Name: Identifizierung von Inositolphosphat oder Phosphoinositid-Wechselwirkungsproteinen durch Affinitätschromatographie gekoppelt an Western Blot oder Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Lernen Sie die Affinitätschromatographie zur Identifizierung von Inositolphosphat- oder Phosphoinositid-bindenden Proteinen durch Western Blot oder Massenspektrometrie. Diese empfindliche, nicht-radioaktive Methode ermöglicht die Untersuchung regulatorischer Protein-Wechselwirkungen in eukaryotischen Zellen.

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Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC, RGPIN-2019-04658) unterstützt. NSERC Discovery Launch Supplement for Early Career Researchers (DGECR-2019-00081) und von der McGill University.

Der Autor hat nichts zu verraten.

Die Identifizierung von Proteinen, die an IPs oder PIs binden, ist entscheidend, um die zelluläre Funktion dieser Metaboliten zu verstehen. Die Affinitätschromatographie, gekoppelt mit der Westlichen Fleck- oder Massenspektrometrie, bietet die Möglichkeit, IP- oder PI-interagierende Proteine zu identifizieren und so Einblicke in ihre regulatorische Funktion zu gewinnen. IPs oder PIs, die chemisch getaggt sind [z.B., Ins(1,4,5)P3, die chemisch mit Biotin verbunden sind] und über Streptavidin mit Agaroseperlen verbunden od...

