Name: Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Lernen Sie die waschmittelunterstützte Rekonstitution von Drosophila Atlastin in Liposomen für FRET-basierte Lipid-Mischtests. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen von Membranfusionsproteinen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken Dr. Michael Stern und seinem Labor für ihre Erkenntnisse und Ihr Feedback zu atlastin bezogenen Projekten. Diese Arbeit wurde vom National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] und dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke [R01NS102676] unterstützt.

1. Reinigung von GST-DAtl-His8
<ol><li>
Proteinexpression und Lysatzubereitung
	<ol>
<li>Transformieren Sie BL21 (DE3) E. coli mit dem GST-DAtl-His8-Konstrukt in pGEX4-T32 und wählen Sie auf einer Ampicillinplatte.</li>
		<li>Wählen Sie ein einzelnes Transformant und impfen 5 ml LB + Ampicillin (5 l von 100 mg/ml Ampicillin) in einem 14 ml Kulturrohr und inkubieren bei 25 °C mit Schütteln bei 200 U/min für 6-8 h. HINWEIS: Aufgrund der undichten Expression wird nicht empfohlen, bei höheren Temperaturen zu brüten. Das Wachstum bei 25 °C reduziert die Proteinaggregation während dieser Wachstumsphase.</li>
		<li>200 ml LB + Ampicillin mit 1 ml der 5 ml Kultur impfen und über Nacht bei 25 °C inkubieren .15–18 h.</li>
		<li>Am nächsten Morgen ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation (2.000 x g für 10 min) und suspendieren Sie in 5 ml LB.</li>
		<li>4 L LB + Ampicillin impfen und OD600 (0,05–0,15) messen. Bei 25 °C mit Schütteln bebrüten. HINWEIS: Reservieren Sie einige Medien, um als Rohling für die OD600 Messungen zu dienen, bevor Sie Bakterien hinzufügen.</li>
		<li>Messen Sie OD600 stündlich, bis ein OD zwischen 0,4 und 0,5 erreicht wird. An dieser Stelle die Temperatur auf 16 °C reduzieren.</li>
		<li>Induzieren mit 0,2 mM IPTG (800 l von 1 M Vorrat), 10 min nach dem Inkubator erreicht 16 °C. Über Nacht bei 16 °C inkubieren .15–18 h. HINWEIS: Die niedrigere Temperatur verbessert die Ausbeute des funktionellen Proteins, indem die Aggregation von Atlastin reduziert wird.</li>
		<li>Am nächsten Morgen ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 7.500 x g bei 4 °C.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen in 200 ml A200 (25 mM HEPES (pH 7,4) und 200 mM KCl) wieder aus.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 11.000 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
		<li>Das Pellet in 40 ml Bruchpuffer (A200 plus 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 4% Triton X-100 (TX100), 40mM Imidazol und eine EDTA-freie Protease-Hemmer-Cocktailtablette wieder aufsetzen. HINWEIS: Fügen Sie TX-100 nach dem Wiederaufsetzen hinzu, um Blasen und Schaum zu vermeiden.</li>
		<li>Durchqueren Sie eine 18 G Nadel und führen Sie die Zellen dreimal bei 10.000 psi durch einen Zellstörer.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie den Extrakt bei 125.000 x g für 1 h. HINWEIS: Optional das Pellet 1:2 (w:v) in 8 M Harnstoff auflösen und bei Raumtemperatur über Nacht nussen. Harnstoff als Denaturierungsmittel löst für die SDS-PAGE-Analyse langsam jedes unlösliche Pelletprotein auf. Sparen Sie 1 L für die SDS-PAGE- und Coomassie-Fleckenanalyse.</li>
		<li>Filtern Sie den Extrakt durch einen 0,45 m großen Zellstoffnitrat-Sterilmembranfilter, um Bakterien und große bakterielle Ablagerungen zu entfernen. HINWEIS: Optional sparen Sie 1 L für sDS PAGE und Coomassie Fleckenanalyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proteinreinigung durch Affinitätschromatographie
	<ol>
<li>Das gefilterte Lysat auf eine immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) Harzsäule mit Ni2+laden, vorausgeglichen mit niedrigem Imidazolpuffer (A100 plus 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 1% TX-100, 40 mM Imidazol) mit einer Rate von 1 ml/ min bei 4 °C.</li>
		<li>Die Säule mit 25 ml A100 plus 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100, 40 ml Imidazol mit einer Rate von 1 ml/min bei 4°C waschen. Elute das Protein mit einem 30 ml linearen Gradienten von Imidazol von 40 mM bis 500 mM, und eine abschließende 5 ml Waschen bei 500 mM.</li>
		<li>Spitzenfraktionen zusammenspulen und 1 h bei 4 °C mit geschwollenen GSH-Agarose-Perlen, die zuvor in Wasser geschwollen und in A100 mit 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100 und 1 mM EDTA ausgeglichen wurden, inkubieren. HINWEIS: GSH-Agarose Perlen können in 50 ml Wasser am Vortag geschwollen und über Nacht bei 4 °C oder für 1 h bei RT inkubiert werden. Um Wasser und Ausgleichspuffer zu entfernen, zentrifugieren Sie in einem schwingenden Schaufelrotor bei 500 x g für 1 min ohne Bremse. Aspirieren Sie den Überstand mit einer 26 G Nadel.</li>
		<li>Pellet GSH-Agarose Perlen durch Zentrifugieren in einem schwingenden Schaufelrotor bei 500 x g ohne Bremse und entfernen Sie den Lysatüberstand durch Aspiration mit einer 26 G Nadel.</li>
		<li>Die Perlen in eine 10 ml Polyprep-Säule geben und fünfmal mit 5 ml Ausgleichspuffer (A100 mit 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1% Anapoe X-100 und 1 mM EDTA) durch Zentrifugieren bei 500 x g waschen.
</li>
		<li>Elute das Protein mit 1–1,5 ml Gleichgewichtspuffer ergänzt mit 10 mM reduziertglutathion. Aliquot eluted Protein und Flash Gefrieren in flüssigem Stickstoff. Protein kann bei -80 °C unbegrenzt gelagert werden. HINWEIS: PH des Elutionspuffers auf 7.4 einstellen.</li>
		<li>Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration durch amido schwarzen Protein-Assay9 und bewerten Sie die Reinheit durch SDS-PAGE- und Coomassie-Färbung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Rekonstitution von rekombinantes Atlastin in Liposomen
<ol><li>Liposomenproduktion durch Extrusionsverfahren 10<ol>
<li>Herstellung von Lipidmischungsvorräten in Chloroform (10 mM Gesamtfett). Die notwendigen Lipide sind 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-Glycero-3-Phosphocholin (POPC), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-L-Serin (DOPS), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (NBD-DPPE) und 1,2- Dipalmitoyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin-N-(Lissamine Rhodamin B Sulfonyl) (Rh-DPPE). Akzeptor-Liposomen bestehen aus POPC: DOPS (85:15 Molarenverhältnis) und Spenderliposomen von POPC:DOPS:Rh-PE:NBD-PE (83:15:1.5:1.5 Molar ratio). HINWEIS: Während POPC:DOPS Lipidmischungen traditionell für In-vitro-Lipid-Mixing-Assays verwendet wurden, können alternative Lipidzusammensetzungen für verschiedene experimentelle Zwecke angepasst werden. POPC:DOPS Liposomen sind sehr stabil und schwerer zu verschmelzen, daher ist ein sehr strenges System für die Fusion.</li>
		<li>Fügen Sie den Lipidmischungen 1 Ci/ml L-Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin (Cholinmethyl-3H) hinzu, um die Lipidkonzentrationen in späteren Schritten durch Flüssigszintillationszählung zu bestimmen. Reservieren Sie mindestens 8 L dieses Bestands.</li>
		<li>Übertragen Sie die gewünschte Menge an Lipidmischungen auf Feuersteinglasröhren.</li>
		<li>Trocknen Sie die Lipidmischungen unter einem sanften Strom von N2-Gas für 10 min, bis keine Chloroform mehr sichtbar ist.</li>
		<li>Trocknen Sie den Lipidfilm weiter in einem Trockenbau, indem Sie 30 min saugen.</li>
		<li>Fügen Sie genügend wässriges A100 mit 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM EDTA in den Lipidfilm und bringen Sie die Konzentration wieder auf 10 mM. Den Lipidfilm durch leichtes Wirbeln 15 min bei Raumtemperatur wieder aufhängen. Ein Wirbel, der Feuersteinglasröhren aufnehmen kann, wird empfohlen.</li>
		<li>Zehnmal die hydratisierten Lipide in flüssigem Stickstoff einfrieren. Nach dem Einfrieren in flüssigem Stickstoff, tauen Sie die Liposomen, indem Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 30 s sitzen lassen, dann in Wasser für schnelleres Auftauen übertragen. Dieses Gefrier-Tau-Zyklus minimiert multilamellare Vesikel. ACHTUNG: Rohre können reißen, wenn sie Einbände größer als 0,5 ml enthalten und wenn sie direkt flüssigen Stickstoff ins Wasser übertragen werden.</li>
		<li>Übergeben Sie das Lipid durch Polycarbonat-Filter mit 100 nm Porengröße 19 Mal mit Mini-Extruder.</li>
		<li>Bestimmung der Gesamtfettkonzentration von Liposomen durch Szintillationszählung HINWEIS: Ein Teil des Lipids kann in Glasröhren und mini-Extruder zurückgelassen werden.<ol>
<li>Fügen Sie 4 l Lipidstock und Liposomen in 3 ml Szintillationscocktail hinzu.</li>
