Name: Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Lernen Sie die Induktion von Langzeitdepression in zerebellären Purkinje-Zellen mittels Elektrophysiologie und Patch-Clamp-Technik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung synaptischer Plastizität in genmanipulierten Tieren.

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Wir danken A. Oba für ihre technische Hilfe. Diese Forschung wurde teilweise durch Grant-in-Aid for Scientific Research (C) 17K01982 an K.Y. unterstützt.

Alle Versuchsverfahren wurden vom RIKEN-Ausschuss für die Pflege und Verwendung von Tieren in Experimenten genehmigt. Mäuse wurden in der Tieranlage des RIKEN Center for Brain Science unter gut kontrollierter Temperatur (23–25 °C) und Feuchtigkeit (45%–65%) gehalten. Bedingungen. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche WT-Mäuse (C57BL/6, 3–6 Monate) verwendet.
1. Vorbereitung von Lösungen, die in den Experimenten verwendet werden
HINWEIS: Alle Lösungen sollten in metallfreiem Reinstwasser (Widerstand > 18,2 Mio. Euro) und anderen Verunreinigungen (Gesamt-Biokohlenstoff (TOC) < 5,0 ppb) hergestellt werden. Arbeitende künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) zum Schneiden und Aufnehmen werden am Tag des Experiments frisch aus einem 10-fachen (x10) ACSF-Bestand hergestellt. Blasen Sie die Lösungen vor Gebrauch mit 5%CO2/ 95%O2 Gasgemisch. Der pH-Wert von ACSF wird auf 7,4 x 0,1 und die Osmolarität um 315 x 5 mOsm/kg durch Zugabe von Reinstwasser eingestellt.
<ol><li>Bereiten Sie 10x Bestand an ACSF mit 1250 mM NaCl, 30 mM KCl, 12,5 mM NaH2PO4und 260 mM NaHCO3vor. Diese Lösung kann bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>
Vorbereiten von Arbeits-ACSF mit 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM Mg2SO4, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3 und 20 mM Glukose.
	<ol>
<li>Fügen Sie zunächst 1 ml 2 M CaCl2 Lösung gefolgt von 1 ml 1 M Mg2SO4 Lösung in ca. 800 ml Reinstwasser, um Niederschläge zu vermeiden. Dann 100 ml 10x ACSF und Glukose hinzufügen. Schließlich machen Sie ein Gesamtvolumen von 1.000 ml durch Zugabe von Reinstwasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 3,3% Agar für die Behandlung des Gehirns. 1 g Agar in 30 ml 0,9% NaCl-Lösung auflösen und in einer Mikrowelle bis zum Kochen erhitzen. Rühren, um zu mischen, dann gießen Sie es in eine sterile 4 cm x 10 cm Kunststoff-Box und lassen Sie zu erstarren. Bewahren Sie die Agarplatte(8mm Dicke) im Kühlschrank auf.</li>
	<li>
Bereiten Sie die interne Lösung vor.
	<ol>
<li>Bereiten Sie die K+-basierte interne Lösung mit 60 mM KCl, 60 mM K-Gluconat, 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP und 30 mM HEPES (pH 7,2) vor. HINWEIS: Niedrige Konzentration (0,3 mM) von EGTA, einem langsamen Ca2+-Chelat, wird hinzugefügt, um möglicherweise kontaminierte Ca2+ in reinem Wasser zu chelaten, aber diese niedrige Konzentration von EGTA in der internen Lösung blockiert niemals die Induktion von LTD (Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5) während der Vollzellaufzeichnung. Gemessener osmotischer Druck beträgt 285 mOsm/kg.</li>
		<li>Bereiten Sie die Cs+-basierte interne Lösung mit 60 mM CsCl, 46 mM D-Gluconat, 27 mM Tetraethylammoniumchlorid (TEA-Cl), 0,3 mM EGTA, 4 mM MgCl2, 4 mM ATP, 0,4 mM GTP und 30 mM HEPES (pH 7,2, angepasst mit CsOH) vor. HINWEIS: Cs+ blockiert spannungsabhängige K-Kanäle und verbessert die Raumklemmbedingungen bei entfernten Dendriten durch Erhöhung der Längenkonstante. Gemessener osmotischer Druck beträgt 285 mOsm/kg.</li>
		<li>Bereiten Sie 200 L Aliquots der Lösungen vor und lagern Sie sie bei -30 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Gehirnsektion und Trimmen
<ol><li>Kühlen und sauerstoffhaltigen zwei 50 ml Becher von ACSF auf Eis, bis die Temperatur unter 4 °C liegt. Fügen Sie 50 l Tetrodotoxin (TTX, 1 mM) in einen der eiskalten Becher von ACSF ein und reservieren Sie ihn für scheibenschneidende Scheiben. Um Maus-Kleinhirnscheibe zu erhalten, die ltd-induzierende Fähigkeit vorbehält, ist die Zugabe von TTX zum normalen ACSF notwendig.</li>
	<li>Kühlen Sie die Metall-Probenschale ab, indem Sie einen Eisbadbereich der Schneidkammer mit Eis füllen.</li>
	<li>Gießen Sie 1 ml Isofluran in ein Anästhesisierungsglas(ca.1000 ml) und legen Sie dann eine Maus für 30–45 s hinein. Stellen Sie sicher, dass die Maus tief beästhebt ist, indem Sie ihre Unfähigkeit bestätigen, auf mechanische Stimulation zu reagieren.</li>
	<li>Enthaupten Sie die Maus mit einer chirurgischen Schere. Halten Sie den Kopf und schneiden Sie die oberflächliche Haut entlang der Mittellinie mit einer ophthalmologischen Schere. Ziehen Sie die Haut, indem Sie mit den Fingern halten, um die Schädeloberfläche weit zu belichten.</li>
