Kontinuierliche Erzeugung neuer Primärkulturen verhindert genetische Veränderungen, die häufig nach wiederholter Passage ...

Fibroblasten sind flache, spindelförmige Zellen mit mehreren stellaten Prozessen und einem ausgedehnten groben endoplasmatischen Retikulum1,2. Ein durchschnittlicher Fibroblasten misst 30 - 100 m und hat eine Lebensdauer von 57 x 3 Tagen1,3. Die durchschnittliche Zellzyklusdauer menschlicher Fibroblasten reicht von 16 - 48 h, abhängig von den Kulturbedingungen4. Es gibt Hinweise darauf, dass die reproduktive Kapazität und funktionelle Qualität kultivierter primärer Fibroblasten negativ mit dem Spenderalter korreliert, was darauf hindeutet, dass jüngere Spender (Tiere oder Patienten) nach Möglichkeit bevorzugt werden sollten5,6 .
Fibroblasten stellen einen vorherrschenden Zelltyp der meisten Säugetierkörpergewebe dar. Trotz ihrer allgegenwärtigen Präsenz ist die molekulare Identifizierung von Fibroblasten immer noch eine Herausforderung7. Fibroblasten wandern während der embryonalen Entwicklung zu sich entwickelnden Geweben und Organen aus verschiedenen Quellen8. Aus diesem Grund gibt es eine Fülle von Markerproteinen, die in Fibroblasten gefunden werden können, während einzigartige Markerproteine, die in jeder Fibroblastenpopulation vorhanden sind und exklusiv für Fibroblasten sind, noch fehlen. Daher werden Expressionsmuster mehrerer erkannter Marker in der Regel verwendet, um Fibroblasten zu identifizieren. Zu den bekanntesten Markern gehören Vimentin, humanes Fibroblasten-Oberflächenprotein (hFSP), Discoidin-Domänenrezeptor 2 (DDR2) und Alpha-Glattmuskel-Actin (SMA).
Fibroblasten sind der wichtigste extrazelluläre Matrix (ECM)-produzierende Zelltyp. Dabei erhalten Fibroblasten eine geordnete Gewebearchitektur und bieten mechanische Unterstützung für benachbarte Zellen1. Das Gleichgewicht zwischen ECM-Synthese und Abbau ist ein gut regulierter Prozess. Verschiebungen in Richtung Synthese markieren den Beginn einer übermäßigen ECM-Ablagerung, die, wenn sie nicht beendet wird, zu Fibrose führt. Fibrose wird durch Myofibroblasten vermittelt, die von aktivierten Fibroblasten stammen, die molekularen und phänotypischen Veränderungen unterzogen werden. Ein Markenzeichen von Myofibroblasten ist die verbesserte Sekretion von ECM und Zytokinen und die Expression von geordnetangeordneten SMA-Mikrofilamenten9.
Primäre Fibroblasten standen im Rampenlicht der jüngsten Forschung, die sich auf Fibrose, Gewebeentzündung und Fibroblasten-Krebs-Zell-Wechselwirkungen10,11konzentriert. Jedoch, um effektiv zu studieren Fibroblasten Eigenschaften in Gesundheit und Krankheit, Ist es notwendig, lebensfähige primäre erwachsene Fibroblasten auf einer regelmäßigen Basis zu isolieren. Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung, um Fibroblasten zu isolieren12,13,14. Die drei wichtigsten Methoden der Fibroblastenisolation sind das Auswachsen aus Gewebebrocken12, enzymatische Gewebeverdauung15, und enzymatische Perfusion von Hohlorganen9,13,16. Der Vorteil des Auswuchses ist ein schonender Isolationsprozess ohne enzymatischen Zellabbau. Auf der anderen Seite benötigen Auswachstumskulturen in der Regel längere Kulturperioden, bis Zellen für Experimente verwendet werden können. Die häufige enzymatische Verdauung ist schnell, birgt aber das Risiko einer Kontamination mit anderen Zelltypen (z. B. Endothelzellen) oder Bakterien im Rührprozess, die notwendig sind, um das Gewebe mechanisch aufzulösen. Darüber hinaus sind diese Methoden oft aufwendig und erfordern Zeit und Geschick zu lernen.
