Name: 长距离反向PCR对热线1的逆变活性的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: 了解长距离反向PCR检测LINE-1逆转录转座子活性的方法。该技术利用MCF7细胞系检测TTC28基因位点的de novo插入，为癌症基因组不稳定性研究提供简便经济的分子工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢在首次描述本方法的文章中的所有合著者14，特别是Tatiana Cajuso、Kimmo Palin、Outi Kilpivaara和Esa Pitkänen，在方法开发过程中给予的宝贵讨论。L.K.的研究由芬兰科学院（资助号：25996、292789、306026和314394）、西格丽德·尤塞柳斯基金会以及芬兰癌症协会资助。B.P.获得了赫尔辛基大学研究基金会博士生奖学金、芬兰癌症协会论文资助以及Ida Montinin Säätiö的博士研究资助。我们还感谢赫尔辛基大学的Teemu Masalin以及L.K.研究团队的Kul Shrestha在视频制作过程中给予的协助。

本研究已获得赫尔辛基大学医院机构审查委员会和伦理委员会的批准。已从提供血样以演示本方案的受试者处获得签署的知情同意书。
1. 设计反向引物并选择限制性内切酶（生物信息学）
<ol>
	<li>确定与 LINE-1 相关的唯一标签
	<ol>
		<li>从 L1Base 等 LINE-1 数据库中以 FASTA 格式下载 TTC28-LINE-1 序列17。TTC28-LINE-1 的 L1base 编号为 135。</li>
		<li>包含 LINE-1 序列两侧各 5 kb 的侧翼序列，并在文字处理软件中对其进行注释。 
		注：此处 LINE-1 侧翼序列以棕色字体标注，LINE-1 序列以灰色字体标注（补充文件）。</li>
		<li>将选定 LINE-1 对应的 PAS 下游 1 kb 序列输入至 PAS 预测工具（如 polyadq18 或 Dragon PolyA spotter19），并标注该 1 kb 窗口内的所有多聚腺苷酸化信号。 
		注：若在 1 kb 窗口内无 PAS，则继续在下游下一个 1 kb 窗口内搜索 PAS。TTC28-LINE-1 自身的弱 PAS 以粉红色高亮显示，下游 1 kb 窗口内的其他所有 PAS 以红色高亮显示（补充文件）。</li>
		<li>将 LINE-1 对应 PAS 末端至下游最强 PAS 之间的序列标注为 &#34;唯一标签&#34;。 
		注：TTC28-LINE-1 的 &#34;唯一标签&#34;以黄色高亮显示（补充文件）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计反向引物
	<ol>
		<li>将 &#34;唯一标签&#34;序列输入基于网页的引物设计工具（如 Primer 3（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/）或 NCBI 的 primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）），设计反向 PCR 引物。由于这些工具设计的引物对方向相对，适用于常规 PCR，因此需对引物对使用反向互补功能以实现反向 PCR。 
		注：由于 LINE-1 转导在其 5´ 端被严重截短，且转导区域的大小高度可变，因此应尽量缩短两个反向引物之间的距离，可通过将 NCBI primer-BLAST 中的 &#34;PCR 产物长度&#34;参数设为最小值来实现。若唯一标签内存在多个 PAS，应设计对应不同 PAS 的多对引物。引物应设计在靠近 PAS 的位置，因为 LINE-1 插入起始于 RNA 中间体的 3´ 端，而 5´ 端则存在可变程度的截短。本例中设计了三对引物，分别以蓝绿色和绿色高亮显示，对应于 TTC28 LINE-1 唯一标签中的三个强多聚腺苷酸化信号（补充文件）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择限制性内切酶
	<ol>
		<li>使用 RestrictionMapper 等基于网页的工具对 LINE-1 序列及其上下游各 5 kb 的侧翼序列进行 in silico 消化。这将提供一份可切割该区域并产生不同限制性片段的限制性内切酶的完整列表。</li>
		<li>选择在 LINE-1 原位点进行切割的限制性内切酶，具体要求如下：在 5´ 端，切割位点位于 LINE-1 5´ 端上游或 LINE-1 自身远端 5´ 端；在 3´ 端，切割位点位于 LINE-1 唯一标签的下游。 
		注：所选限制性内切酶应不受 DNA 甲基化影响，可耐热失活，并产生彼此互补的交错 &#34;黏性&#34;末端。为演示 LDI-PCR，本研究使用了在 GAGCTC 位点切割 DNA 的 SacI 限制性内切酶，此处以浅绿色高亮显示（补充文件）。</li>
		<li>记录所选限制性内切酶产生的限制性片段大小。该片段不应超过 12 kb，否则可能无法通过 PCR 有效扩增。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 为长距离反向PCR制备环状DNA模板
<ol>
	<li>DNA 提取与质量评估
	<ol>