	<li>Schneiden Sie den Schädel horizontal entlang einer Linie aus dem großen spinokerebellären Loch direkt über Ohr und Auge mit einer ophthalmologischen Schere. Schneiden Sie den Schädel entlang einer Linie über beiden Augen und entfernen Sie, um den Schädel zu isolieren.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gehirn in der Mitte des Großhirns mit einem Skalpell, dann isolieren Sie den kaudalen Teil des Gehirns einschließlich des Kleinhirns vom Schädel. Tauchen Sie es in einen eiskalten Becher von ACSF ein. Normalerweise sollte die Gesamtzeit von der Enthauptung bis zum Eintauchen des Hirnblocks in das vorgekühlte Becherglas von ACSF weniger als 60 s betragen.</li>
	<li>Die Position der sprudelnden Schläuche sollte so eingestellt werden, dass der Hirnblock im Becher nicht umgerührt wird. Mechanische Schäden können während der Aufnahme zu Schwellungen der Scheibe führen. Lassen Sie es für mindestens 7 min und lassen Sie das Gehirn abkühlen.</li>
	<li>Um den Hirnblock zu schneiden, schneiden Sie ein rechteckiges Agarstück (2 cm x 2 cm) von einer großen Agarplatte (4 cm x 10 cm, bei 4 °C gelagert) und legen Sie es auf ein Filterpapier, um die überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren.</li>
	<li>Drehen Sie das Agarstück auf dem Filterpapier auf den Kopf, und legen Sie das Agarstück dann auf ein Filterpapier auf ein vorgekühltes Metallprobenfach (16 cm x 20 cm). Nehmen Sie den Gehirnblock mit einem Spachtel und absorbieren übermäßige Flüssigkeit um sie herum mit einem Stück Filterpapier.</li>
	<li>Montieren Sie den Hirnblock mit Kleber (medizinischer Cyanoacrylat-Sofortkleber) auf den Agarblock. Achten Sie darauf, den Boden (ventrale Seite) des Hirnblocks an den Agar zu befestigen.</li>
	<li>Schneiden Sie die rechte Hemisphäre mit einer Klinge aus. Stellen Sie sicher, dass die Seite der Schnittebene so parallel wie möglich zur dendritischen Ebene des PCs verläuft, da diese Seite an der Oberfläche der Probenschale befestigt ist. Schneiden und entfernen Sie die andere Seite der Hemisphäre. Dann schneiden Sie das Gehirn zwischen dem überlegenen und dem minderwertigen Colliculi und schneiden Sie das Rückenmark ab.</li>
	<li>Kleben Sie die rechte Seite des getrimmten Kleinhirns mit dem Agarblock auf das vorgekühlte Probentablett. Überschüssigen Kleber mit dem flachen Teil eines Spachtels um das Kleinhirn verteilen, um zu verhindern, dass überschüssiger Kleber an der Kleinhirnoberfläche befestigt wird. Neigen Sie das Metalltablett und gießen Sie ACSF, um den Kleber zu fixieren und den überschüssigen Kleber wegzuwaschen.</li>
</ol>3. Gehirn-Slicing
<ol><li>Richten Sie die Probe so aus, dass sich die Dorsalseite des Kleinhirns auf der Vorderseite befindet. Gießen Sie eiskaltes Schneiden ACSF, mit 1 M TTX, ausreichend, um das Kleinhirn vollständig einzutauchen. Legen Sie eine Gasröhre in den ACSF und beginnen Sie mit dem Gasgemisch O2/CO2 zu sprudeln.</li>
	<li>Entfernen Sie die Arachnoide Mater mit einer feinen Pinzette unter dem Fernglas. Schneiden Sie den Kleinhirn-Pedunkel mit einer Klinge, und entfernen Sie das Hirnstamm und Agar-Block. Drehen Sie das Tablett um 180°, so dass die dorsale Oberfläche des Kleinhirns einer Rasierklinge gegenübersteht.</li>
	<li>Stellen Sie die Klinge ein, und passen Sie die erste Schnittposition an. Stellen Sie die Vibratome-Slicing-Parameter auf Folgendes ein: Amplitude auf 5,5, Frequenz auf 85 Hz, Geschwindigkeit auf 3–4 und Scheibendicke auf 300 m.</li>
	<li>Die Kleinhirnscheibe auf einem Nylonnetz in einen Acryl-Inkubator übertragen und vollständig in den sauerstoffreichen ACSF eintauchen. Der Inkubator sollte in ein Wasserbad gelegt werden, das eine Temperatur bei 26 °C hält.</li>
	<li>Bewahren Sie die Scheiben mindestens 1 h auf, um die Wiederherstellung des Schadens während des Schneidens zu ermöglichen.</li>
</ol>4. Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahme
HINWEIS: Eine Patch-Clamp-Aufzeichnung erfordert folgendes Gerät: ein aufrechtes Mikroskop mit Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast (IR-DIC)-Optik, ein Patch-Clamp-Verstärker, Datendigitalisierer, Digitalstimulator, Isolator, Computer, Software zur Datenerfassung und Analyse, motorisierter Manipulator, Mikroskopplattform, Vibrationsisolationstisch, Faraday-Käfig, Lösungsheizung, Peristaltikpumpen und Elektrodenzieher.
<ol><li>Fügen Sie Picrotoxin (0,1 mM) zu ACSF hinzu und lösen Sie es mit Ultraschall für 3 min.</li>
	<li>Durchdringen Sie eine Aufnahmekammer mit Picrotoxin-haltigen,O2-CO2-gesättigten ACSF mit einer Rate von 2 ml/min. Halten Sie die Temperatur der Aufnahmekammer bei ca. 30 °C.</li>
	<li>Machen Sie eine Aufnahmeelektrode, indem Sie eine Borosilikatglaskapillare mit Filament (Außendurchmesser = 1,5 mm) mit einem Abzieher mit 4 Schritten ziehen. Der Spitzendurchmesser sollte etwa 1 m betragen.</li>