			<li>Messen Sie die durchschnittliche Anzahl pro Minute (CPMA) für Vorrat und Liposomen. Und berechnen Liposomen Konzentration mit der folgenden Formel:<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59867/59867equ01.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bewahren Sie die Liposomen bis zu einer Woche bei 4 °C auf. Längere Lagerung wird nicht empfohlen, da Liposomen mit der Zeit aggregieren können, was die Rekonstitutionseffizienz verringert.</li>
	</ol></li>
	<li>Rekonstitution durch waschmittelunterstützte Aufnahme in vorgeformte Liposomen
	<ol>
<li>Berechnen Sie die Menge an Puffer, Protein, Liposomen und zusätzlichem Reinigungsmittel, die miteinander vermischt werden sollen:<ol>
<li>Bestimmen Sie das gewünschte Gesamtvolumen. Dieses Volumen besteht aus Puffer A100 mit 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM EDTA. Volumen von weniger als 250 l mischen sich nicht gut in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhren.</li>
			<li>Berechnen Sie das Volumen der Liposomen, die benötigt werden, um eine endgültige Lipidkonzentration von etwa 1 mM zu ergeben. Subtrahieren Sie das Volume vom Puffervolume.</li>
			<li>Berechnen Sie das Proteinvolumen, das benötigt wird, um das gewünschte Protein zu Lipid-Molar-Verhältnis (in der Regel 1:400) zu geben. Verringern Sie das Puffervolumen entsprechend.</li>
			<li>Bestimmen Sie, wie viel zusätzliches Reinigungsmittel hinzugefügt werden muss, um dieLiposomen zu sättigen, die auf ein effektives Waschmittel-Lipid-Verhältnis (R eff) zwischen 0,64–0,8 abzielen. Denken Sie daran, das Waschmittel zu berücksichtigen, das mit dem Protein hinzugefügt wird. Die (Reff) wird <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59867/59867equ02.jpg"> durch die Gleichung Dgesamt bestimmt ist die Gesamtwaschmittelkonzentration und DWasser ist die monomere Waschmittelkonzentration (0,18 mM für TX-100 und Anapoe X-100 in Gegenwart von Waschmittel)4, 11.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mischen Sie die Lösungen in einem 0,5 ml-Rohr in der folgenden Reihenfolge: Puffer, Waschmittel, Protein und Liposomen. Fügen Sie die Liposomen schnell und Wirbel sofort für 5 s, um die Mischung zu homogenisieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Reaktion in einem Nutator für 1 h bei 4 °C.</li>
		<li>0,2 g/ml unpolares Polystyrol adsorbierende Perle "Schlämme" in Wasser. HINWEIS: Machen Sie die Polystyrol Adsorbent Perle "Schlämme" während der vorherigen 1 h Inkubation in Schritt 2.2.3.</li>
		<li>0,2 g Polystyroladsorbentperlen abwägen und in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen.</li>
		<li>Entgasen Sie die Perlen, indem Sie 1 ml Methanol in die Röhre geben und für 1 min mischen. Degassed Perlen werden sinken.</li>
		<li>Das Methanol ansaugen und den Perlen Wasser hinzufügen. Lassen Sie die Perlen mit Wasser für 5 min mischen, dann das Wasser aspirieren. Viermal wiederholen, dann die Polystyrol adsorbierende Perle "Schlämme" auf 1 ml Volumen mit Wasser und einer Endkonzentration von 0,2 g/ml bringen. HINWEIS: Perlen sollten sich immer noch an der Unterseite der Röhre absetzen. Wenn sie es nicht tun, entgasen Sie wieder. Verwenden Sie eine 21 G oder höhere Nadel, um Methanol und Wasser aus Perlen zu aspirieren.</li>
		<li>Berechnen Sie die Menge an Polystyrol adsorbent Perlen benötigt, um alle Reinigungsmittel in jeder Probe zu absorbieren. 1 g Polystyrol adsorbent Perlen absorbiert 70 mg TX-100. Um das Volumen der für jede Reaktion benötigten Polystyroladsorbent-Perle zu berechnen, dividieren Sie das gesamte Waschmittel in der Reaktion (Schritt 2.2.1.4) durch 70 mg und dann durch die Konzentration der Perlenschlämme (0,2 g/ml (Schritt 2.2.7).</li>
		<li>Berechnete Menge an Polystyrol adsorbierender Perle auf ein 0,5 ml Rohr übertragen und das Wasser ansaugen. HINWEIS: Schneiden Sie das Ende einer 20–200 L-Spitze, um die Perlen zu übertragen, Wirbel das Rohr kurz vor dem Pipettieren, um abgesetzte Perlen wieder zu suspendieren.</li>
		<li>Fügen Sie die Proben in das 0,5 ml-Rohr mit Polystyrol-Adsorbierperlen und inkubieren Sie die Probe für 1 h bei 4 °C.</li>
		<li>Wiederholen Sie zweimal alte Perlen zurück lassen und die Probe auf frische Perlen übertragen.</li>
		<li>Fügen Sie die Probe in eine vierte Röhre mit frischen Perlen und inkubieren über Nacht (15-18 h) bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Am Morgen die Probe von Polystyrol adsorbent Perlen und Pellet unlöslichen Proteinaggregaten durch Zentrifugieren für 10 min bei 16.000 x g bei 4 °C entfernen.</li>
	<li>Den Überstand wiederherstellen und die endgültige Lipidkonzentration durch Flüssigszintillationszählung bestimmen (siehe Schritt 2.1.9.2). Optional kann die Proteinkonzentration durch amido schwarzen Protein-Assay9bestimmt werden. HINWEIS: Bei Atlastin-Proteoliposomen sollten enzymatische Assays mit frischen Liposomen durchgeführt werden. Lange Lagerung bei 4 °C oder Einfrieren führt zu signifikanten Verlusten in der Atlastinaktivität.</li>
</ol>3. Lipid Mixing Assays
<ol><li>Bringen Sie die Spender- und Akzeptorproteoliposomen auf eine Konzentration von je 0,15 mM in A100 mit 10% Glycerin, 2 mM-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA und 5 mM MgCl2. Jede Reaktion (50 l) sollte einem Brunnen in einer flachen weißen 96-Well-Platte zugesetzt werden, die für Fluoreszenzmessungen geeignet ist. Bereiten Sie mindestens 4 Reaktionen vor, einschließlich einer Dreifach-Steuerung und einer negativen Kontrolle ohne GTP.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in einen vorgeheizten Plattenleser bei 37 °C. Messen Sie die NBD-Fluoreszenz (Erregung 460 nm und Emission 535 nm) für 5 min pro min.</li>
	<li>Induzieren Sie die Fusion durch Zugabe von 5 mM GTP (5 l von 50 mM GTP).</li>
	<li>Messen Sie die NBD-Fluoreszenz jede Minute für 1 h.</li>
	<li>Fügen Sie 5 l von 2,5% w/v n-Dodecyl-D-Maltosid hinzu, um die Proteoliposomen aufzulösen und die maximale NBD-Fluoreszenz zu messen. Lesen Sie NBD Fluoreszenz für 15 min pro min.</li>
</ol>4. Liposomen-Floatation auf Iohexol Discontinuous Gradient12
<ol><li>(optional) Analysieren Sie die Effizienz der Rekonstitution durch Floatationstests13.</li>
	<li>Bereiten Sie ein 80% und ein 30% w/v Iohexol in A100 mit 10% Glycerin, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM EDTA vor. Iohexol löst sich nicht leicht auf, daher muss dies einen Tag vorher durch Übernacht bei 4 °C zubereitet werden.</li>
	<li>Mischen Sie 150 L 80% Iohexol-Bestand mit 150 L Proteoliposomen Probe, um es zu einem 40% Iohexol zu bringen. Fügen Sie dies zu einem 5 x 41 mm2 Ultra-Clear-Rohr hinzu, das Blasen vermeidet.</li>
	<li>Schicht 250 l von 30% Iohexol Bestand langsam auf der Oberseite der Probe, um eine mittlere Schicht zu machen. Vermeiden Sie Blasen und stören Sie die untere Schicht. Auf der Oberseite der mittleren Schicht, langsam 50 l A100 mit 2 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM EDTA hinzufügen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den Gradienten in einem schwingenden Schaufelrotor bei 220.000 x g für 4 h bei 4 °C mit langsamer Beschleunigung und ohne Bruch.</li>
	<li>Ernten Sie die Schichten des Farbverlaufs und analysieren Sie durch SDS-PAGE und Coomassie Fleck, Quantifizierung kann durch Densitometrie durchgeführt werden. Rekonstituiertes Protein sollte in die obere Schicht schweben, während Protein- und Lipidaggregate am Boden oder in der mittleren Schicht sedimentieren.</li>
</ol>5. Analyse der Ausrichtung des rekonstituierten Proteins durch Thrombin-Proteolyse
HINWEIS: Das hier gemeldete Atlastin-Konstrukt hat eine Thrombin-Schnittstelle zwischen dem Ende des N-Terminal-GST-Tags und dem Beginn von Atlastin. Atlastin in der richtigen Ausrichtung wird diese Schnittstelle für die Protease zugänglich haben, während Protein in der falschen Ausrichtung durch die Lipid-Bilayer geschützt wird.
<ol><li>Um die atteoliposome-Orientierung zu assay atsay, reservieren Sie mindestens 8 l frisch rekonstituierte Proteoliposomen.</li>
	<li>Fügen Sie 8 L Proteoliposomen und 1 l von 1 U/L Thrombin hinzu. Bei 37 °C für 1 h inkubieren.</li>
	<li>Die Protease mit 1 l von 5 mg/ml EDTA-freiem Protease-Hemmer-Cocktail abwürgen und 30 min bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Analysieren Sie die Probe nach SDS-PAGE und Coomassie Fleck. Der Anteil des gehässierten und uncleaved Proteins kann durch Densitometrie bestimmt werden.</li>
</ol>