Inositolphosphate (IPs) und Phosphoinositide (PIs) spielen eine zentrale Rolle in der Eukaryotenbiologie durch die Regulierung zellulärer Prozesse wie die Kontrolle der Genexpression1,2,3, Vesikelhandel 4, Signaltransduktion5,6, Stoffwechsel7,8,9, und Entwicklung8,10. Die regulatorische Funktion dieser Metaboliten ergibt sich aus ihrer Fähigkeit, mit Proteinen zu interagieren und damit die Proteinfunktion zu regulieren. Bei Bindung durch Proteine können IPs und PIs die Proteinkonformation11, die katalytische Aktivität12oder Wechselwirkungen13 verändern und somit die zelluläre Funktion beeinflussen. IPs und PIs sind in mehreren subzellulären Kompartimenten verteilt, wie z. B. Kern2,3,14,15, endoplasmatisches Retikulum16,17, Plasma Membran1 und Cytosol18, entweder verbunden mit Proteinen3,19 oder mit RNAs20.
Die Spaltung des membranassoziierten PI(4,5)P2 durch Phospholipase C führt zur Freisetzung von Ins(1,4,5)P3, das durch IP-Kinäsen bzw. Phosphatasen phosphoryliert oder dephosphoryliert werden kann. IPs sind lösliche Moleküle, die an Proteine binden und regulatorische Funktionen ausüben können. Zum Beispiel kann Ins(1,4,5)P3 in Metazoan als zweiter Botenstoff durch Bindung an IP3-Rezeptoren fungieren, was Rezeptor-Konformationsänderungen induziert und somit Ca2+ aus intrazellulären Speichern freigibt11. Ins(1,3,4,5)P4 bindet an den Histon-Deacetylase-Komplex und reguliert die Proteinkomplex-Montage und -Aktivität13. Weitere Beispiele für iPs Regulatorische Funktion sind die Kontrolle der Chromatin-Organisation21, RNA-Transport22,23, RNA-Editing24und Transkription1,2,3 . Im Gegensatz dazu werden PIs oft mit der Rekrutierung von Proteinen an die Plasmamembran oder Organelle Membranen25assoziiert. Eine neu entstehende Eigenschaft von PIs ist jedoch die Fähigkeit, mit Proteinen in einer nicht-membranösen Umgebungzuassoziieren 3,15,19,26. Dies ist der Fall des steroidogenen Kernrezeptors, dessen Transkriptionskontrollfunktion durch PI(3,4,5)P319reguliert wird, und Poly-A-Polymerase, deren enzymatische Aktivität durch kerntechnische PI(4,5)P226reguliert wird. Eine regulierende Rolle für IPs und PIs wurde in vielen Organismen gezeigt, einschließlich Hefe22,27, Säugetierzellen19,23, Drosophila10 und Würmer28. Von Bedeutung ist die Rolle dieser Metaboliten bei Trypanosomen, die früh von der eukaryotischen Abstammung abwichen. Diese Metaboliten spielen eine wesentliche Rolle bei Trypanosoma brucei Transkriptionskontrolle1,3, Entwicklung8, Organelle Biogenese und Proteinverkehr29,30 , 31 , 32, und sind auch an der Kontrolle der Entwicklung und Infektion in den Erregern T. cruzi33,34,35,Toxoplasma36 und Plasmodium beteiligt 5 , 37. Daher kann das Verständnis der Rolle von IPs und PIs bei Trypanosomen dazu beitragen, neue biologische Funktionen für diese Moleküle aufzuklären und neue Wirkstoffziele zu identifizieren.
Die Spezifität von Protein- und IP- oder PI-Bindung hängt von Protein-Interagierenden Domänen und dem Phosphorylierungszustand des Inositols13,38ab, obwohl Wechselwirkungen mit dem Lipidteil von PIs ebenfalls 19 auftreten. Die Vielfalt der IPs und PIs und ihre modifizierenden Kinoseen und Phosphatasen bieten einen flexiblen zellulären Mechanismus zur Kontrolle der Proteinfunktion, der durch die Verfügbarkeit und Häufigkeit von Metaboliten, den Phosphorylierungszustand des Inositols und das Protein beeinflusst wird. Affinität der Interaktion1,3,13,38. Obwohl einige Proteindomänen gut charakterisiert sind39,40,41, z.B. Pleckstrin-Homologie-Domäne42 und SPX (SYG1/Pho81/XPR1) Domains43 ,44,45, einige Proteine interagieren mit IPs oder PIs durch Mechanismen, die unbekannt bleiben. Zum Beispiel fehlt dem Repressor-Aktivator-Protein 1 (RAP1) von T. brucei kanonische PI-bindende Domänen, sondern interagiert mit PI(3,4,5)P3 und kontrolliert die Transkription von Genen, die an antigener Variation beteiligt sind3. Affinitätschromatographie und Massenspektrometrieanalyse von IP- oder PI-interagierenden Proteinen aus Trypanosom-, Hefe- oder Säugetierzellen identifizierten mehrere Proteine ohne bekannte IP- oder PI-bindende Domänen8,46, 47. Die Daten deuten auf zusätzliche nicht charakterisierte Proteindomänen hin, die an diese Metaboliten binden. Daher kann die Identifizierung von Proteinen, die mit IPs oder PIs interagieren, neue Mechanismen der Protein-Metabolit-Interaktion und neue zelluläre Regulierungsfunktionen für diese kleinen Moleküle offenbaren.
Die hier beschriebene Methode verwendet Affinitätschromatographie gekoppelt mit western blotting oder Massenspektrometrie, um Proteine zu identifizieren, die an IPs oder PIs binden. Es verwendet biotinylierte IPs oder PIs, die entweder mit Streptavidin verbunden sind, konjugiert mit Agaroseperlen oder alternativ über streptavidin-konjugierte Magnetperlen gefangen werden (Abbildung 1). Die Methode bietet einen einfachen Workflow, der empfindlich, nicht radioaktiv, liposomenfrei ist und sich zum Nachweis der Bindung von Proteinen aus Zelllysaten oder gereinigten Proteinen eignet3 (Abbildung 2). Das Verfahren kann in etikettenfreien8,46 oder gekoppelt an Aminosäure-markierte quantitative Massenspektrometrie47 verwendet werden, um IP- oder PI-bindende Proteine aus komplexen biologischen Proben zu identifizieren. Daher ist diese Methode eine Alternative zu den wenigen verfügbaren Methoden, um die Wechselwirkung von IPs oder PIs mit zellulären Proteinen zu untersuchen und wird dazu beitragen, die regulatorische Funktion dieser Metaboliten bei Trypanosomen und vielleicht anderen Eukaryoten zu verstehen.