Eine neuartige Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Korrekturmethode zur intrazellulären Ca2+-Messung mit Fura-2-Analog in lebenden Zellen
20. September 2019
Aufgrund der spektralen Überlappung der Anregungs- und Emissionswellenlängen von NADH- und Fura-2-Analogen ist die Signalinterferenz beider Chemikalien in lebenden Zellen bei der quantitativen Messung von [Ca2+ ]unvermeidbar. So wurde eine neuartige Online-Korrekturmethode der NADH-Signalinterferenz zur Messung [Ca2+] entwickelt.
UV-erregbare Pluralsonden haben aufgrund der Auto-Plural-Sounds eine inhärente Signalkontamination. Das meiste Problem mit NADH, ist die Begrenzung der Verwendung einer Pluralsonde. Es kann eine Methode verwendet werden, um die äußere Blütenstand von NADH genau zu korrigieren, um ein echtes, nicht kontaminiertes Plural-Sondensignal zu extrahieren.
Demonstriert wird das Verfahren von Jeong Hoon Lee, unserem wissenschaftlichen Assistenzprofessor aus meinem Labor. Nachdem Sie die Myozyten an der Unterseite der Röhre absetzen lassen, aspirieren Sie den Überstand. Beschriften Sie die Zellen mit zwei Millilitern frisch zubereiteter Millimolar-Fura-2-FFAM-Verdünnungslösung für 60 Minuten bei vier Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation, legen Sie die Röhre in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 30 Minuten in der aufrechten Position, bevor Sie den Überstand entfernen. Dann fügen Sie vier Milliliter Raumtemperatur Kulturmedium für die Lagerung bei Raumtemperatur. Denn in situ isobestic fura-2-ffa Punkt-Identifikation montieren die verdünnten Zellen auf die Mikroskop-Bühne und warten drei Minuten, bis die Zellen auf den Boden sinken.
NADH-freie 37 Grad Celsius kalziumfreie Lösung in die Zellkultur einfließen lassen und eine Zielzelle lokalisieren. Eine profuse Saponin-Lösung für 60 Sekunden vor dem Wiederauflösen mit der NADH-freien calciumfreien Lösung. Messen Sie gleichzeitig die fura-2-ff emittierten Signale bei 450 und 500 Nanometern, wobei ein Anregungsscan von 350 bis 365 Nanometern mit einem 0,1 Nanometer-Schritt verwendet und mit NADH-freier Calcium-freier Lösung wieder aufgefroren wird.
Als nächstes subtrahieren Sie die Signale in der kalziumgesättigten Lösung von den Signalen in den kalziumfreien Bedingungen. Berechnen Sie dann die Standardabweichungen der Emission bei jeder Anregung und wählen Sie die Anregungswellenlänge aus, die die minimalen Standardabweichungswerte als einzelne isobestische Punkte anzeigt. Um ein multiparametrisches Messsystem zu verwenden, um das Hintergrundsignal zu erkennen und das Signal im Zellbereich zu korrigieren, montieren Sie farbfreie Zellen im Mikroskopbad und lassen Sie die Zellen sich für drei Minuten absetzen.
NADH-Calciumfreie Lösung für etwa fünf Minuten bei einer Rate von zwei bis drei Millilitern pro Minute ins Bad bringen und das Objektfeld so einstellen, dass es die Zielzelle abdeckt. Nach dem Verschieben der Zelle aus dem Feld messen Sie die Hintergrundsignale des zellfreien Fensters und stellen Sie die Signale als Offsets ein. Kehren Sie dann die Zelle an die Ausgangsposition zurück und messen Sie die Zellhintergrundsignale und den Zellbereich.
Um den R-Faktor zu berechnen, verwenden Sie den erfassten Zellhintergrund und die Flächensignale, bevor Sie die farbfreien Zellen wieder auf das Mikroskop montieren und mit kalziumfreier Lösung beschneiden. Messen Sie die Signale wie angegeben, bevor Sie die Zellsuspension mit Malatlösung entweiht. Nach der Messung der Signale überaus die Zellen mit Pyruvat-Lösung gefolgt von Überfluss mit Malat-Pyruvat-Lösung und Roton-Lösung.