	<li>Machen Sie eine stimulierende Elektrode, indem Sie die gleiche Kapillare mit dem Puller mit 2 Schritten ziehen, dann brechen, um eine feine Spitze zu produzieren, indem Sie die Spitze gegen einen Eisenblock unter einem Binokularmikroskop schlagen. Der endgültige Durchmesser sollte 3–5 m betragen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Kleinhirnscheibe in die Aufnahmekammer und fixieren Sie sie mit einem Pt-Gewicht mit Nylonfäden. Füllen Sie eine stimulierende Elektrode mit ACSF.</li>
	<li>Zur Stimulation der PFs legen Sie die stimulierende Elektrode auf die Oberfläche der Molekülschicht, etwa 50 m von der Purkinje-Zellschicht entfernt.</li>
	<li>Zur Stimulation des CF die stimulierende Elektrode an der Unterseite der Purkinje-Zellschicht (Schritte 5.3, 5.4) platzieren.</li>
	<li>Filter K+-basiert oder Cs+-basierte interne Lösung mit einem 0,45-m-Filter. Verwenden Sie einen Mikrolader, um eine Aufnahmeelektrode mit 8 L interner Lösung zu füllen.</li>
	<li>Wenden Sie einen schwachen positiven Druck auf die Aufnahmeelektrode an, bevor Sie sie in den ACSF eintauchen. Sein Widerstand sollte 2–4 Mio. betragen und das flüssige Anschlusspotential korrigiert werden.</li>
	<li>Nähern Sie sich dem gesunden, hellen Zellkörper des PCs mit der Aufnahmeelektrode. Drücken Sie die Oberfläche der Purkinje-Zelle leicht, stoppen Sie die Anwendung von positivem Druck, als nächstes unterdruck, bis eine Giga-Ohm-Dichtung bilden. Richten Sie dann die Ganzzellenkonfiguration unter Negativem Druck ein.</li>
	<li>Halten Sie das Membranpotential bei -70 mV und wenden Sie -2 mV Puls (Dauer, 100 ms) bei 0,1 Hz an, um Eingangswiderstand, Reihenwiderstand und Eingangskapazität kontinuierlich zu überwachen. Verwenden Sie nicht die Widerstandskompensation der Serie. Verwerfen Sie Daten, wenn der Serienwiderstand um mehr als 15 % variiert.</li>
</ol>5. Induktion von LTD
<ol><li>Stimulieren Sie die molekulare Schicht mit einem Puls (Dauer, 0,1 ms). Identifizieren Sie die PF-exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSC) durch Anwendung eines Doppelpulsreizes (Interspike-Intervall (ISI) von 50 ms). Das PF-EPSC sollte gepaarte Pulserleichterungen und eine allmähliche Erhöhung der Amplitude im Verhältnis zur Erhöhung der Stimulationsintensität aufweisen.</li>
	<li>Zeichnen Sie das Testverhalten des PF-EPSC auf, indem Sie einen einzigen Impuls bei 0,1 Hz anwenden. Passen Sie die Intensität des Stimulus so an, dass die evozierte EPSC-Amplitude etwa 200 pA beträgt. Vermeiden Sie eine Verunreinigung des Stroms durch den spannungsabhängigen Ionenkanal.</li>
	<li>Stimulieren Sie das CF am unteren Rand der Purkinje-Zellschicht, und identifizieren Sie das EPSC, das durch die CF-Aktivierung ausgelöst wird (durch Anwendung eines Doppelpulsreizs). Der CF-EPSC sollte eine gepaarte Pulsdepression und eine Alles-oder-Nichts-Manier entsprechend der Erhöhung der Stimulationsintensität aufweisen. Für die LTD-Induktion sollte ein einziger Stimulus verwendet werden.</li>
	<li>
LTD-induzierendes Protokoll 1
	<ol>
<li>Mit einer Elektrode, die K+-basierte interne Lösung unter Stromklemmenbedingungen enthält, wenden Sie einen einzelnen PF-Stimulus und einen einzelnen CF-Stimulus gleichzeitig bei 1 Hz für 5 min (300 Impulse) an (Abbildung 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LTD-induzierendes Protokoll 2
	<ol>
<li>Mit einer elektrodenhaltigen K+-basierten internen Lösung unter Stromklemmenbedingungen doppelPF-Stimuli (ISI von 50 ms) und einzelnen CF-Stimulus anwenden, da der zweite PF-Stimulus mit CF-Stimuli bei 1 Hz für 5 min zusammenfällt(Abbildung 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LTD-induzierendes Protokoll 3
	<ol>
<li>Mit einer Elektroden, die Cs+-basierte interne Lösung unter Spannungsklemmenbedingungen enthält, einen doppelten PF-Stimulus (ISI von 50 ms) und einen einzelnen depolarisierenden Spannungsschritt (-70 bis 0 mV, 50 ms) auf das Soma bei 1 Hz für 3 min auftragen, so dass der zweite PF-Stimulus entspricht dem Beginn des depolarisierenden Spannungsschritts (Abbildung 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LTD-induzierendes Protokoll-4
	<ol>
<li>Mit einer Elektrode, die Cs+-basierte interne Lösung unter Spannungsklemmenbedingungen enthält, die PF-Stimuli (5x bei 100 Hz) und einen einzelnen depolarisierenden Spannungsschritt (-70 bis 0 mV, 50 ms) gleichzeitig auf das Soma bei 0,5 Hz auftragen (Abbildung 1D ).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Unterschiede zwischen den vier Protokollen
In den LTD-induzierenden Protokollen 1 und 2 reicht Cjs 300 mal bei 1 Hz aus, um Kleinhirn-LTD zu induzieren. Die Stimulationshäufigkeit des CF schien sich in einem physiologischen Bereich zu befinden, da die komplexe Spike-Feuerrate bei alarmierten erwachsenen Mäusen (P60) 1,25 Hz36betrug. Die CF-Stimulation allein verursachte jedoch keine langfristige Plastizität in der PF-CF-Synapse, wie sie in den Protokollen 1 und 2 (<strong...