		<li>使用市售的 DNA 提取试剂盒，按照制造商说明书从样本（肿瘤或血液）中提取基因组 DNA，确保获得适合 LDI-PCR 所需的高质量、高分子量 DNA。或者，也可采用苯酚:氯仿法提取高分子量 DNA20。</li>
		<li>按照制造商说明书使用荧光计测定 DNA 浓度，并取 100 ng DNA 与 λ-HindIII DNA 分子量标记物一同在含溴化乙锭（0.5 µg/mL）的 1%（w/v）琼脂糖凝胶中，以 1× Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液在 4.5 V/cm 条件下电泳，以检测 DNA 的质量与数量21。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基因组 DNA 的消化
	<ol>
		<li>在冰上向 0.2 mL PCR 管中加入 20 单位 SacI 限制性内切酶、5 µL 10× 反应缓冲液（材料表）、最多 44 µL 含 100 ng DNA 的溶液，配制成终体积为 50 µL 的消化反应体系（大多数厂商提供的 1 µL 限制性内切酶足以完全消化 100 ng 基因组 DNA）。轻弹管壁混匀溶液，短暂离心。</li>
		<li>使用热循环仪在 37 °C 孵育反应体系 1 小时，随后在 65 °C 加热失活 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化后基因组 DNA 的自连
	<ol>
		<li>向 50 µL 消化产物（步骤 2.2.2 完成后）中加入 8 µL 10× T4 DNA 连接酶缓冲液、1 µL（5 单位）T4 DNA 连接酶和 21 µL 超纯水，使终反应体积为 80 µL。轻弹管壁混匀溶液，短暂离心。</li>
		<li>在热循环仪中于 22 °C 孵育 10 分钟，随后在 65 °C 加热失活 10 分钟以终止反应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 长距离反向PCR
<ol>
	<li>通过梯度PCR确定引物退火温度
	<ol>
		<li>设置退火温度梯度为 (A-4) °C、(A-2) °C、A、(A+2) °C、(A+4) °C，其中 A 为理论退火温度&#160;使用商业供应商提供的基于网络的工具计算的引物对退火温度。 
		注意：部分制造商的热循环仪可能不支持手动设置温度梯度。在此情况下，可使用自动梯度设置，温度范围为（A-4）°C 至（A+4）°C。</li>
		<li>在1.5 mL微量离心管中配制PCR主混合液，依次加入并混匀以下组分：4 µL 5x反应缓冲液、0.4 µL 10 mM dNTP、5 µL 2 µM PCR引物（正向与反向引物，于步骤1.3.1中设计）、每反应0.2 µL（0.1 U）DNA聚合酶。针对梯度中的每个退火温度，分别设置一个反应。</li>
		<li>每个反应中，将19 µL主混合液分装至0.2 mL PCR管中，并加入1 µL（1.25 ng）在第2部分中制备的环状DNA模板。 
		注意：使用由正常血液DNA环化自连生成的DNA作为模板，以避免在此优化步骤中消耗可能珍贵的肿瘤DNA。</li>
		<li>在PCR仪上运行梯度PCR程序，具体如下：(i) 3分钟的单个循环&#160;在98 °C（变性）；（ii）35个循环（98 °C下10 s [变性]，[A-4]至[A+4] °C温度梯度下20 s [退火]，72 °C下1−6 min [按预期PCR产物每千碱基30 s计算] [延伸]）；（iii）72 °C下10 min一个循环（最终延伸）。</li>
		<li>在1%琼脂糖凝胶中电泳6 µL PCR产物21 在1x TAE缓冲液中以4.5 V/cm的电压进行电泳，分析在不同退火温度下获得的PCR产物。</li>
		<li>选择能够产生与预期大小相符的PCR产物的退火温度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测 从头合成 肿瘤基因组中的LINE-1逆转座活性
	<ol>
		<li>使用反向PCR引物对对来自肿瘤样本的环状DNA模板（第2节）进行LDI-PCR。操作步骤与梯度PCR相同（第3.1节），但将温度梯度替换为最佳退火温度。</li>
		<li>使用已知大小的PCR产物或按照步骤3.1.5的方法，通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。 &#34;天然的&#34; 应在每个反应中观察到对应于LINE-1在其天然位点的PCR产物。 从头合成 在所检测的肿瘤样本中，LINE-1 3´ 转导可表现为琼脂糖凝胶上大小不同的PCR产物，同时伴有天然的PCR产物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 对 LDI-PCR 产物进行测序以确定 LINE-1 3´ 转导靶位点的身份
<ol>
	<li>对每个LDI-PCR反应中产生的所有PCR扩增子进行单分子长读长测序，以鉴定这些LINE-1 3´转导事件的目标整合位点。 
	注意：对 LDI-PCR 产物进行克隆和 Sanger 测序也是一种可行但较为繁琐的方法。</li>
	<li>使用标准序列比对流程将单分子长读长测序平台产生的测序读段比对至参考基因组，然后利用 LDI-PCR 软件分析比对后的读段14 用于识别 从头合成 LINE-1 插入及其靶位点</li>
</ol>