<ol><li>Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanics of membrane fusion.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).</li>
<li>Orso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+fusion+of+ER+membranes+requires+the+dynamin-like+GTPase+Atlastin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin.</a> Nature. 460, 978-983 (2009).</li>
<li>McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP-dependent+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">GTP-dependent membrane fusion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).</li>
<li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).</li>
<li>Düzgüneş, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Assays+for+Liposome+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Assays for Liposome Fusion.</a> Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).</li>
<li>Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+membrane+fusion%3A+kinetics+of+calcium+ion+induced+fusion+of+phosphatidylserine+vesicles+followed+by+a+new+assay+for+mixing+of+aqueous+vesicle+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents.</a> Biochemistry. 19, 6011-6021 (1980).</li>
<li>Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-+and+calcium-induced+fusion+and+destabilization+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes.</a> Biochemistry. 24, 3099-3106 (1985).</li>
<li>Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+inner+monolayer+fusion+assays+reveal+differential+monolayer+mixing+associated+with+cation-dependent+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).</li>
<li>Schaffner, W., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+sensitive%2C+and+specific+method+for+the+determination+of+protein+in+dilute+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution.</a> Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).</li>
<li>MacDonald, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-volume+extrusion+apparatus+for+preparation+of+large%2C+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).</li>
<li>Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+membrane+protein+insertion+into+liposomes+during+reconstitution+procedures+involving+the+use+of+detergents.+1.+Solubilization+of+large+unilamellar+liposomes+%28prepared+by+reverse-phase+evaporation%29+by+Triton+X-100%2C+octyl+glucoside%2C+and+sodium+cholate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate.</a> Biochemistry. 27, 2668-2677 (1988).</li>
<li>Scott, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+Fusion+Assay+to+Monitor+Intracellular+Membrane+Fusion+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines.</a> Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+orthomyxovirus+matrix+protein+reveals+mechanisms+for+self-polymerization+and+membrane+association%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association.</a> PNAS. 114, 8550-8555 (2017).</li>
<li>Parlati, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+fusion+of+phospholipid+vesicles+by+the+%CE%B1-helical+core+of+a+SNARE+complex+in+the+absence+of+an+N-terminal+regulatory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain.</a> PNAS. 96, 12565-12570 (1999).</li>
<li>Sugiura, S., Mima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+lipid+composition+is+vital+for+homotypic+ER+membrane+fusion+mediated+by+the+dynamin-related+GTPase+Sey1p%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p.</a> Scientific Reports. 6, 20407(2016).</li>
<li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543, 257-260 (2017).</li>
<li>Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atlastin+membrane+anchor+forms+an+intramembrane+hairpin+that+does+not+span+the+phospholipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer.</a> Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die hier beschriebenen Methoden eine effiziente Methode zur Reinigung, Rekonstituierung und Messung der Fusionsaktivität von rekombinantem Atlastin. Um eine hohe Ausbeute an funktionellem Atlastin zu gewährleisten, müssen einige kritische Schritte in Betracht gezogen werden. Die Expression von Atlastin muss bei niedrigen Temperaturen (16 °C) erfolgen, um eine Aggregation zu vermeiden, und man sollte eine Endkonzentration zwischen 0,4 und 1,5 mg/ml anstreben. Sehr verdünntes Protein wird nicht optimal mit einem Protein-Li...