Die synaptische Organisation der ausgeklügelten neuronalen Netzwerke des Kleinhirnkortex, bestehend aus PCs, molekularen Schicht-Interneuronen (Korb- und Stellatzellen), Golgi-Zellen, PFs aus Granulatzellen, Moosfasern und Kletterfasern (CFs), wurden aufgeklärt in Bezug auf Erregung/Hemmung und Divergenz/Konvergenz, und das gut organisierte Schaltplan diagramm hat vorgeschlagen, dass das Kleinhirn eine "neuronale Maschine"ist 1, obwohl es vorher keine Ahnung über den Zweck dieser "Maschine" gab. Später schlug Marr vor, dass die PFs-Eingabe in PCs ein dreischichtiges assoziatives Lernnetzwerk2bilden sollte. Er schlug auch vor, dass jeder CF eine zerebrale Anweisung für Elementarbewegung2vermittelt. Er ging davon aus, dass die gleichzeitige Aktivierung von PFs und CF die PF-PC-Synapsenaktivität verbessern und eine langfristige Potenzierung (LTP) der PF-PC-Synapse verursachen würde. Andererseits ging Albus davon aus, dass die synchrone Aktivierung von PFs und CF zu LTD an den PF-PC Synapsen3führte. Beide oben genannten Studien interpretieren das Kleinhirn als einzigartiges Speichergerät, dessen Einbindung in das kleinhirnförmige kortikale Netzwerk zur Bildung des Marr-Albus-Modelllernmaschinenmodells führt.
Nach diesen theoretischen Vorhersagen deuten zwei Beweislinien auf das Vorhandensein synaptischer Plastizität im Kleinhirn hin. Die erste Beweislinie wurde von der anatomischen Organisation des Flocculus vorgeschlagen; hier konvergieren MF-Wege vestibulären Organursprungs und CF-Wege retinalen Ursprungs auf den PCs4. Dieses einzigartige Konvergenzmuster legt nahe, dass eine synaptische Plastizität, die im Flocculus auftritt, die bemerkenswerte Anpassungsfähigkeit des vestibulo-okulären Reflexes verursacht. Zweitens stützten die Aufzeichnung der PCs-Antwort im Flocculus und die Läsion des Flocculus auch die obige Hypothese5,6,7. Darüber hinausstützte das PC-Entladungsmuster während der Anpassung der Handbewegung 8 eines Affen die synaptische Plastizitätshypothese, insbesondere Albus' LTD-Hypothese3.
Um die Art der synaptischen Plastizität direkt zu bestimmen, wurde gezeigt, dass die wiederholte Konjunktivstimulation (Cjs) eines Bündels von PFs und des CF, das den PC in vivo spezifisch innerviert, LTD für die Transmissionswirksamkeit der PF-PC-Synapsen9induzierte. 10,11. In den anschließenden In-vitro-Explorationen mit einem Kleinhirnschnitt12 und kultivierten PCs, Konjunktion von kokultivierter Granulatzellstimulation und Olivzellenstimulation13 oder Konjunktion iontophoretisch angewendeter Glutamat- und somatisch Depolarisation14,15 verursacht LTD. Der der LTD-Induktion zugrunde liegende Signaltransduktionsmechanismus wurde ebenfalls intensiv mit In-vitro-Präparaten16,17untersucht.
Anpassungen des VOR und des OKR wurden häufig zur quantitativen Bewertung von Genmanipulationseffekten auf das kleinhirnmotorische Lernen verwendet, da sich der vestibule-zerebellare Kortex als wesentlicher Ursprung beim adaptiven Lernen des VOR18 erwiesen hat. ,19,20 und die OKR19,21 Die Korrelation zwischen Versagen der LTD-Induktion und Beeinträchtigung des verhaltensmotorischen Lernens wurde als Beweis dafür genommen, dass LTD eine wesentliche Rolle bei der Lernmechanismen22. Diese Ansichten werden kollektiv als die LTD-Hypothese des motorischen Lernens oder Marr-Albus-Ito-Hypothese23,24,25,26bezeichnet.
Adaptives Lernen der Augenbewegung wurde mit ähnlichen Protokollen gemessen, während verschiedene experimentelle Bedingungen verwendet wurden, um LTD in der Scheibenvorbereitung27,28,29,30,31 zu induzieren. . Kürzlich berichteten Schonewille et al.26, dass einige genmanipulierte Mäuse normales motorisches Lernen zeigten, aber die Kleinhirnscheiben zeigten keine LTD und kamen so zu dem Schluss, dass LTD für das motorische Lernen nicht wesentlich sei. Die Induktion von LTD wurde jedoch nur mit einer Art von Protokoll bei Raumtemperatur versucht. Daher verwendeten wir verschiedene Arten von LTD-induzierenden Protokollen unter Aufzeichnungsbedingungen bei etwa 30 °C, und wir bestätigten, dass die LTD zuverlässig in den genmanipulierten Mäusen induziert wurde, indem diese Protokolle bei nahe physiologischen Temperaturen32verwendet wurden.
Es bleiben jedoch einige Fragen zu den grundlegenden Eigenschaften der konjunktiven Stimulation. Die erste ist die Beziehung zwischen der Form der komplexen Spitze und der Amplitude von LTD. Zweitens war in Verbindung mit PF-Stimulation und somatischer Depolarisation, ob die Anzahl der eingesetzten Reize notwendig war oder nicht, schwer zu fassen war. In der vorliegenden Studie wurden diese Fragen mit Wildtyp-Mäusen (WT) untersucht.