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>Keton</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td>Lösungsmittel&nbsp;</td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141</td> Zentrifuge für <td>anorganisches Salz</td></tr><tr><td>Avanti J6-MI</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J6-MI</td><td>Zentrifuge für große Volumina (z. B. 1 l)</td></tr><tr><td>Zentrifugenflaschen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1408</td><td>Flaschen für die Zentrifugation von 1 l Kultur</td></tr><tr><td>Kontrollperlen</td><td>Echelon</td><td>P-B000-1ml</td><td>Affinitätschromatographie-Reagenz - Kontrolle</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Zucker, zugesetzt in PBS, um die Zellen lebensfähig zu halten</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610610</td><td>Reduktionsmittel</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65305</td><td>Streptavidin-Kügelchen zur Bindung an Biotin-Liganden</td></tr><tr><td>EDTA-freier Proteasehemmer Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Proteasehemmer</td></tr><tr><td>Elektrophorese-Laufpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1 % SDS, pH 8,3</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430052</td><td>Zum Zentrifugieren von 10 mL Kulturen</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>106526</td><td>Säure</td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td>Aminosäure</td></tr><tr><td>HMI-9 Zellkulturmedium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ME110145P1</td><td>Zellkulturmedium für T. brucei Blutbahnformen</td></tr><tr><td>Imperial Protein Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24615</td><td>Coomassie-Färbung für den Proteinnachweis in SDS/PAGE</td></tr><tr><td>Ins(1,4,5)P3 Beads</td><td>Echelon</td><td>Q-B0145-1ml</td><td>Reagenz für die Affinitätschromatographie&nbsp;</td></tr><tr><td>Sofort&nbsp; Fettfrei&nbsp; Trocken &nbsp; Milk</td><td>Thomas Scientific</td><td>C837M64</td><td>Blockierungsreagenz für Western Blotting</td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>Alkylierungsreagenz für Cysteinproteine oder Peptide</td></tr><tr><td>Lab&nbsp; Rotator</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159Z92</td><td>Für Bindungsassays</td></tr><tr><td>LoBind Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-698-793</td><td>Röhrchen mit geringer Proteinbindung für die Massenspektrometrie</td></tr><tr><td>Nonidet&nbsp; P-40 (Igepal CA-630)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21-3277</td><td>Detergens</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010031</td><td>Physiologischer Puffer</td></tr><tr><td>Peroxidase-Substrat für Chemilumineszenz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32106</td><td>Substrat für den Western Bloting Nachweis von Proteinen</td></tr><tr><td>PhosSTOP Phosphatase-Inhibitor Cocktail Tabletten</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td>Phosphatase Inhibitoren</td></tr><tr><td>PI(3)P PIP Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B003a-1ml</td><td>Reagenz für die Affinitätschromatographie&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,4)P2 PIP Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B034a-1ml</td><td>Reagenz für die Affinitätschromatographie&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,4,5)P3 diC8</td><td>Echelon</td><td>P-3908-1mg</td><td>Reagenz für die Affinitätschromatographie</td></tr><tr><td>PI(3,4,5)P3 PIP Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B345a-1ml</td><td>Reagenz für die Affinitätschromatographie&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(3,5)P2 PIP Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B035a-1ml</td><td>Reagenz für die Affinitätschromatographie&nbsp;</td></tr><tr><td>PI(4)P PIP Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B004a-1ml</td><td>Reagenz für die Affinitätschromatographie</td></tr><tr><td>PI(4,5)P2 diC8</td><td>Echelon</td><td>P-4508-1mg</td><td>Reagenz für die Affinitätschromatographie</td></tr><tr><td>PI(4,5)P2 PIP Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B045a-1ml</td><td>Reagenz für die Affinitätschromatographie</td></tr><tr><td>PI(5)P PIP Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B005a-1ml</td><td>Reagenz für die Affinitätschromatographie</td></tr><tr><td>Ponceau S Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>Proteinfärbung (0,1 % [w/v] in 5 % Essigsäure)</td></tr><tr><td>Kaliumhexacyanoferrat(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>702587</td><td>Kaliumsalz&nbsp;</td></tr><tr><td>PtdIns PIP Beads</td><td>Echelon</td><td>P-B001-1ml</td><td>Reagenz für die Affinitätschromatographie&nbsp;</td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td>für Western Blotting&nbsp;</td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5910 R</td><td>Mikrozentrifuge für kleine Volumina (z.B. 1,5 mL)</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010</td><td>Reinigungsmittel</td></tr><tr><td>Natriumthiosulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72049</td><td>Chemisch&nbsp;</td></tr><tr><td>SpeedVac Vakuumkonzentratoren</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SPD120-115</td><td>Probenkonzentration (z.B. für die Massenspektrometrie)</td></tr><tr><td>T175 Kolben für Zellkultur&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>159910</td><td>Zur Züchtung von 50 mL T. brucei Kultur</td></tr><tr><td>Trypsin, Massenspektrometrie Grade</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>Trypsin für den Proteinaufschluss</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td>Denaturierungsreagenz</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-418</td><td>Für Mischreaktionen</td></tr><tr><td>Western Blot Transferpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610734</td><td>25 mM Tris, 192 mM Glycin, pH 8,3 mit 20 % Methanol</td></tr><tr><td> 3 mm Papier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA3030861</td><td>Papier für Wester Transfer</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (14,2 M)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td>Reduktionsmittel</td></tr><tr><td>2x Laemmli Probenpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>Protein-Ladepuffer</td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN&nbsp; TGX Precast Protein Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>4561094</td><td>Gel für die Proteinelektrophorese</td></tr><tr><td>4x Laemmli Probenpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0747</td><td>Protein-Ladepuffer</td></tr></tbody></table>