Hinsichtlich der Bedeutung primärer Fibroblasten in der Forschung besteht nach wie vor die Notwendigkeit, bestehende Zellisolationsansätze in Bezug auf Schnelligkeit, Einfachheit und Zuverlässigkeit zu optimieren. Hier wird eine neuartige Ultraschall-basierte enzymatische Fibroblasten-Isolationsmethode angeboten, die hochwertige Zellen liefert.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotika</td><td>Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA</td><td>Gibco LS15140148&nbsp;</td><td>Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml)</td></tr><tr><td>Zellkulturhaube</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>51023608</td><td>HeraSafe KSP15</td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>50049176</td><td>BBD 6220</td></tr><tr><td>Zellkulturplatten</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>abhängig vom Gefäß</td><td>6-, 12-, 24-Wells Nunclon-Oberfläche</td></tr><tr><td>Zellkultur-Absaugung</td><td>VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Deutschland</td><td>20727400</td><td>BVC professionelles</td></tr><tr><td>Saugzellensieb (Mesh)</td><td>Corning, Tewksbury, USA</td><td>431750</td><td>40 &micro; m</td></tr><tr><td>Nylon-Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>75007213</td><td>Megafuge 8R</td></tr><tr><td>Akku-Pipettierhilfe</td><td>Hirschmann, Eberstadt, Deutschland</td><td>9907200</td><td>Pipetus</td></tr><tr><td>Einweg-Pipettenspitzen</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>je nach Volumen</td><td>SafeSeal-Spitzen für Pipetten (10 & Mikro; L, 20 & Mikro; L, 100 &Mikro; L, 200 & Mikro; L, 1000 &Mikro; L)</td></tr><tr><td>Einweg-Kunststoffpipetten</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>abhängig vom Volumen</td><td>5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL</td></tr><tr><td>Steriles Einweg-Skalpell</td><td>Myco Medical, Cary, USA</td><td>n.a.Techno</td> <td>cut</td></tr><tr><td>Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>41965-062</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen</td> mit hohem Glukosegehalt <td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland&nbsp;</td><td>abhängig von Volumen</td><td>50 &Micro; L, 500 &Mikro; L, 1.500&micro; L, 2.000 & Mikro; L</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>F2442-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase-Mischung</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>5401020001</td><td>Liberase TL Petrischale in Forschungsqualität</td></tr><tr><td>6 cm</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D8537-500ML</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Seneszenz-Detektionskit</td><td>Abcam, Cambridge, UK</td><td>ab65351</td><td></td></tr><tr><td>Shaker/ Vortex</td><td>IKA, Staufen im Breisgau, Deutschland</td><td>n.a.MS2</td> <td>Minishaker (Nachfolgemodell: Ident-Nr.: 0020016017)</td></tr><tr><td>Sterile Kunststoffröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>Falcon 352095</td><td>BD Falcon Röhrchen (15 mL, 50 mL)</td></tr><tr><td>Ultraschall-Wasserbad</td><td>BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Deutschland</td><td>312</td><td>Sonorex RK100H</td></tr><tr><td>Chirurgische Schere (atraumatisch)</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland</td><td>NR 82</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere&nbsp;</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland</td><td>eq 1060.09</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Zange</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Deutschland</td><td>BD577</td><td></td></tr></tbody></table>