<ol><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li>
<li>Brouha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+LINE-1s+account+for+the+bulk+of+retrotransposition+in+the+human+population%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hot LINE-1s account for the bulk of retrotransposition in the human population.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (9), 5280-5285 (2003).</li>
<li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricting+retrotransposons%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Restricting retrotransposons: a review.</a> Mobile DNA. 7, 16(2016).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+somatic+retrotransposition+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Landscape of somatic retrotransposition in human cancers.</a> Science. 337 (6097), 967-971 (2012).</li>
<li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+APC+gene+by+a+retrotransposal+insertion+of+L1+sequence+in+a+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Disruption of the APC gene by a retrotransposal insertion of L1 sequence in a colon cancer.</a> Cancer Research. 52 (3), 643-645 (1992).</li>
<li>Scott, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hot+L1+retrotransposon+evades+somatic+repression+and+initiates+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A hot L1 retrotransposon evades somatic repression and initiates human colorectal cancer.</a> Genome Research. 26 (6), 745-755 (2016).</li>
<li>Pitkanen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+L1+retrotranspositions+originating+from+TTC28+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Frequent L1 retrotranspositions originating from TTC28 in colorectal cancer.</a> Oncotarget. 5 (3), 853-859 (2014).</li>
<li>Tubio, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+DNA+in+cancer.+Extensive+transduction+of+nonrepetitive+DNA+mediated+by+L1+retrotransposition+in+cancer+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mobile DNA in cancer. Extensive transduction of nonrepetitive DNA mediated by L1 retrotransposition in cancer genomes.</a> Science. 345 (6196), 1251343(2014).</li>
<li>Badge, R. M., Alisch, R. S., Moran, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATLAS%3A+a+system+to+selectively+identify+human-specific+L1+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">ATLAS: a system to selectively identify human-specific L1 insertions.</a> American Journal of Human Genetics. 72 (4), 823-838 (2003).</li>
<li>Rodic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposon+insertions+in+the+clonal+evolution+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Nature Medicine. 21 (9), 1060-1064 (2015).</li>
<li>Ewing, A. D., Kazazian, H. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+reveals+extensive+variation+in+human-specific+L1+content+in+individual+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing reveals extensive variation in human-specific L1 content in individual human genomes.</a> Genome Research. 20 (9), 1262-1270 (2010).</li>
<li>Sanchez-Luque, F. J., Richardson, S. R., Faulkner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposon+Capture+Sequencing+%28RC-Seq%29%3A+A+Targeted%2C+High-Throughput+Approach+to+Resolve+Somatic+L1+Retrotransposition+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Retrotransposon Capture Sequencing (RC-Seq): A Targeted, High-Throughput Approach to Resolve Somatic L1 Retrotransposition in Humans.</a> Methods in Molecular Biology. 1400, 47-77 (2016).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+LINE-1+retrotransposition+in+cortical+neurons+and+non-brain+tissues+of+Rett+patients+and+healthy+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic LINE-1 retrotransposition in cortical neurons and non-brain tissues of Rett patients and healthy individuals.</a> PLOS Genetics. 15 (4), e1008043(2019).</li>
<li>Pradhan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+subclonal+L1+transductions+in+colorectal+cancer+by+long-distance+inverse-PCR+and+Nanopore+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Detection of subclonal L1 transductions in colorectal cancer by long-distance inverse-PCR and Nanopore sequencing.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14521(2017).</li>
<li>Moran, J. V., DeBerardinis, R. J., Kazazian, H. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+shuffling+by+L1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Exon shuffling by L1 retrotransposition.</a> Science. 283 (5407), 1530-1534 (1999).</li>
<li>Philippe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+individual+L1+retrotransposon+instances+is+restricted+to+cell-type+dependent+permissive+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Activation of individual L1 retrotransposon instances is restricted to cell-type dependent permissive loci.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Penzkofer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1Base+2%3A+more+retrotransposition-active+LINE-1s%2C+more+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">L1Base 2: more retrotransposition-active LINE-1s, more mammalian genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (D1), D68-D73 (2017).</li>
<li>Tabaska, J. E., Zhang, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+polyadenylation+signals+in+human+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Detection of polyadenylation signals in human DNA sequences.</a> Gene. 231 (1-2), 77-86 (1999).</li>
<li>Kalkatawi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dragon+PolyA+Spotter%3A+predictor+of+poly%28A%29+motifs+within+human+genomic+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Dragon PolyA Spotter: predictor of poly(A) motifs within human genomic DNA sequences.</a> Bioinformatics. 29 (11), 1484(2013).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nucleic+acids+by+extraction+with+phenol%3Achloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).</li>
<li>Macfarlane, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction-specific+ATLAS+reveals+a+cohort+of+highly+active+L1+retrotransposons+in+human+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Transduction-specific ATLAS reveals a cohort of highly active L1 retrotransposons in human populations.</a> Human Mutation. 34 (7), 974-985 (2013).</li>
<li>Beck, C. R., Garcia-Perez, J. L., Badge, R. M., Moran, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE-1+elements+in+structural+variation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">LINE-1 elements in structural variation and disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 187-215 (2011).</li>
<li>Morrish, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+mediated+by+endonuclease-independent+LINE-1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA repair mediated by endonuclease-independent LINE-1 retrotransposition.</a> Nature Genetics. 31 (2), 159-165 (2002).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemia+disease+genes%3A+large-scale+cloning+and+pathway+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Leukaemia disease genes: large-scale cloning and pathway predictions.</a> Nature Genetics. 23 (3), 348-353 (1999).</li>
<li>Pradhan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+screening+of+chromosomal+rearrangements+in+uterine+leiomyomas+by+long-distance+inverse+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosomes+and+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection and screening of chromosomal rearrangements in uterine leiomyomas by long-distance inverse PCR.</a> Genes, Chromosomes and Cancer. 55 (3), 215-226 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种可用于鉴定源自任意感兴趣活性LINE-1的de novo LINE-1插入事件的方法。我们已针对位于22q12.1的一个高活性LINE-1对该方法进行了优化，并先前证明其在检测结直肠癌中亚克隆插入事件时具有高度敏感性14。
LDI-PCR 的成功依赖于基因组 DNA 的质量。因此，我们增加了一个额外的质量控制步骤，以确保在实验开始时存在高分子量的 DNA（步骤 2.1.2）。我们建议将基因组 DNA 长期保存于 -20 °C，并分装成若干 aliquot，以避免反复冻融。强烈建议使用来自血液或患者匹配的正常组织的基因组 DNA，以区分所检测到的 LINE-1 逆转座事件是种系事件还是体细胞事件。由于限制性内切酶在基因组中的切割位点具有随机性，有可能某一特定 从头合成 LINE-1插入位点附近可能不含有所用限制性内切酶的任何切割位点。因此，为了提高检测到大多数LINE-1插入事件的可能性 从头合成 在肿瘤DNA中检测LINE-1插入时，应使用多种限制性内切酶分别进行反应，以生成不同的环状DNA模板文库。此外，若目标LINE-1的唯一标签含有多个PAS位点，则使用位于各PAS位点附近的引物对可提高检测严重截短型转导事件的几率。
尽管已有精巧的方法可用于全基因组范围的检测 从头合成 如果存在大量LINE-1插入，当研究目标是探究特定细胞环境中某一特定LINE-1的逆转座能力时，这些插入可能会造成干扰。针对这一目的，LDI-PCR是一种经济、简便且可靠的可视化LINE-1逆转座事件的方法。该方法所采用的靶向策略与TS-ATLAS相似。22；然而，LDI-PCR 避免了使用接头寡核苷酸，且能够扩增 5´ 和 3´ 两端的连接区域 从头合成 LINE-1插入事件的同时，通过将LDI-PCR与单分子长读长测序技术相结合，可获取LINE-1插入的5´和3´连接处信息、整合靶位点、polyA尾以及靶位点修饰等所有这些LINE-1逆转座的典型特征。由此产生的长读长序列在单个读段中包含了插入的LINE-1序列、其独特标签及靶序列，从而避免了短读长在重复区域比对时所面临的困难。
使用LDI-PCR检测LINE-1活性存在两个主要局限性。第一，该局限性源于PCR技术本身：PCR只能可靠地扩增长度不超过10 kb的片段。因此在选择限制性内切酶时需加以考虑，确保原始片段长度不超过此上限。第二，该方法仅能检测通过3′转导机制带动LINE-1 3′侧翼区移动的逆转座事件。因此，不具备3′转导活性的LINE-1将无法通过此方法被检测到。此外，尽管某些LINE-1逆转座事件可被LDI-PCR扩增，但以下两类情况仍可能无法通过琼脂糖凝胶电泳检测：(a) 产生的PCR扩增片段大小与&#34;原始&#34;位置或其他逆转座事件的产物相近；(b) 发生频率极低或为亚克隆事件。此类LINE-1逆转座事件可通过单分子长读长测序技术对LDI-PCR产物进行测序而得以捕获14。
通过选用合适的限制性内切酶，并设计靶向这些“热点”LINE-1的反向引物，本文所述的工作流程可轻松改造用于检测其他&#34;hot&#34; LINE-1的活性。除了检测LINE-1介导的3´端转导外，该方法还可调整用于检测发生频率较低的LINE-1介导的5´端转导23。类似的方法已被用于鉴定基于细胞实验中LINE-1报告基因的整合位点24，以及癌症中的前病毒整合位点25。除LINE-1插入事件外，该方法还可用于检测其他基因组异常，例如DNA重排，前提是已知存在易发生重排的基因组区域信息26。