<table><tbody><tr><td>Verstärker</td><td>Molecular Devices-Axon</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglas Kapillare</td><td>Sutter</td><td>BF150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices-Axon</td><td>Digidata1322A</td><td></td></tr><tr><td>Elektrodenabzieher</td><td>Sutter</td><td>Modell P-97</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Isolator</td><td>A.M.P.I.</td><td>ISOflex</td><td></td></tr><tr><td>Linearschneider</td><td>Dosaka EM</td><td>PRO7N</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>NIKON</td><td>Eclipse E600FN</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Gilson</td><td>MP1 Einkanalpumpe</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Reinwasserbereiter</td><td>Merck-Millipore</td><td>MilliQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Software für Experimente</td><td>Molekularsonde-Axon</td><td>pClamp 10</td><td></td></tr><tr><td>Software für Statistik</td><td>KyensLab</td><td>KyPlot 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>WPI</td><td>DS8000</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Warner</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der langzeit-depressionsinduktion bei erwachsenen cerebellarscheiben

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptische Plastizität bietet einen Mechanismus zum Lernen und Gedächtnis. Für das kleinhirnmotorische Lernen gilt die Langzeitdepression (LTD) synaptischer Übertragungen von Parallelfasern (PF) zu Purkinje-Zellen (PC) als Grundlage für motorisches Lernen, und Mängel sowohl des LTD- als auch des motorischen Lernens werden in verschiedenen genmanipulierten Tieren. Gemeinsame motorische Lernsets, wie die Anpassung des optokinetischen Reflexes (OKR), der vestiular-okuläre Reflex (VOR) und der Rotarod-Test wurden zur Beurteilung der motorischen Lernfähigkeit verwendet. Die Ergebnisse der GluA2-carboxy Endstation modifizierten Einschlagsmäuse zeigten jedoch eine normale Anpassung des VOR und des OKR, obwohl PF-LTD fehlte. In diesem Bericht wurde die Induktion von LTD nur mit einer Art Stimulationsprotokoll bei Raumtemperatur versucht. So wurden Bedingungen zur Induzieren von Kleinhirn-LTD in den gleichen Einschlagsmutanten mit verschiedenen Protokollen bei nahezu physiologischer Temperatur untersucht. Schließlich fanden wir Stimulationsprotokolle, mit denen LTD bei diesen genmanipulierten Mäusen induziert werden konnte. In dieser Studie wird eine Reihe von Protokollen zur Bewertung der LTD-Induktion vorgeschlagen, die eine genauere Untersuchung des kausalen Zusammenhangs zwischen LTD und motorischem Lernen ermöglichen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass experimentelle Bedingungen bei der Bewertung von LTD bei genmanipulierten Mäusen von entscheidender Bedeutung sind.