identifizierung von inositolphosphat oder phosphoinositid-wechselwirkungsproteinen durch affinitätschromatographie gekoppelt an western blot oder massenspektrometrie

Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry

Inositolphosphate und Phosphoinositide regulieren mehrere zelluläre Prozesse in Eukaryoten, einschließlich Genexpression, Vesikelhandel, Signaltransduktion, Stoffwechsel und Entwicklung. Diese Metaboliten führen diese regulatorische Aktivität durch Bindung an Proteine durch und verändern dadurch die Proteinkonformation, die katalytische Aktivität und/oder die Wechselwirkungen. Die hier beschriebene Methode verwendet Affinitätschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie oder Western Blotting, um Proteine zu identifizieren, die mit Inositolphosphaten oder Phosphoinositiden interagieren. Inositolphosphate oder Phosphoinositide werden chemisch mit Biotin markiert, das dann über Streptavidin konjugiert zu Agarose oder magnetischen Perlen gefangen wird. Proteine werden durch ihre Affinität zur Bindung an den Metaboliten isoliert, dann eluiert und durch Massenspektrometrie oder Western Blotting identifiziert. Die Methode verfügt über einen einfachen Workflow, der empfindlich, nicht radioaktiv, liposomenfrei und anpassbar ist und die Analyse der Protein- und Metaboliteninteraktion präzise unterstützt. Dieser Ansatz kann in etikettenfreien oder in aminosäuremarkierten quantitativen Massenspektrometriemethoden verwendet werden, um Protein-Metabolit-Wechselwirkungen in komplexen biologischen Proben oder mit gereinigten Proteinen zu identifizieren. Dieses Protokoll ist für die Analyse von Proteinen aus Trypanosoma bruceioptimiert, kann aber an verwandte protozoische Parasiten, Hefe- oder Säugetierzellen angepasst werden.

Analyse der RAP1- und PI(3,4,5)P3-Wechselwirkung durch Affinitätschromatographie und Western Blotting Dieses Beispiel veranschaulicht die Anwendung dieser Methode zur Analyse der Bindung von PIs durch RAP1 aus T. brucei lysate oder durch rekombinantes T. brucei RAP1-Protein. Lysate von T. brucei Blutbahnformen, die Hemagglutinin (HA)-getaggt RAP1 ausdrücken, wurden in Bindungstests verwendet. RAP1 ist ein Protein, das an der transkriptionellen Kontrolle der Varianten-Oberflä...

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Identifizierung von Proteinen, die an Inositolphosphate oder Phosphoinositide binden. Es verwendet Affinitätschromatographie mit biotinylierten Inositolphosphaten oder Phosphoinositiden, die über Streptavidin zu Agarose oder magnetischen Perlen immobilisiert werden. Inositolphosphat oder Phosphoinositid-bindende Proteine werden durch western blotting oder Massenspektrometrie identifiziert.

Identifizierung von Inositolphosphat oder Phosphoinositid-Wechselwirkungsproteinen durch Affinitätschromatographie gekoppelt an Western Blot oder Massenspektrometrie

Inositol phosphates and phosphoinositides regulate several cellular processes in eukaryotes, including gene expression, vesicle trafficking, signal ...