长散布核元件（LINE-1s）是一类称为逆转座子的可移动遗传元件，能够通过一种名为逆转座的“复制-粘贴”机制在基因组中独立地从一个位置转移到另一个位置。在进化过程中，人类基因组已积累了超过50万个LINE-1重复序列拷贝1然而，基因组中大多数的LINE-1拷贝均存在突变，因此无法通过逆转座方式进行移动；仅有约150个拷贝保留了完整且必要的DNA序列，使其具备移动能力2在正常的体细胞中，这些LINE-1的移动受到多种宿主因子的限制3这些限制在不同的上皮性肿瘤中得以解除，导致LINE-1去抑制，从而产生大量 从头合成 肿瘤基因组中的插入突变4. 一些与肿瘤相关的 从头合成 插入突变已被证实可导致基因发生插入性突变，从而驱动肿瘤进展5,6因此，能够绘制出肿瘤基因组中新的插入序列显得尤为重要。
目前检测de novo LINE-1插入的方法包括：(1) 全基因组测序方法4,7,8，该方法利用不同的计算算法从全基因组测序（WGS）数据中识别de novo LINE-1插入；或 (2) 靶向年轻且可能具有活性的LINE-1 3´端的高通量测序技术9,10,11,12,13。然而，利用这些方法在数千个高度相似的拷贝中识别新的插入事件远非易事，且由于肿瘤异质性以及与LINE-1插入相关的基因组改变，这一挑战进一步加剧4。
研究表明，仅有少数LINE-1元件负责&#160;大部分 从头合成 肿瘤中观察到的LINE-1插入事件7,8因此，要判断特定肿瘤样本是否具有LINE-1活性，只需检测由少数高活性LINE-1位点引起的逆转座事件即可。本文介绍了一种基于聚合酶链式反应（PCR）的简便方法14 可用于监测位于某特定基因第一内含子中LINE-1位点活性的方法 TTC28 位于22q12.1的基因在结直肠癌中高度活跃7,8该LINE-1位点将被称为 TTC28-LINE-1 在整篇文章中。该检测方法特异性识别 从头合成 通过一种称为3´端转导的机制，将来源LINE-1的3´端侧翼区非重复序列 mobilize 的LINE-1逆转座事件153´端转导的发生是由于LINE-1的多聚腺苷酸化信号（PAS）较弱，导致转录机器跳过该信号，转而于下游更强的PAS处终止转录，从而捕获了侧翼的非重复序列（下文简称 &#34;独特标签&#34;）随后与LINE-1序列一同插入目标位置。Philippe等16 最近研究表明，不同细胞类型可表达不同的LINE-1位点。鉴于这一发现，该方法可用于监测表达水平最高的LINE-1的转座活性&#160;他们的&#160;目标癌症类型中的独特标签。
LDI-PCR 的第一步是使用一种限制性内切酶消化基因组 DNA，该酶可产生包含待检测 LINE-1（此处为 TTC28-LINE-1）及其独特标签的限制性片段（图 1）。随后，通过自连接将消化后的 DNA 环化，并利用位于独特标签内部的反向引物进行 PCR 扩增。通过该方法，始终会扩增出位于其&#34;天然&#34;位置的全长源 LINE-1，同时也会扩增出携带该独特标签、插入于不同靶位点的子代 LINE-1 插入事件（图 1），从而报告目标 LINE-1 的逆转座活性。