Membranfusion ist ein kritischer Prozess in vielen biologischen Reaktionen. Unter biologischen Bedingungen ist die Membranfusion nicht spontan und erfordert spezielle Fusionsproteine, um solche Reaktionen zu katalysieren1. ER homotypische Membranfusion wird bei Tieren durch die Dynamin-ähnliche GTPase Atlastin2vermittelt. Atlastins Rolle bei der homotypischen Fusion ist von grundlegender Bedeutung für Drei-Wege-Kreuzungen im peripheren ER, das ein großes miteinander verbundenes Netz von Tubuli bildet, die sich über die gesamte Zelle erstrecken. Atlastine haben eine konservierte Domänenmorphologie, bestehend aus einer großen GTPase, einer drei Helix-Bundle-Mitteldomäne, einem hydrophoben Membrananker und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminalschwanz3. In-vitro-Studien mit rekombinantem Drosophila Atlastin haben gezeigt, dass es bei rekonstituiert er zu Liposomen seine fusogene Eigenschaften beibehält. Andere Atlastine, einschließlich menschlicher Homologe, konnten die Fusion in vitro nicht rekapitulieren. Wir beschreiben hier eine Methode zur Reinigung einer GST und Poly-Histidin getaggt rekombinanten Drosophila Atlastin, Rekonstituierung zu Liposomen, und Assaying Fusion.
Das Studium der Membranfusion in vitro stellt eine Herausforderung dar, da fusogene Proteine in der Regel einen Membrananker haben. Um sie zu studieren, ist es notwendig, sie in Modelllipid-Doppelschichten zu rekonstituieren. Große unilamellare Vesikel (LUV) sind ein nützliches Werkzeug, um Lipidprotein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Wir präsentieren hier ein System zur Herstellung von LUVs aus verschiedenen Lipidzusammensetzungen für Proteinrekonstitution und Fusionstests. Die Rekonstitution von integralen Proteinen in LUVs kann durch eine Vielzahl von Methoden erreicht werden, einschließlich organischer lösungsmittelvermittelter Rekonstitution, mechanischer Mechanismen oder waschmittelunterstützter Rekonstitution4. Wir präsentieren hier eine Methode zur Rekonstituierung von Drosophila-Atlastin in vorgeformte Liposomen durch Waschmittelentfernung. Zu den Vorteilen dieser Rekonstitutionsmethode gehören hohe Rekonstitutionsausbeuten und die richtige Ausrichtung von Atlastin in der Lipid-Bilayer. Darüber hinaus wird das Protein durch diese Methode nicht getrocknet oder organischen Lösungsmitteln ausgesetzt, wodurch Struktur und Funktion erhalten bleiben. Unter seinen Nachteilen ist das Vorhandensein von Detergenzien möglicherweise nicht ideal für alle Proteine und die endgültigen Proteoliposomen können ein eingebautes Reinigungsmittel in die Lipid-Bilayer haben. Weitere Dialyse kann verwendet werden, um mehr von dem Waschmittel zu beseitigen. Die Dialyse kann jedoch lange dauern und kann daher zum Verlust der Proteinaktivität führen.
Die Beurteilung der Fusionsaktivität von Atlastin kann durch Lipid-Mischtests wie zuvor beschrieben bestimmt werden2. Hier wird ein Verfahren zur Messung der atlastin vermittelten Fusion durch N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl(NBD)/Lissamine rhodamine-B Sulfonyl (Rhodamine) mit Lipiden beschrieben. Dieser Test erfordert die Fusion von Spenderproteoliposomen und Akzeptor-Proteoliposomen. Eine FRET-Freisetzung kann während der Reaktion als Verdünnung eines Spender-Akzeptor-Paares von "markierten" Liposomen zu "unbeschrifteten" Liposomen als Folge der Lipidmischung während der Membranfusion gemessen werden (Abbildung 1)5. Während dieser Assay als Proxy für die Membranfusion dient, ist er bei der Unterscheidung zwischen Membranfusion und Hemifusion begrenzt, einem Zustand, in dem sich nur die äußeren Blättchen vermischen. Um dieses Problem zu beheben, ist eine Alternative das Abschrecken von NBD durch Dithionit. Nach der gleichen Methode wie NBD/Rhodamine Lipid-Mischtests, nach dem Abschrecken der äußeren Packungsbeilage wird jede NBD FRET Freisetzung durch Fusion durch innere Packungsbeilage Mischen8.
Alternative Fusionsassays durch innerwässriges Mischen adressieren voll fusion nur5. Beispiele hierfür sind Terbium (Tb)/Dipicolinsäure (DPA) Assays und Aminonaphthalintrisulfonsäure (ANTS)/p-Xylol bis(pyridinium) bromid (DPX) Assays. In Tb/DPA-Assays wird ein Pool von Liposomen mit gekapseltem Tb gemischt und mit Liposomen mit gekapseltem DPA verschmolzen; bei fusion wird die Fluoreszenz durch interne Energieübertragung von DPA zu Tb innerhalb des [Tb(DPA)3]3- Chelationskomplexes6erhöht. Im Gegensatz dazu wird ants Fluoreszenz bei ANTS/DPX-Assays durch DPX7abgeschreckt. Während diese Systeme die Mischung des inneren Inhalts betreffen, ist eine eingehendere Herstellung von Liposomen erforderlich, um nicht verkapselte Reagenzien sowie unbeabsichtigte Wechselwirkungen der Fluorophore zu entfernen.