ultraschall-augmented primary adult fibroblast isolation

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primäre erwachsene Fibroblasten sind zu einem wichtigen Werkzeug geworden, um Fibrose, Fibroblasten-Wechselwirkungen und Entzündungen in allen Körpergeweben zu untersuchen. Da sich primäre Fibroblasten aufgrund der Myofibroblastendifferenzierung oder der Seneszenzinduktion nicht unbegrenzt aufteilen können, müssen regelmäßig neue Kulturen etabliert werden. Es gibt jedoch mehrere Hindernisse, die während der Prozesse der Entwicklung eines zuverlässigen Isolationsprotokolls und der primären Fibroblastenisolation selbst zu überwinden sind: der Schwierigkeitsgrad der Methode (insbesondere für Anfänger), das Risiko einer bakteriellen Kontamination, die benötigte Zeit, bis primäre Fibroblasten für Experimente verwendet werden können, und anschließende Zellqualität und Lebensfähigkeit. In dieser Studie wird ein schnelles, zuverlässiges und leicht zu erlernendes Protokoll zur Isolierung und Kultur primärer Erwachsener Fibroblasten aus Mausherz, Lunge, Leber und Niere bereitgestellt, das enzymatische Verdauung und Ultraschall-Agitation kombiniert.

Die Fähigkeit dieses Protokolls, erwachsene Fibroblasten aus festem murinen Gewebe zu isolieren, wurde nachgewiesen. Es wurden lebensfähige Fibroblasten erhalten, die für nachfolgende Experimente wie Immunfluoreszenzfärbung oder Proliferationsexperimente verwendet werden konnten (Abbildung 2D-F, Abbildung 5A).
Erwachsene Fibroblasten sind flache spindelförmige Zellen mit mehreren zellulären Prozessen,...

Wir präsentieren ein Protokoll, um primäre erwachsene Fibroblasten auf einfache, schnelle und zuverlässige Weise zu isolieren, die von Anfängern (z. B. Studenten) durchgeführt werden können. Das Verfahren kombiniert enzymatische Gewebeverdauung und mechanische Agitation mit Ultraschallwellen, um primäre Fibroblasten zu erhalten. Das Protokoll kann leicht an spezifische experimentelle Anforderungen (z.B. menschliches Gewebe) angepasst werden.

Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

Unser Protokoll bietet einen einfachen und schnellen Ansatz für die primäre Fibroblastenisolierung mit einem klaren Fokus auf die Vermeidung von Bakterienkontamination, was ein riesiges Problem sein kann. Vor allem für Anfänger. Der Hauptvorteil unserer Technik ist ihre Einfachheit.Da es keine umfangreichen manuellen Fähigkeiten oder Erfahrungen erfordert und es kann leicht von jedem innerhalb einer kurzen Ausbildungszeit erlernt werden. Präsentiert wird die Technik von Manja Newe, einer Technikerin aus dem Out-Labor. Vor Beginn der Zerlegung, ziehen Sie zwei Paar Einweghandschuhe, eine über dem anderen.Und fixieren Sie die Maus auf einem Polystyrol-Pad. Desinfizieren Sie das Fell mit 70% Ethanol, um sicherzustellen, dass das Tier eingeweicht ist. Und verwenden Sie Ethanol sterilisierte chirurgische Zangen und atraumatische Schere, um die Haut direkt über dem Urogenitaltrakt zu bechern.Schneiden Sie drei bis vier Zentimeter entlang der Mittellinie vom ersten Schnitt bis zum Hals, Hinzufügen von Reliefschnitten an den Gliedmaßen. Und fixieren Sie die Haut an das Pad, um einen optimalen Zugang zur Muskulatur zu erreichen, die die Bauchhöhle bedeckt. Dann desinfizieren Sie die Bauchmuskulatur zweimal mit frischem 70%Ethanol.Wenn das Ethanol getrocknet ist, entfernen Sie das erste Paar Handschuhe. Und verwenden Sie einen neuen sterilen Satz von Zangen und Schere, um die Muskelschicht zu schneiden, um die Bauchhöhle und den Thorax zu öffnen. Um die von Interesse interessierten Organe zu entfernen, greifen Sie vorsichtig jedes Organ mit den chirurgischen Zangen, ohne das Gewebe zu durchbohren.Und verwenden Sie die Schere, um die zuliefernden Blutgefäße in der Nähe des Einstiegspunkts des Organs sorgfältig zu schneiden. Legen Sie jedes Organ in eine Röhre aus sterilem, kaltem PBS und schließen Sie das Rohr fest. Platzieren Sie jede Röhre auf nassem Eis, während die Organe gesammelt werden.Wenn alle Organe geerntet sind, sprühen Sie die Rohre mit 70% Ethanol, bevor Sie sie in eine sterile Zellkulturhaube legen. Mit einem frischen Paar Handschuhen, verwenden Sie sterile Zange, um jedes Organ auf die Hälfte einer sterilen sechs Zentimeter Petrischale zu übertragen. Und waschen Sie die Organe kurz mit frischem PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen.Übertragen Sie die vorspülenden Organe auf die zweite Hälfte jeder Petrischale und entfernen Sie die überschüssige PBS. Mit zwei sterilen Skalpellen zerkleinern Sie die Organe in ein bis zwei Millimeter Fragmente. Und verwenden Sie einen sterilen Spachtel, um die Gewebestücke in neue, individuelle, sterile, 15 Milliliter-Röhren zu übertragen.Fügen Sie zwei Milliliter 0,25%Trypsin Lösung zu jeder Röhre. Und legen Sie die Röhren fünf Minuten lang in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation wirbeln die Röhren mit etwa 1400 Umdrehungen pro Minute für zehn Sekunden.Und die Trypsin-Reaktion mit vier Millilitern eines geeigneten Kulturmediums, ergänzt durch fetales Kalbsserum pro Tube, aufhalten. Als Nächstes fügen Sie jedem Rohr das entsprechende Volumen der Kollagenase-Mischlösung hinzu. Und legen Sie die Rohre in einem 37 Grad Celsius Ultraschall-Wasserbad für 10 Minuten.Am Ende der Beschallung, sanft wirbeln die Rohre für 10 Sekunden. Bevor Sie die Schläuche für 10 Minuten wieder in das Ultraschall-Wasserbad legen. Am Ende der zweiten Beschallung wirbeln die Röhren für 10 weitere Sekunden.Und desinfizieren Sie die Rohre mit 70% Ethanol. Filtern Sie die Zellsuspensionen in der Zellkulturhaube durch einzelne 40-Mikrometer-Siebe in ein neues, steriles 15-Milliliter-Rohr. Und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.Die Pellets in einem Milliliter frischem Medium pro Tube wieder aufhängen. Und sehen Sie die Zellen in geeigneten Zellkulturgefäßen bei entsprechender Beschichtungsdichte. Platzieren Sie dann die Zellen über Nacht im Zellkultur-Inkubator.Am nächsten Morgen waschen Sie jede Kultur dreimal mit PBS, bevor Sie frisches Medium hinzufügen und die Zellen in den Inkubator zurückbringen. Mit diesem Protokoll können lebensfähige Fibroblasten für den Einsatz in nachfolgenden Experimenten gewonnen werden. Wie aminofluoreszierende Färbung oder Proliferationsexperimente.Erwachsene Fibroblasten sind flache, spindelförmige Zellen mit mehreren zellulären Prozessen, die typischerweise in Monolayern wachsen. Deutliche morphologische Unterschiede in Fibroblastenpopulationen aus verschiedenen Organen können jedoch beobachtet werden. Zum Beispiel sind renale Fibroblasten kleiner und wachsen mit höheren Dichten als Herz-, Lungen- oder Leberfibroblasten.Die isolierten Fibroblasten weisen hohe Proliferationsraten auf und erreichen nach etwa sechs Tagen einen optischen Zusammenfluss von mehr als 90 %. Hier kann ein differenzierter Myofibroblast mit ausgeprägten Alpha-Glattmuskel-Aktin-Mikrofilamenten beobachtet werden. Diese Zellen sind in Hülle und Fülle in den Herz-, Nieren-, Leber- und Lungenzellkulturen zu finden.Während nur etwa 20 bis 30 Prozent der isolierten und kultivierten Zellen geordnete, angeordnete, alpha glatte Muskelaktin Mikrofilamente ausdrücken, sind praktisch alle Zellen nach sieben Tagen in der Kultur positiv für Vimentin und Discoidin Domain Receptor 2. Das Wichtigste, was Sie sich merken sollten, ist, die richtige Technik während des gesamten Verfahrens zu verwenden, da eine Kontamination von Bakterien vermieden werden muss. Nach der primären Fibroblastenisolation können die Zellen für alle Arten von Psychiatrieexperimenten und Charakterisierungen verwendet werden.Wie z. B. proliferationsfähigkeit der immunzytären Chemie oder Wundheilungsessays oder molekularbiologische Bewertungen.

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Medizin

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