<table><tbody><tr><td>1 Kb DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232L</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>64-19-7</td><td>用于配制TAE缓冲液</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>BioNordika</td><td>BN-50004</td><td></td></tr><tr><td>血液样本（冷冻）</td><td></td><td></td><td>用于对照 PCR 的健康个体血样</td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ 系统</td><td>Bio-rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>DNA上样缓冲液（6X）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>伯乐（Bio-rad）</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25102-12-9</td><td>用于配制TAE缓冲液</td></tr><tr><td>FastDigest缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>B64</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest SacI</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FD1133</td><td></td></tr><tr><td>Generuler 1 Kb plus DNA Ladder</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SM0103</td><td></td></tr><tr><td>微型亚基&amp;nbsp;细胞GT细胞</td><td>Bio-rad</td><td>1704406</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Green Hot Start II 高保真 DNA 聚合酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>F537L</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic 电源供应器</td><td>伯乐（Bio-rad）</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Quantus 荧光仪</td><td>Promega</td><td>E6150</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tear-A-Way 96/8，96孔PCR板</td><td>4titude</td><td>4ti-0750/TA</td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>77-86-1</td><td>用于配制TAE缓冲液</td></tr><tr><td>Veriti 热循环仪</td><td>应用生物科学</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

通过长距离反向pcr检测活跃的嗜热line-1逆转座子活性

Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR

长散布核元件1（LINE-1）是人类基因组中唯一能够自主移动的可移动遗传元件家族。它们通过一种称为逆转座的过程实现移动，即首先转录生成mRNA中间体，再通过逆转录将该中间体插入基因组中。尽管LINE-1在正常细胞中处于沉默状态，但在多种上皮性肿瘤中却高度活跃。从头LINE-1插入事件可能驱动肿瘤发生，因此系统研究癌症中LINE-1的逆转座活动具有重要意义。在人类基因组中存在的约150个具备逆转座能力的LINE-1中，仅有少数几个位点（也被称为&#34;活跃&#34; LINE-1）负责在不同类型癌症中产生大多数从头LINE-1插入事件。我们开发了一种基于聚合酶链式反应（PCR）的简便方法，用于监测这些活跃LINE-1的逆转座活性。该方法基于长距离反向（LDI）-PCR，利用了3´端转导机制——即LINE-1可带动其侧翼非重复区域一同移动，随后可利用此特征识别源自特定活跃LINE-1的从头LINE-1 3´端转导事件。