<table><tbody><tr><td>10 mL Poly-Prep Chromatographiesäulen</td><td>Biored</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>10 mm x 75 mm Flintglasröhrchen</td><td>VWR</td><td>608225-402</td><td></td></tr><tr><td>47 mm Durchmesser, 0,45 &mu; m pore whatman sterile membranfilter</td><td>whatman</td><td>7141 104</td><td></td></tr><tr><td>96 well white plate</td><td>NUNC</td><td>437796</td><td></td></tr><tr><td>Anapoe X-100</td><td>Anatrace</td><td>9002-931-1</td><td></td></tr><tr><td>Zelldisruptor</td><td></td><td>Avestin Avestin Emulsiflex C3</td><td></td></tr><tr><td>DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin (Natriumsalz))Avanti</td><td></td> <td>840035P-10mg</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Research organics inc.</td><td>6381-92-6</td><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td></tr><tr><td>EDTA-freier Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Vollständiger Proteasehemmer</td></tr><tr><td></td><td>Extruder Sigma Aldrich</td><td>Z373400&nbsp;</td><td>Liposofast Basic Extruder</td></tr><tr><td>GE Akta Prime Flüssigkeitschromatographie-System</td><td>GE Pharmacia</td><td>8149-30-0006</td><td></td></tr><tr><td>Glutathion-Agarose-Kügelchen</td><td>Sigma aldrich</td><td>G4510-50ml</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>EMD</td><td>GX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>36051-31-7</td><td>Guanosin 5' Triphosphat Natriumsalzhydrat</td></tr><tr><td>HEPES, säurefrei</td><td>Omnipur</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>fluka</td><td>5670</td><td></td></tr><tr><td>Immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC) Harzsäule</td><td>GE Healthcare</td><td>17040801</td><td>1 mL HiTrap Chelating HP immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie-Säulen</td></tr><tr><td>Iohexol</td><td>Genaues chemisches und wissenschaftliches Unternehmen</td><td>AN 7050 BLK</td><td>Accudenz/Nycodenz</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Research products international corp.</td><td>I56000-100.0</td><td>IPTG, dioxanfrei</td></tr><tr><td>L-Glutathion reduziert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251-5g</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Fisher</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Omnisolv</td><td>MX0488-1</td><td></td></tr><tr><td>NBD-DPPE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(7-Nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (Ammoniumsalz))</td><td>Avanti</td><td>236495</td><td>NBD-DPPE</td></tr><tr><td>n-Dodecyl &beta;-D-Maltosid</td><td>Chem-Impex International</td><td>21950</td><td></td></tr><tr><td>Adsorptionskügelchen aus unpolarem Polystyrol</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td>SM2 Biobeads</td></tr><tr><td>Nukleporen-Spurätzen Polycarbonat 19 mm 0,1 &mu; m Porenmembran</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>Optima LE80K Ultra Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylcholin, L-&alpha;-dipalmitoyl [cholin methyl-3H]</td><td>ARC</td><td>ART0284</td><td>Titriierte Lipide</td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>TECAN TECAN</td><td>unendlich M200 Plattenleser</td><td></td></tr><tr><td>POPC (1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin)</td><td>Avanti</td><td>850457C-25mg</td><td>POPC</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>MP</td><td>151944</td><td></td></tr><tr><td>Rh-DPPE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Lissamin, Rhodamin, B-Sulfonyl) (Ammoniumsalz))Avanti</td><td></td> <td>236495</td><td>Rh-DPPE</td></tr><tr><td>Szintillationscocktail</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-272</td><td>Ecoscint XR Szintillationslösung für wässrige oder nichtwässrige Proben</td></tr><tr><td>Szintillation Fläschchen</td><td>Beckman</td><td>592928</td><td>Schnelldrehkappe Mini Poly-Q Fläschchen</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T1063-1kU</td><td>Thrombin aus menschlichem Plasma</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Ultraklare Zentrifugenröhrchen 5 mm x 41 mm</td><td>Beckman</td><td>344090</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 9 bis 13 mm Röhrchenhalter</td><td>VWR</td><td>58816-138</td><td>Einsatz zum Vortexen von Flintglasröhrchen</td></tr><tr><td>Vortex Insert Retainer</td><td>VWR</td><td>58816-132</td><td>Retainer benötigt für Vortex Tube</td></tr><tr><td>Halter Vortexer</td><td>VWR</td><td>2.235074</td><td>Vortex Genie 2 Modell G560</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol molekularbiologische Qualität</td><td>Calbiochem</td><td>444203</td><td></td></tr></tbody></table>