Vier Protokolle wurden in dieser Studie verwendet, um Kleinhirn-LTD zu induzieren. In den ersten beiden Protokollen (Protokoll 1 und 2) wurde die Konjunktion der PF-Stimulation und der CF-Stimulation unter stromlastigen Bedingungen angewendet. In den beiden anderen Protokollen (Protokoll 3 und 4) wurde die somatische Depolarisation durch die CF-Stimulation unter Spannungsklemme ersetzt. Spannungsspuren oder Stromspuren bei der Konjunktivstimulation wurden verglichen (Abbildung 2).
<p cla...

Bei einigen genmanipulierten Tieren kann die Verwendung eines einzigen Protokolls nicht in zerebellar Purkinje-Zellen ltd induzieren, und es kann eine Diskrepanz zwischen LTD und motorischem Lernen geben. Mehrere Protokolle sind notwendig, um die LTD-Induktion bei genmanipulierten Tieren zu bewerten. Standardprotokolle werden angezeigt.

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Wenn eine bestimmte Proteinfunktion durch Genmanipulation verändert wird, wird die Koordination von reizendem Versagen und motorischer Laufbeeinträchtigung als notwendige Voraussetzung für einen kausalen Zusammenhang zwischen LTD und motorischem Lernen angesehen. Hier zeigen wir die Verwendung mehrerer Protokolle zur Beurteilung von LTD, die über Kompensationsmechanismen bei genmanipulierten Tieren induziert werden können. Vor der Ernte des Gehirns, kühlen und sauerstoffig zwei 50 Milliliter Becher von ACSF auf Eis.Wenn die Lösungstemperatur unter vier Grad Celsius liegt, fügen Sie 50 Mikroliter eines Millimolaren Tetrodotoxins zu einem der eiskalten Becher hinzu. Um das Gehirn zu ernten, halten Sie den Kopf und verwenden Sie ophthalmologische Schere, um die oberflächliche Haut entlang der Mittellinie zu schneiden. Ziehen Sie die Haut manuell zurück, um die Schädeloberfläche weit freizulegen, und schneiden Sie mit der Schere den Schädel horizontal vom großen spinokerebellären Loch bis knapp über den Augen und Ohren entlang, bevor Sie den Schädel entlang einer Linie über beiden Augen schneiden.Verwenden Sie ein Skalpell, um das Gehirn in der Mitte des Großhirns zu schneiden und den kaudalen Teil des Gehirns, einschließlich des Kleinhirns, vom Schädel zu isolieren. Tauchen Sie die Probe in den eiskalten Becher von ACSF ein und stellen Sie die Blasenschläuche so ein, dass sie den Hirnblock im Becher nicht rühren. Nach mindestens sieben Minuten, verwenden Sie einen Spachtel, um den Gehirnblock zu nehmen und verwenden Sie ein Stück Filterpapier, um überschüssige ACSF zu absorbieren.Montieren Sie die Gewebe-Ventralseite auf ein zwei mal zwei Zentimeter großes Stück Agar mit einem geeigneten medizinischen Klebstoff. Verwenden Sie eine Klinge, um die rechte Hemisphäre des Hirngewebes so parallel zur dendritischen Ebene der Purkinje-Zellen wie möglich auszuschneiden. Schneiden und entfernen Sie die andere Seite der Hemisphäre und schneiden Sie das Gehirn zwischen dem überlegenen und unteren Colliculi.Schneiden Sie das Rückenmark ab und kleben Sie die rechte Seite des getrimmten Kleinhirns mit dem Agarblock auf das vorgekühlte Probentablett. Dann kippen Sie das Probentablett, gießen Sie ACSF auf die Probe, um das Gewebe zu fixieren und überschüssigen Klebstoff wegzuwaschen. Um die Hirnprobe in Scheiben zu schneiden, orientieren Sie die Probe so, dass die dorsale Seite des Kleinhirns an der Vorderseite ist, und gießen Sie genug von dem eiskalten Schneiden ACSF mit Tetrodotoxin ergänzt, um das Kleinhirn vollständig einzutauchen.Legen Sie ein Gasrohr in die Schneidlösung und initiieren Sie das Blasen mit einem Sauerstoff-Kohlendioxid-Gasgemisch. Mit feiner Pinzette und Lupen entfernen Sie die Arachnoide Mater und verbrauchen den Kleinhirn-Pedunkel. Nach dem Entfernen des Hirnstamms und des Agarblocks drehen Sie die Schale um 180 Grad, so dass die dorsale Oberfläche des Kleinhirns der Rasierklinge des Vibratom gegenübersteht, und passen Sie die erste Schnittposition an.Stellen Sie die Vibratome-Amplitude auf 5,5 und die Frequenz auf 85 Hertz, die Geschwindigkeit auf drei bis vier und die Scheibendicke auf 300 Mikrometer. Wenn die Kleinhirnscheiben erhalten werden, verwenden Sie ein Nylonnetz, um die Abschnitte in einem 26 Grad Celsius Wasserbad in einen Acryl-Inkubator zu übertragen und die Proben mindestens eine Stunde lang vollständig in frisches, mit Sauerstoff versorgtes ACSF einzutauchen. Für die Meldung von ganzzelligen Pflasterklemmen ein mikromolares Pikrotoxin in ACSF durch Ultasonication drei Minuten lang auflösen, bevor eine 30 Grad Celsius Aufnahmekammer mit der Toxinlösung bei einer Durchflussrate