对于 TTC28-LINE-1，其同源多聚腺苷酸化位点（PAS）下游 1 kb 窗口内存在多个 PAS，因此将 TTC28-LINE-1 PAS 与其下游 811 bp 处最强 PAS 之间的区域视为 TTC28-LINE-1 的唯一标签。在此唯一标签区域设计了三对反向 PCR 引物，分别对应于存在的不同 PAS14。我们选择了三种限制性内切酶：(i) NsiI，在 TTC28-LINE-1 的 5´ 端上游切割，且在唯一标签的 3´ 端外侧切割；(ii) SacI 和 (iii) PstI，二者均在 LINE-1 最远 5´ 端内部的 5´ 侧切割，并在唯一标签的 3´ 外侧切割。这三种酶分别产生长度为 10,288 bp、5,699 bp 和 6,305 bp 的限制性片段。
为演示该方法，我们对从 MCF7 细胞系中提取的 DNA 进行了 LDI-PCR。这种乳腺癌细胞系此前已有报道显示 TTC28- LINE-1 活性16为简便起见，我们使用一种限制性内切酶构建了环状DNA模板， Sac我从三对引物中选取一对进行了LDI-PCR表1以检测 从头合成 源自 LINE-1 插入 TTC28-行-1.
通过琼脂糖凝胶电泳（图2）确保了从MCF7细胞系中提取的DNA具有良好的质量。完整且高分子量的DNA条带表明基因组DNA的质量适合本实验。若观察到弥散的拖尾条带，则表明提取的DNA质量较差，这将影响后续实验操作。
图3 显示了一次梯度PCR实验的代表性结果，旨在确定 TTC28-LINE-1 反向引物对的最佳退火温度。该反应使用经 SacI 消化后自连接形成环状DNA模板的血液基因组DNA。在62、64和66 °C下均出现预期大小（5,649 bp）的高特异性PCR产物，表明该引物对的最佳退火温度范围为62−66 °C。
我们通过使用 SacI 限制性内切酶消化 MCF7 基因组 DNA 并进行自连接，构建了一个环状 DNA 模板。图 4 显示，在 MCF7 细胞系中发生了 TTC28-LINE-1 3´ 转导事件：从头插入可通过不同大小的 LDI-PCR 产物检测到，同时还能观察到一条已知大小（5,649 bp）的天然 PCR 产物。为了确定从头靶位点的基因组坐标，可对 PCR 扩增产物进行测序（参见方案第 4 部分）。
<img alt="基因编辑过程示意图，包含消化、连接、PCR方法；原生位点、靶位点及产物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59880/59880fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：利用LDI-PCR检测LINE-1 3´端转导的总体流程。 首先用限制性内切酶对DNA进行消化（I），然后将片段自连形成环状DNA模板（II）。随后使用针对目标LINE-1特异性标签的反向PCR引物进行反向PCR扩增（III），该标签位于LINE-1自身较弱的PAS（粉色）与下游较强的PAS（红色）之间的序列区域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59880/59880fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="琼脂糖凝胶电泳显示DNA条带；M，MCF7 gDNA，血液gDNA；23.1 kb，9.5 kb标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59880/59880fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：提取DNA的质量评估。 分别取MCF7细胞系提取的100 ng DNA以及正常个体血液提取的100 ng DNA（作为对照样本），与标记为M的λ DNA/HindIII标记物1 µL和2 µL一同进行电泳。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59880/59880fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同退火温度下电泳结果，显示DNA条带，PCR优化实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59880/59880fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：梯度PCR确定反向PCR引物（表1）的最佳退火温度。 使用反向引物对在56至66 °C退火温度范围内进行LDI-PCR，结果显示在62−66 °C时出现清晰的PCR产物。绿色箭头指示后续实验选用的退火温度。本优化步骤所用环状DNA模板，是通过用SacI酶切正常个体血液基因组DNA后自连接而获得。M，Marker（1 kb plus DNA Ladder）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59880/59880fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果，显示DNA条带及标记的大小标记物，比较MCF7、血液和水样样本。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59880/59880fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：通过LDI-PCR鉴定源自TTC28-LINE-1的LINE-1 3´端转导事件。 将MCF7细胞和正常个体血液基因组DNA用SacI酶切后进行自连接，形成环状DNA模板，并在最佳退火温度下使用反向引物进行扩增。在MCF7 DNA和正常血液DNA中均检测到预期大小（5,649 bp）的“天然”PCR产物（以星号标记），而MCF7样本还产生了其他不同大小的额外PCR产物，表明存在de novo LINE-1逆转座事件。M：标记物（1 kb DNA Ladder）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59880/59880fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>引物名称</td>
			<td>序列 (5´→ 3´)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1_001 (rev)</td>
			<td>TTCACTAAGCATGTATGTGGAAAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L1_002 (fwd)</td>
			<td>CCCAAAATATACCCAATTACTGGCA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：为TTC28-LINE-1独特标签设计的反向PCR引物对14。
补充文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59880/Supplemental_File_revised.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文概述了一种基于PCR的简便检测方法，用于监测活跃的LINE-1逆转座子的活性，并在特定基因组中定位从头逆转座事件。利用MCF7细胞系，我们在此展示了该方法如何用于检测位于22q12.1位点的LINE-1的活性。