waschmittelunterstützte rekonstitution von rekombinantem drosophila atlastin in liposomen für lipid-mischtests

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Die Membranfusion ist ein entscheidender Prozess in der eukaryotischen Zelle. Spezielle Proteine sind notwendig, um die Fusion zu katalysieren. Atlastine sind endoplasmatische Retikulum (ER) gebietsansässige Proteine, die an der homotypischen Fusion des ER beteiligt sind. Wir beschreiben hier eine Methode zur Reinigung einer Glutathion-S-Transferase (GST) und Polyhistidin mit dem Tag Drosophila atlastin durch zwei Runden Affinitätschromatographie. Die Untersuchung von Fusionsreaktionen in vitro erfordert das Einsetzen gereinigter Fusionsproteine in eine Lipid-Bilayerin. Liposomen sind ideale Modellmembranen, da Lipidzusammensetzung und -größe angepasst werden können. Zu diesem Zweck beschreiben wir ein Rekonstitutionsverfahren durch Waschmittelentfernung für Drosophila Atlastin in vorgeformte Liposomen. Während mehrere Rekonstitutionsmethoden zur Verfügung stehen, hat die Rekonstitution durch Waschmittelentfernung mehrere Vorteile, die es für Atlastine und andere ähnliche Proteine geeignet machen. Der Vorteil dieser Methode ist eine hohe Rekonstitutionsausbeute und die korrekte Ausrichtung des rekonstituierten Proteins. Diese Methode kann auf andere Membranproteine und für andere Anwendungen ausgedehnt werden, die Proteoliposomen erfordern. Zusätzlich beschreiben wir einen FRET-basierten Lipid-Mischtest von Proteoliposomen, die als Messung der Membranfusion verwendet werden.

Die Effizienz der Atlastin-Rekonstitution ist in Abbildung 2dargestellt. Rekonstituierte Proteoliposomen wurden in einem diskontinuierlichen Ozorgradienten von Iohexol geflogen. Das nicht inkorporierte Protein wurde in der unteren Schicht (B) oder in der mittleren Schicht (M) sedimentiert. Rekonstituiertes Protein würde in die oberste Schicht (T) schweben. Proben des Gradienten wurden geerntet und von SDS-PAGE und Coomassie Färbung analysiert. Die Quantifizierung des Gels durch Densitometrie...

Die biologische Membranfusion wird durch spezialisierte Fusionsproteine katalysiert. Die Messung der fusogenen Eigenschaften von Proteinen kann durch Lipid-Mischtests erreicht werden. Wir präsentieren eine Methode zur Reinigung des rekombinanten Drosophila Atlastin, ein Protein, das die homotypische Fusion des ER vermittelt, es zu vorgeformten Liposomen restituiert und auf Fusionskapazität getestet wird.