Inositolphosphat und Phosphoinositide sind Metaboliten, die mehrere regulatorische Funktionen in Eukaryoten haben, einschließlich der Kontrolle der Genexpression, Proteinhandel, Signaltransduktion und Zellentwicklung. Sie erfüllen diese regulatorische Funktion durch Bindung an Proteine und verändern dadurch die Proteinkonformation, katalytische Aktivität oder Proteinwechselwirkungen. Die Identifizierung von Proteinen, die an Inositphosphat oder Phosphoinositide binden, ist wichtig, um zu verstehen, wie diese Metaboliten ihre regulatorische Funktion erfüllen.Dieses Protokoll verfügt über einen einfachen Workflow, der empfindlich, nicht radioaktiv, lyposomefrei ist und Reagenzien verwendet, die im Handel erhältlich sind. Bei dieser Methode wird eine fertige Chromatographie mit biotinyolphosphat oder Phosphoinositiden verwendet, um interagierende Proteine zu isolieren, sie werden dann durch Western Blot oder Massenspektrometrie identifiziert. Für Blutstromformen, wachsen T.brucei Zellen bis zur mittleren Log-Phase in HMI-9-Medien, ergänzt mit 10%FBS, bei 37 Grad Celsius, mit 5%Kohlendioxid.Halten Sie die Zelldichte zwischen 800, 000 und 1,6 Millionen Zellen pro Milliliter. Wenn sie bereit sind, zentrieren Sie die Zellen bei 1600 mal G und bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet vorsichtig in 10 Milliletres PBS-G vorerhitzt bei 37 Grad Celsius, um die Zellen zu waschen.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1600 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten, um die Wäsche abzuschließen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch zweimal. Dann setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS-G wieder auf.Übertragen Sie diese Suspension auf ein Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Rohr, dann Zentrifuge bei 1600 mal G für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in Nullpunkt fünf Milliliter Lysepuffer, ergänzt mit einem Punkt fünf X Protease-Hemmer-Cocktail, und ein X Phosphatase-Hemmer-Cocktail, der auf Eis vorgekühlt wurde, um die Zellen zu lysieren. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 1400 mal G und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.Danach sammeln Sie den Überstand, der die extrahierten Parasitenproteine enthält, in eine neue Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Röhre für die Bindungstests. 5 % des gesamten Lysats für die Western Blot-Analyse beiseite legen. Sammeln Sie 50 Mikroliter Inositolphosphate oder Phosphoinositide konjugiert zu Agarose Perlen, und fügen Sie sie 500 Milliliter Bindungpuffer.Zentrifuge bei 1000 mal G für eine Minute. Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie ihn in 50 Mikroliter Bindungspuffer aus, um die Perlen auszulagern. Verwenden Sie nicht konjugierte Perlen als Kontrolle, und verwenden Sie Perlen mit verschiedenen Phosphatkonfigurationen, einschließlich nicht-phosphorylierter Formen, um unspezifische Wechselwirkungen zu kontrollieren.Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter IP- oder PI-Perlen in das Zelllysat oder die gereinigten Proteine ein. Halten Sie das Volumen der Perlen innerhalb von 10% des gesamten Lysats. Verwenden Sie ggf. den Bindungspuffer, um das Volumen der Bindungsreaktion anzupassen.Inkubieren Sie die Reaktion entweder für eine Stunde oder über Nacht bei vier Grad Celsius, während sie sich bei 50Rpm dreht. Danach zentrifugieren Sie die Mischung bei 1000 mal G, und bei vier Grad Celsius für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand, und halten Sie das Pellet, stellen Sie sicher, 5% des Überstandes für western Blot Analyse zu halten.Dann fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer und tippen oder wirbeln Sie das Rohr, um das Harz wieder aufzuhängen. Zentrifugieren Sie die Reaktion bei 1000 mal G und bei vier Grad Celsius für eine Minute, und werfen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt fünf Wähbe.Danach 50 Mikroliter 2X Laemmli Puffer mit 710 Millimolar 2-Mercaptoethanol zu den Perlen ergänzen. Tippen oder Wirbel, um die Proteine zu mischen, und verdünnen Sie sie. Als nächstes erhitzen Sie bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, und Zentrifuge bei 10.000 mal G für eine