von zwei Millilitern pro Minute durchdringend wird.Nach einigen Minuten eine Kleinhirnscheibe in die Aufnahmekammer geben und das Gewebe mit platinen- und Nylonfäden fixieren. Dann eine anregende Elektrode mit frischem ACSF füllen. Um die parallelen Fasern zu stimulieren, legen Sie die stimulierende Elektrode auf die Oberfläche der Molekülschicht etwa 50 Mikrometer aus der Purkinje-Zellschicht.Zur Stimulation der Kletterfasern legen Sie die stimulierende Elektrode an den Boden der Purkinje-Zellschicht und füllen Sie mit einem Mikrolader eine Aufnahmeelektrode mit acht Mikrolitern 0,45 Mikrometer gefilterter Kalium- oder Cäsium-basierter Internienlösung. Tragen Sie einen schwachen positiven Druck auf die Aufnahmeelektrode auf, bevor Sie die Elektrode in den ACSF eintauchen. Der Elektrodenwiderstand sollte zwei bis vier Megaohm betragen und das flüssige Anschlusspotential korrigiert werden.Nähern Sie sich dem gesunden hellen Zellkörper einer Purkinje-Zelle mit der Aufnahmeelektrode und drücken Sie die Oberfläche der Purkinje-Zelle leicht. Dann aufhören, den positiven Druck anzuwenden und unterdruck zu machen, bis eine Gigaohm-Dichtung gebildet wird. Verwenden Sie dann untere Druck, um eine ganze Zellkonfiguration zu etablieren, wobei das Membranpotenzial bei minus 70 Millivolt erhalten bleibt und ein Minus von zwei Millivolt-100-Millisekunden-Impulsen bei 0,1 Hertz angewendet wird, kontinuierlich den Eingangswiderstand, den Reihenwiderstand und die Eingangskapazität überwachen.Für eine langfristige Depressionsinduktion stimulieren Sie die molekulare Schicht mit einem 0,1 Millisekunden-Impuls und wenden Sie einen Doppelpulsreiz an, um die parallelfaserexzitatorischen postsynaptischen Ströme zu identifizieren. Eine gepaarte Pulserleichterung und eine allmähliche Erhöhung der Amplitude im Verhältnis zur Erhöhung der Stimulationsintensität sollten beobachtet werden. Um das Testverhalten aufzuzeichnen, wenden Sie einen einzelnen 0,1 Hertz-Impuls an und passen Sie die Intensität des Stimulus so an, dass die evozierte Amplitude etwa 200 Picoamps beträgt.Stimulieren Sie die Kletterfasern am Boden der Purkinje-Zellschicht und um die parallelfasererexitatorischen postsynaptischen Ströme zu identifizieren, die durch die Aktivierung der Kletterfaser ausgelöst werden, wenden Sie einen doppelten Pulsreiz an. Eine gepaarte Pulsdepression sollte in einer Ganzer oder gar keiner Weise in Korrelation mit der Erhöhung der Stimulationsintensität beobachtet werden. In diesem repräsentativen Experiment wurde eine Konjunktion einer parallelen Faserstimulation und einer Kletterfaserstimulation unter aktuellen Klemmbedingungen für die Scheibenvorbereitung verwendet.Die Form der komplexen Spitze, die durch die Konjunktivstimulation ausgelöst wurde, ähnelte der, die allein durch die Kletterfaserstimulation mit dem ersten steilen Spikelet, gefolgt von zwei bis drei Spikelets, ausgelöst wurde. Eine ähnlich geformte komplexe Spitze wurde beobachtet, als 50 Millisekunden später eine parallele Faserstimulation durch eine konjunktive Zweite parallele und kletterfaserreinstimulation folgte. Bei diesem Test unter Spannungsklemmenbedingungen mit einer Cäsium-basierten internen Lösung wurde 50 Millisekunden später eine parallele Faserstimulation durch eine gleichzeitige Anwendung einer zweiten parallelen Faserstimulation und somatischen Depolarisation verfolgt.Bei der somatomatischen Depolarisation von minus 70 auf null Millivolt wurde ein Innenstrom ausgelöst und der Schwanzstrom wurde auch nach der Repolarisation heraufbeschworen. Schließlich wurden fünf parallele Faserreize bei 100 Hertz gleichzeitig mit der somatischen Depolarisation unter Spannungsklemmenbedingungen gegeben. Auch hier wurde während der Depolarisation eine sich wiederholende Erzeugung von Innerenströmungen ausgelöst und der Schwanzstrom wurde nach der Repolarisation induziert.Um die Beziehung zwischen Kleinhirn-LTD und motorischem Lernen bei genmanipulierten Tieren zu beurteilen, sollten mehrere Protokolle verwendet werden, um LTD unter gemütlichen physiologischen Bedingungen zu induzieren. Wenn Kleinhirn-LTD bei genmanipulierten Tieren nach dem motorischen Lernen visualisiert wird, kann die kausale Beziehung zwischen ihnen direkter untersucht werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieser Artikel beschreibt Verfahren zur Herstellung von Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für die Untersuchung der synaptischen Veränderungen mit Gehirn Altern und altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit.