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Das hier beschriebene Rekonstitutions- und Fusionsprotokoll ist eine effiziente Möglichkeit, membrangebundene Proteine in einem Modell lipid-Bilayer- und Lipid-Mixing durch Fusionsproteine zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin, einem ER-Fusionsprotein, in vorgeformte Phosphatidylcholin-Liposomen. Die Fusion von Atlastin-Proteoliposomen wird dann mit einem FRET-basierten Lipid-Mischtest gemessen.Einer der Hauptvorteile der waschmittelunterstützten Rekonstitution ist, dass das Protein in Waschmittel nicht Trocken- oder Lösungsmitteln ausgesetzt ist. Wir zeigen hier auch, dass die Rekonstitutionsorientierung von Atlastin sehr effizient ist. Ein weiterer Vorteil des FRET-basierten Lipid-Mixing-Assays ist, dass die Liposomen nicht mit einem Farbstoff beladen werden müssen, und es gibt keine Notwendigkeit für zusätzliche Dialyse-Schritte.Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die Lipidmischungbestände in Chloroform vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie einen Mikrocurie pro Milliliter DPPC zu den Lipidmischungen hinzu, um sicherzustellen, dass mindestens acht Mikroliter dieses Bestands reserviert werden. Übertragen Sie die gewünschte Menge der Lipidmischungen in Feuersteinglasröhren.Dann trocknen Sie das Lipid unter einem sanften Strom von Stickstoffgas für ca. 10 Minuten, bis kein Chloroform mehr sichtbar ist. Trocknen Sie den resultierenden Lipidfilm weiter in einem Trockenbau, indem Sie 30 Minuten lang saugen. Danach fügen Sie genügend A100 mit 10% Glycerin, zweimillimolarem 2-Mercaptoethanol und ein Millimolar EDTA in den Lipidfilm, um die Konzentration wieder auf 10 Millimolar zu bringen.Den Lipidfilm wieder aufbrechen, indem Sie bei Raumtemperatur 15 Minuten leicht wirbeln. Die hydratisierten Lipide in flüssigem Stickstoff einfrieren. Um die Liposomen aufzutauen, lassen Sie die Lösung 30 Sekunden bei Raumtemperatur sitzen und übertragen Sie sie dann wieder ins Wasser, um schneller aufzutauen.Wiederholen Sie diesen Frost-Tau-Zyklus insgesamt 10 Mal. Danach verwenden Sie einen Mini-Extruder, um die Lipide durch Polycarbonat-Filter zu passieren, mit einer Porengröße von 100 Nanometern, 19 Mal. Um die Gesamtfettkonzentration der Liposomen zu bestimmen, fügen Sie vier Mikroliter Lipidbestand und Lysosomen zu drei Millilitern Szintillationscocktail hinzu.Messen Sie die durchschnittlichen Anzahlen pro Minute für Bestand und Liposomen und berechnen Sie die Liposomenkonzentration, wie im Textprotokoll beschrieben. Bewahren Sie die Liposomen bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius auf. Mischen Sie zunächst die entsprechende Menge an Puffer, zusätzlichem Reinigungsmittel und Protein in einer 0,5-Milliliter-Röhre, wie im Textprotokoll beschrieben.Fügen Sie die Liposomen schnell hinzu und wirbeln Sie sofort für fünf Sekunden, um die Mischung zu homogenisieren. Inkubieren Sie die Reaktion in einem Nutator bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Während dieser Inkubation 0,2 Gramm Polystyrol adsorbierende Perlen wiegen und in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen.Fügen Sie einen Milliliter Methanol in die Röhre, und mischen Sie für eine Minute, um die Perlen zu entgasen. Dann das Methanol mit einer 21-Spur oder höher Nadel ansaugen. Um mit dem Waschen der Perlen zu beginnen, fügen Sie Ihnen Wasser hinzu.Lassen Sie die Perlen mit dem Wasser für fünf Minuten mischen, dann das Wasser aspirieren. Wiederholen Sie diesen Wasserwaschvorgang viermal. Danach wasserauftragen, um die Polystyroladsorbent-Perle auf ein Volumen von einem Milliliter mit einer Endkonzentration von 0,2 Gramm pro Milliliter zu bringen.Berechnen Sie die Menge an Polystyrol adsorbent Perlen benötigt, um alle Reinigungsmittel in jeder Probe adsorbieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Schneiden Sie eine Pipettenspitze, um die Perlenschlämme zu sammeln. Übertragen Sie die berechnete Menge an Perlenschlämme auf ein 0,5-Milliliter-Rohr und saugen Sie das Wasser an.Fügen Sie die Proben in die Röhre mit den Perlen, und in einem Nutator bei vier Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Übertragen Sie die Proben in ein frisches Rohr mit neuen Perlen, um sicherzustellen, dass die alten Perlen zurückbleiben. Unter den gleichen Bedingungen erneut inkubieren.Wiederholen Sie diesen Vorgang des Übertragens und Inkubierens der Perlen zweimal. Danach die Probe in eine neue Röhre mit frischen Perlen geben und durch Übernacht bei vier Grad Celsius bebrüten. Am nächsten Tag die Probe bei 16 000 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten aus den Perlen und der Zentrifuge entfernen, um die unlöslichen Proteinaggregate zu pellet.Stellen Sie den Überstand wieder her und bestimmen Sie die endgültige Lipidkonzentration durch Flüssigszintillationszählung, wie im Textprotokoll beschrieben. Zunächst bringen Sie die Spender- und Akzeptorproteoliposomen auf eine Konzentration von je 0,15 Millimolar in A100, die Glycerin, Beta-Mercaptoethanol, EDTA und Magnesiumchlorid enthält. Übertragen Sie jede Reaktion auf einen Brunnen in einer flachen 96-Well-Platte, die für die Fluoreszenzmessung geeignet ist, und stellen Sie sicher, dass mindestens vier Reaktionen vorbereitet werden, einschließlich einer Dreifach- und einer No-GTP-Negativkontrolle.Legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einen vorgeheizten Plattenleser. Messen Sie die NBD-Fluoreszenz jede Minute für fünf Minuten. Fügen Sie dann fünf Millimolar GTP, um Fusion zu induzieren.Messen Sie die NBD-Fluoreszenz jede Minute für eine Stunde mit der gleichen Anregung und Emission wie zuvor. Danach fügen Sie fünf Mikroliter von 2,5%n-Dodecyl beta-D-Maltoside in die Brunnen, um die Proteoliposomen aufzulösen, und messen Sie die maximale NBD-Fluoreszenz jede Minute für 15 Minuten mit der gleichen Anregung und Emission. In dieser Studie wird rekombinantes Drosophila-Atlastin gereinigt und zu vorgeformten Liposomen rekonstituiert.Die Wirksamkeit der Atlastin-Rekonstitution wird durch schwimmende rekonstituierte Proteoliposomen in einem diskontinuierlichen Ozorgradienten bestimmt. Proben der oberen, mittleren und unteren Gradientenschichten werden von SDS-PAGE und Coomassie-Färbung geerntet und analysiert. Die Quantifizierung des Gels durch Densitometrie zeigt eine sehr hohe Effizienz der Rekonstitution mit vernachlässigbaren Verlusten, wobei 96% des gesamten Proteins als Proteoliposomen gefunden werden, die in die oberste Schicht schwammen.Weniger als 1% des Proteins ist nicht rekonstituiert und findet sich in der mittleren Schicht, und nur 3% ist unrekonstituiert oder aggregiert und in die untere Schicht sedimentiert. Die Ausrichtung von Atlastin nach Rekonstitution wird durch Thrombinspaltungstests quantifiziert. Die Proben werden mit SDS-PAGE- und Coomassie-Färbung analysiert und durch Densitometrie quantifiziert.Der größte Teil des rekonstituierten Proteins ist zerklebend, wobei nur 7% vor der Protease geschützt sind. Die Kinetik und das Ausmaß der atlastinvermittelten proteoliposomen Fusion werden durch Lipid-Mixing-Assays analysiert. Eine Inkubation von fünf Minuten wird durchgeführt, bevor die Fusion mit GTP zum Nullzeitpunkt induziert wird.Nach einer Stunde wurde n-Dodecyl beta-D-Maltoside hinzugefügt, um die Proteoliposomen zu slubilisieren und die maximale fluoreszierende Resonanztransferfreisetzung zu erhalten. Das Fusionsmaximum im Lauf wird auf 11% der maximalen Fluoreszenz gesehen. Lipide werden in Chloroform gelöst.Bei der Vorbereitung der Lipidmischungen, stellen Sie sicher, dass dies schnell zu tun, auf einer chemischen Haube, und auf Eis, um jede Verdunstung zu vermeiden. Es ist möglich, Atlastin-Proteoliposomen mittels Mikroskopie zu analysieren, um die Auswirkungen eines Membranankers auf Liposomenform und -größe zu visualisieren. Diese Methode wurde erweitert, um andere membranverankerte Proteine zu untersuchen und zu untersuchen, wie sich das Verhalten in einem Modelllipid-Doppelschicht verhalten.Dieses Protokoll verwendet titrierte Lipide, um Lipidmischungen zu quantifizieren. Achten Sie bei der Arbeit mit radioaktiven Stoffen auf die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen.