Minute.Sammeln Sie den Überstand, und frieren Sie entweder das Eluat bei minus 80 Grad Celsius, oder gehen Sie zur Western Blot Analyse. Die hier vorgestellte Methode wird verwendet, um die Bindung von PIs durch Repressor-Aktivatorprotein 1 aus T.brucei Lysat oder durch rekombinantes T.brucei Repressor-Aktivatorprotein 1 Protein 1 zu analysieren. Da RAP1 kanonische PI-Bindungsdomänen fehlen, werden die Bindungstests mit PIs durchgeführt, die nicht phosphoryliert sind oder die an verschiedenen Positionen des Inositolrings phosphoryliert sind, und mit nicht konjugierten Agaroseperlen.Die westliche Analyse zeigt, dass RAP1 bevorzugt an PI(3, 4, 5)P3-Perlen bindet, aber auch in geringerem Maße an PI(4, 5)P2-Perlen bindet. Es bindete jedoch nicht an andere PIs oder Agarose-Perlen. Um zu testen, ob RAP1 direkt an PIs bindet, wird ein C-terminal mit 6XHis rekombinantem RAP1-Protein versehen und von E.Coli zur Homogenität gereinigt.Western Blotting zeigt, dass die Erhöhung der Konzentration von PI(3, 4, 5)P3, aber nicht PI(4, 5)P2, die Wechselwirkung von rekombinantem RAP1 mit PI(3, 4, 5)P3 Perlen hemmt. Die Zugabe von T.brucei gereinigtPIP5Pase Enzym der Reaktion wiederhergestellt PI(3, 4, 5)P3 Bindung durch rekombinante RAP1. Dies ist auf die PIP5Pase-Dephosphorylierung der freien PI(3, 4, 5)P3 zurückzuführen und weist somit darauf hin, dass das Phosphorylierungsmuster dieses Metaboliten für unsere RAP1-Bindung unerlässlich ist.T.brucei-Proteine, die an Ins(1, 4, 5)P3 binden, werden dann durch Affinitätschromatographie gefolgt von Massenspektrometrie identifiziert. Die SDS-PAGE-Analyse zeigt die Anreicherung von Proteinen, die von Ins(1, 4, 5)P3-Perlen eluiert werden, im Vergleich zu Proteinen, die aus den Kontrollagaroseperlen eluiert werden. Die Massenspektrometrieanalyse der eluierten Proteine identifizierte über 250 Proteine, von denen 84 mit Ins(1, 4, 5)P3-Perlen angereichert waren, verglichen mit Kontrollperlen.Die Anreicherung von Proteinen, die an Ins(1, 4, 5)P3 gebunden sind, im Vergleich zu Kontrollperlen, korreliert mit dem von SDS-PAGE nachgewiesenen Proteinsignal. Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die Verwendung geeigneter Kontrollen, um bestimmte von nicht spezifischen Interaktionen zu unterscheiden. Wir empfehlen die Verwendung nicht konjugierter Agaroseperlen und mit Inositolphosphat oder Phosphoinositiden konjugierter Perlen mit verschiedenen Phosphatkonfigurationen, einschließlich nicht phosphorylierter Formen.Diese Methode kann auf andere einzellige protozoische Parasiten angewendet werden, wie Trypanosoma cruzi, Leishmanie oder Plasmodium. Es kann auch leicht an andere Organismen angepasst werden, einschließlich Hefe oder Säugetierzellen. Diese Methode kann an die quantitative Massenspektrometrie wie SILAC gekoppelt werden, um dynamische Wechselwirkungen von Proteinen mit Inositphosphat oder Phosphoinostiden zu identifizieren.In kann auch mit subzellulärer Fraktionierung kombiniert werden, um organelle spezifische Proteine zu identifizieren, die an diese Metaboliten binden. Dieser Ansatz hat dazu beigetragen, Proteine zu identifizieren, die an Inositolphosphat und Phosphoinositide in T.brucei, Säugetierzellen und Hefe binden. Es hat dazu beigetragen, neue Proteindomänen zu identifizieren, die an Phosphoinositide binden.Es hat den Weg geebnet, um die regulatorische Funktion dieser Metaboliten, ihre Rolle bei der Genexpression, Zellentwicklung und Signaltransduktion in Eukaryoten zu verstehen. Einige der Reagenzien in diesem Protokoll sind giftig oder entzündlich. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung, und, wenn nötig, arbeiten Sie in einer Dunstabzugshaube.

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Biochemie

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Identifizierung von Inositolphosphat oder Phosphoinositid-Wechselwirkungsproteinen durch Affinitätschromatographie gekoppelt an Western Blot oder Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal

Identifizierung von Inositolphosphat oder Phosphoinositid-Wechselwirkungsproteinen durch Affinitätschromatographie gekoppelt an Western Blot oder Massenspektrometrie

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