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

Diese Methode beschreibt die Erzeugung von organotypischen Kleinhirn Kulturen und die Wirkung bestimmter apoptotischen Stimuli auf die Lebensfähigkeit der verschiedenen Zelltypen des Kleinhirns.

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

In diesem Video wurde ein Kleinhirnschnitt der Maus verwendet, um synaptische Wechselwirkungen zwischen parallelen Fasern, Kletterfasern und Purkinje-Zellen zu untersuchen, die für die motorische Kontrolle unerlässlich sind. Die Stimulation der Kletterfasern induzierte eine Langzeitdepression (LTD) in Purkinje-Zellen, die die synaptische Stärke schwächte und zu einer verminderten Reaktion auf parallele Faserstimulation führte.

Induktion von Langzeitdepressionen in zerebellären Purkinje-Neuronen in einem Schnitt des Maus-Gehirns

Studien haben gezeigt, dass die kathodale transkranielle Gleichstromstimulation suppressive Effekte auf arzneimittelresistente Anfälle haben kann. In dieser Studie wurde ein in vitro Versuchsaufbau entwickelt, in dem die Gleichstromstimulation und die Aufzeichnung der anfallsähnlichen Aktivität durch Multielektrodenarrays bei der Präparation von Hirnschnitten von Mäusen evaluiert wurden. Die Gleichstrom-Stimulationsparameter wurden ausgewertet.

Gleichstrom-Stimulation und Multi-Elektroden-Array-Aufnahme von Seizure-ähnliche Aktivität in Mäuse-Gehirn Scheibe Vorbereitung

Dieses Protokoll veranschaulicht die Implementierung einer optimierten N-Methyl-D-Glucamine (NMDG) schützende Wiederherstellungsmethode der Gehirn-Scheibe-Vorbereitung. Eine einziges Medium Formulierung wird verwendet, um Tiere jeden Alters und für verschiedenste experimentelle Anwendungen zuverlässig gesunde Gehirnscheiben einzuholen.

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Dieses Protokoll beschreibt die Stabilisierung der Sauerstoffgehalt in einem kleinen Volumen der recycelten Puffer und methodischen Aspekten der Aufnahme aktivitätsabhängige synaptische Plastizität in getauchten akute hippocampal Scheiben.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Hier präsentieren wir eine Methode um organotypischen Slice Kulturen aus Maus Kleinhirn und Myelinscheide Färbung von Immunohistochemistry geeignet für die Untersuchung von Mechanismen der Myelinisierung und Remyelinisierung in das zentrale Nervensystem vorzubereiten.

Vorbereitung und Immunostaining Myelinating organotypischen zerebelläre Slice Kulturen

Organotypische Scheibenkulturen sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um neuroentwicklungsfördernde oder degenerative/regenerative Prozesse zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das den neuroentwicklungsbedingten Tod von Purkinje-Zellen in Maus-Kleinhirn-Scheibenkulturen modelliert. Diese Methode kann die Forschung in neuroprotektive Arzneimittel Entdeckung profitieren.

Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

Dies ist ein Protokoll zur akuten Scheibenpräparation von erwachsenen und alternden Maus Hippocampi, die Vorteile der transkardialen Perfusion und Schneiden schneiden mit eiskalten NMDG-aCSF nutzt, um hypoxische Schäden am Gewebe zu reduzieren. Die resultierenden Scheiben bleiben über viele Stunden gesund und eignen sich für Langzeit-Patch-Clamp- und Field-Recordings.

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In dieser Arbeit wird gezeigt, wie ein waches geschlossenes Kopfverletzungsmodell verwendet werden kann, um die Auswirkungen eines wiederholten leichten Schädel-Hirn-Traumas (r-mSHT) auf die synaptische Plastizität im Hippocampus zu untersuchen. Das Modell repliziert wichtige Merkmale des r-mSHT bei Patienten und wird in Verbindung mit der in vitro Elektrophysiologie eingesetzt.

Beurteilung von Veränderungen in der synaptischen Plastizität unter Verwendung eines wachen geschlossenen Kopfverletzungsmodells für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Lernen Sie die Induktion von Langzeitdepression in zerebellären Purkinje-Zellen mittels Elektrophysiologie und Patch-Clamp-Technik. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung synaptischer Plastizität in genmanipulierten Tieren.

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

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