detergent-assisted-reconstitution-recombinant-drosophila-atlastin

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Verfahren zur vollständigen Auflösung des Prototyps spannungsabhängigen Kaliumkanal in Lipid-Membranen beschrieben. Die rekonstituierten Kanäle sind für biochemische Assays, elektrische Aufnahmen, Liganden-Screening und Elektronen kristallographische Untersuchungen geeignet. Diese Methoden können allgemeine Anwendungen auf die strukturelle und funktionelle Studien anderer Membranproteine.

Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien

Wir beschreiben einen fluoreszenzbasierten Assay zur Messung von Phospholipid-Scrambling in großen unilamellären Liposomen, die mit Opsin rekonstituiert wurden.

Ein Fluoreszenz-basierte Assay von Phospholipid Scramblase Activity

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Bewertung der Wechselwirkungen und Assemblierungen von integralen Membranproteinen in vitro mit verschiedenen Partnerfaktoren in einer lipidproximalen Umgebung.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen In Vitro

Hier präsentieren wir zwei ultraschnelle Protokolle zur Rekonstitution von Membranproteinen in Fusogenic Proteoliposomes und Verschmelzung von solchen Proteoliposomes mit Ziel Lipid Bilayer für Waschmittel-freie Lieferung dieser Membran Proteine in der postfusion Bilayer. Die Kombination dieser Ansätze ermöglicht schnelle und leichtführig Montage von komplexen Mehrkomponenten Membransystemen.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Wir bieten ein Protokoll für in-vitro- Assays der Selbstorganisation von Verstand und mir auf einem unterstützten Lipid Bilayer in eine offene Kammer. Darüber hinaus beschreiben wir, wie der Assay in Lipid-plattiert PDMS Microcompartments in Vivo -Bedingungen durch Reaktion Entbindung imitieren einzuschließen.

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten in definierten Proteoliposomen vor.

Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten

Dieser Artikel stellt eine einfache Methode zur schnellen Herstellung von riesigen unilamellären Vesikeln mit verkapselten zytoskelettalen Proteinen vor. Die Methode erweist sich als nützlich für die Bottom-up-Rekonstitution von Zytoskelettstrukturen in Enstrikt- und Zytoskelett-Membran-Interaktionen.

Schnelle Verkapselung des rekonstituierten Zytoskeletts in riesigen unilamellären Vesikeln

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten und die Zugabe von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen, um die Dynamik rekonstituierter, membrangebundener Zytoskelettnetzwerke mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

In diesem Manuskript demonstrieren wir die experimentellen Techniken zur Verkapselung des F-Aktin-Zytoskeletts in riesige unilamellare Lipidvesikel (auch Liposomen genannt) und die Methode zur Bildung einer Kortex-bioimitierenden F-Aktin-Schicht am inneren Blättchen der Liposomenmembran.

In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

Wir stellen ein Protokoll zur Rekonstitution von Membranproteinen und zur Verkapselung von Enzymen und anderen wasserlöslichen Komponenten in Lipidvesikeln von Submikrometer- und Mikrometergröße vor.

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

Lernen Sie die waschmittelunterstützte Rekonstitution von Drosophila Atlastin in Liposomen für FRET-basierte Lipid-Mischtests. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen von Membranfusionsproteinen.

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Weitere Videos entdecken