通过长距离反向PCR检测活跃的嗜热LINE-1逆转座子活性

长散布核元件1（LINE-1s）是人类基因组中唯一能够自主移动的可移动遗传元件家族。它们通过以下方式实现移动……

该方法可检测称为LINE-1的逆转座子活性。这些可移动遗传元件可在癌症基因组中引起新生插入，从而导致基因组不稳定。这种基于PCR的技术相较于高通量测序方法具有操作简便、成本低廉的优势。本文展示了该方法在检测源自人类22号染色体TTC28基因内LINE-1的新生插入事件中的应用价值。LINE-1的活性可作为恶性肿瘤或癌前病变的生物标志物，尤其适用于结肠癌或高级别浆液性卵巢癌等上皮性肿瘤类型。除LINE-1插入外，该方法还可检测其他基因组异常，例如始终因特定原因而发生的DNA重排。为了选择合适的限制性内切酶并设计反向引物，首先从 LINE-1 数据库（如 L1Base）下载 TTC28 LINE-1 序列的 FASTA 格式文件。TTC28 LINE-1 的 L1Base 编号为 135。所下载序列应包含 LINE-1 序列两端上下游各五千个碱基的侧翼序列。将序列导出至文字处理软件。此处，Line-1 侧翼序列以棕色字体标注，Line-1 序列以灰色字体标注。为确定唯一的标签，需分析 TTC28 Line-1 三端下游一千个碱基的序列，并将其输入多聚腺苷酸化信号预测工具，例如 Polyadq 或 Dragon PolyA Spotter。标注此一千碱基窗口内的所有加 poly(A) 信号。此处以粉红色高亮显示的 TTC28 LINE-1 自身较弱的加 poly(A) 信号与下游最强加 poly(A) 信号之间的序列，即为该 LINE-1 的独特标签，此处以黄色高亮显示。为设计反向 PCR 引物，可将该独特标签序列输入基于网页的引物设计工具（如 NCBI 的 Primer-BLAST），以生成特异性 PCR 引物，并将产物长度参数设置为最小值，以确保引物对之间的距离较近。选择合适的基因组数据库。由于Primer Blast输出的是相对的常规PCR引物，因此需使用反向互补功能对引物对进行反向PCR设计。引物设计时，应尽可能对应于东部的多聚腺苷酸化信号区域。我们设计了三对引物，分别用青绿色和绿色高亮显示，对应于TTC28 LINE-1独特标签中的三个强多聚腺苷酸化信号。接下来，为了选择合适的限制性内切酶，可使用基于网页的工具（如RestrictionMapper）在硅片上对LINE-1序列及其上下游各五千碱基的侧翼区域进行酶切分析。这将提供一份全面的限制性内切酶列表，这些酶可切割该区域，产生不同的限制性片段。选择在LINE-1五端上游进行五端切割的限制性内切酶，或者如果切割位点位于LINE-1内部，则选择靠近LINE-1五端的酶。同时选择在唯一标签下游进行三端切割的限制性内切酶。由特异性限制性内切酶产生的包含LINE-1序列及其唯一标签的天然限制性片段长度不应超过12 kb，否则可能无法通过PCR有效扩增。需要注意的是，所选用的限制性内切酶应对DNA甲基化不敏感，能够通过加热失活，并能产生彼此互补的黏性末端。为了展示长距离反向PCR，我们将使用SacI限制性内切酶，该酶在DNA上的DAZCTC位点进行切割，此处以浅绿色高亮显示。SacI在TTC28 LINE-1位点满足所有上述条件，并产生一个长度为5,700个碱基对的天然限制性片段。使用市售的DNA提取试剂盒从样本中提取基因组DNA，该试剂盒能够提取高质量、高分子量的DNA，适用于长距离反向PCR。本文中，我们根据制造商说明书，从MCF7乳腺癌细胞系和正常人血液中提取了基因组DNA。使用荧光计测定DNA浓度。将100纳克DNA与DNA分子量标记物一同在琼脂糖凝胶上进行电泳，以检测DNA的质量和数量。为制备环状DNA模板，首先使用合适的限制性内切酶对DNA进行消化。此处我们使用SacI酶消化MCF7和血液基因组DNA。按照文本方案配制消化反应体系。轻弹管壁混匀溶液，短暂离心。按照制造商说明书，将反应混合物在37摄氏度孵育1小时，随后进行热失活。接下来，根据文本方案配制连接反应主混合液，用于自连消化后的DNA。每个反应中，将30 µL连接反应主混合液直接加入上一步得到的50 µL已消化DNA溶液中。通过轻弹管壁混匀溶液，并短暂离心。将反应混合物置于热循环仪中，在22 °C孵育10分钟，最后在60 °C进行10分钟的热失活步骤。该环状DNA模板将用于后续的反向PCR步骤。在PCR仪中设置退火温度梯度，通过梯度PCR确定引物的最佳退火温度。根据文本方案，将所有组分混合，配制PCR反应的预混液。在梯度中为每个退火温度设置一个反应。每个反应中，分配19微升主混合液至PCR管，并加入1微升由血液基因组DNA制备的环状DNA模板。运行梯度PCR程序。取6 µL PCR产物，在一次反应中以不同退火温度进行琼脂糖凝胶电泳。为检测MCF7细胞系基因组中新生的TTC28 LINE-1逆转座活性，使用反向引物对针对由MCF-7细胞系产生的环状DNA模板进行PCR扩增。操作步骤与梯度PCR相同，但此次将温度梯度替换为最佳退火温度，即64 °C。通过琼脂糖凝胶电泳分析长距离反向PCR产物的结果。该电泳后的琼脂糖凝胶图像显示，从MCF7和血液样本中提取的基因组DNA具有高分子量，适用于长距离反向PCR。该电泳后的琼脂糖凝胶图像表明，我们设计的反向引物对可在梯度中的所有退火温度下扩增正确的环状模板，表现为在5 kb至7 kb DNA标记之间出现明显的条带。然而，在较低温度下也观察到多条条带，表明引物特异性差以及退火温度不理想。因此，对于这对引物，64摄氏度为最佳退火温度。该琼脂糖凝胶图像显示了对MCF7细胞系和正常血液中提取的DNA进行长距离反向PCR后获得的PCR产物。一个大小为 5,700 个碱基对的 PCR 产物（以星号标记）代表位于其天然位点的 LINE-1 对应的天然 PCR 产物。该天然 PCR 产物在 MCF7 和正常血液 DNA 中均可观察到。新生的 LINE-1 逆转座事件以及 MCF7 基因组可通过琼脂糖凝胶上不同大小的 PCR 产物检测到，同时还能观察到天然 PCR 产物。通过单分子长读长测序技术对远距离反向PCR产物进行测序，可在核水平高分辨率下实现靶标鉴定。尽管较为繁琐，也可对远距离反向PCR产物进行克隆并采用桑格测序法进行测序。在本视频中，检测到了位于22号染色体上一个LINE-1元件的活性。相同的实验流程可适用于监测在不同类型肿瘤中具有活性的其他 LINE-1 元件。

detection-retrotransposition-activity-hot-line-1s-long-distance

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

长距离反向PCR对热线1的逆变活性的检测

本文描述了一种低成本、高通量的方法，可同时检测多达43个分子靶标。多重PCR/反向线性杂交（mPCR/RLB）的应用包括微生物分型以及从临床样本中检测多种病原体。...

多重PCR与反向线点杂交分析（mPCR/RLB）

我们描述了一组用于分析H1连接子组蛋白表达水平的检测方法。通过基于随机引物的逆转录反应，随后进行实时PCR，可对各个H1基因的mRNA进行定量检测；而H1组蛋白的蛋白质定量则通过高效液相色谱（HPLC）分析实现。...

哺乳动物连接组蛋白亚型的表达分析

线性扩增介导PCR——遗传元件的定位与未知侧翼DNA的表征

本研究采用 FISH 技术，在稳定表达合成 LINE-1 的 HepG2 细胞系染色体铺展样本中，于单细胞核水平追踪 LINE-1...

单细胞核水平下的LINE-1逆转座子插入分析

本文描述了一种双向整合位点检测方法的实验流程及软件分析步骤，该方法可同时分析上游和下游的载体-宿主连接DNA。所获得的双向PCR产物可用于任何下游测序平台。所得数据可用于对整合的DNA靶标进行高通量、定量的比较分析。...

双向逆转录病毒整合位点PCR方法及定量数据分析流程

本方案描述了在膜片钳记录后进行单细胞多重逆转录聚合酶链式反应所需的关键步骤和注意事项。该技术是一种简单而有效的方法，可用于分析通过膜片钳记录所鉴定的单个细胞中预设基因集的表达谱。...

膜片钳后单细胞多重逆转录聚合酶链式反应

本文介绍一种利用液滴式数字PCR（drop-off...

单液滴数字聚合酶链式反应用于热点区域突变的全面同步检测

本文介绍了一种利用 Southern 印迹法和/或 PCR 鉴定小鼠胚胎干细胞中同源重组事件的详细实验方案。该方法以采用传统基于胚胎干细胞的同源重组介导靶向技术构建非肌肉肌球蛋白 II...

利用Southern印迹与聚合酶链式反应鉴定小鼠胚胎干细胞中的同源重组事件

本文介绍了一种生物信息学方法及相关分析，用于在特定位点水平上鉴定 LINE-1...

RNA下一代测序及生物信息学分析流程在位点特异性水平鉴定表达的LINE-1元件

D-环捕获（DLC）和D-环延伸（DLE）实验利用邻近连接原理结合定量PCR，用于定量检测酿酒酵母（Saccharomyces...

同源重组中间体的检测 通过 邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

接合作用通过在两个不同细胞之间转移质粒DNA介导水平基因转移，促进有益基因的传播。本研究描述了一种广泛使用的方法，用于高效检测接合性质粒的转移，该方法基于在接合性质粒、供体和受体中使用差异标记来检测转接合子。...

由天然接合性质粒介导的水平基因转移检测 E. coli

了解长距离反向PCR检测LINE-1逆转录转座子活性的方法。该技术利用MCF7细胞系检测TTC28基因位点的de novo插入，为癌症基因组不稳定性研究提供简便经济的分子工具。

通过长距离反向PCR检测活跃的嗜热LINE-1逆转座子活性

探索更多视频