Berechnen Sie dann die Steigung für jedes Signal. Hier werden die Veränderungen des mitochondrialen Kalziums vor und nach der Korrektur angezeigt. Die Ergebnisse zeigen deutlich wesentliche Veränderungen des mitochondrialen Kalziums mit einer mitochondrialen ruhenden Calciumkonzentration ohne zytosolisches Calcium von 1,03 plus oder minus 0,13 Mikromolar und maximales mitochondriales Kalzium bei einem Mikromolaren Calcium von 29,6 plus oder minus 1,61 Mikromolar.
Das mitochondriale Transmembranpotential wurde mit einer Fülle von zwei Nanomolaren TMRE überwacht. Die Veränderung des mitochondrialen Potentials wurde auf der Grundlage eines angenommenen anfänglichen mitochondrialen Membranpotentials von minus 150 Millivolt berechnet, was eine Abnahme der NADH als Reaktion auf Kalziumzugabe zeigt, mit einer negierbaren Wirkung auf das mitochondriale Membranpotenzial. Der mitochondirale pH-Wert wurde nicht durch die Erhöhung des durch carboxy SNARF-1-Belastung induzierten mitochondrialen Kalziums bewirkt.
Falsche isobestische Punkte führen zu einer falschen R- und NADH-Korrektur. Achten Sie also darauf, den zellfreien Hintergrund und den Zellbereich immer richtig zu messen. Diese Technik wird verwendet, um mitochondriale Kalzium-Dynamische Studien in den bioanalytischen Verschüttungen vorzubereiten.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie beschäftigt sich mit der Herausforderung der Signalinterferenz durch NADH und Fura-2-Analoga bei der Messung von Kalziumkonzentrationen in lebenden Zellen. Eine neuartige Online-Korrekturmethode wurde entwickelt, um die Genauigkeit der [Ca2+]-Messungen bei Vorhandensein von NADH-Signalverunreinigungen zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Signalstörungen bei Fluoreszenzmessungen
- Calciummessung in lebenden Zellen
- Entwicklung von Korrekturverfahren
Hintergrund
- Die spektrale Überlappung von Anregungs- und Emissionswellenlängen erschwert Messungen.
- NADH kann die Anwendbarkeit mehrerer Sonden in der Fluoreszenzmikroskopie einschränken.
- Genaue Messungen der [Ca2+] sind in zellulären Untersuchungen entscheidend.
Verwendete Methoden
- Fluoreszenzmessung mit Fura-2
- Zellbasierte Assays mit Myozyten
- Signal-Korrekturverfahren und Hintergrundmessung
Hauptergebnisse
- Erhebliche Veränderungen der mitochondrialen Kalziumkonzentrationen beobachtet.
- Entwicklung eines systematischen Ansatzes zur Korrektur von NADH-Störungen.
- Validierung der Methode durch umfassende experimentelle Verfahren.
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert erfolgreich eine Methode zur Verbesserung der Genauigkeit von Fluoreszenzmessungen.
- Dies hat Auswirkungen auf quantitative Analysen in der Zellbiologie.
Häufig gestellte Fragen
Praktische Bedeutung für die Industrie
Die genaue Messung des intrazellulären Kalziums ist entscheidend für die Zielvalidierung in der Arzneimittelforschung, insbesondere bei mitochondrialen Signalwegen. Die Autofluoreszenz von NADH verursacht erhebliche Störungen in auf Fura-2 basierenden Assays, beeinträchtigt die Datenzuverlässigkeit und erhöht die Rate falsch-positiver Ergebnisse im frühen Screening. Diese NADH-Korrekturmethode verbessert die Vorhersagesicherheit, indem echte Kalziumsignale isoliert werden, und unterstützt die mechanistische Entschärfung von Risiken in kardiovaskulären und metabolischen Zielprogrammen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung der mitochondrialen Kalziumregulation als therapeutische Hypothese in Krankheitsmodellen.
- Operationaler Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem NADH-Autofluoreszenz von echten Fura-2-Signalen getrennt wird.
- Predictiver Wert: Verbessert die Zielhypothesensicherheit durch quantitative, störungsfreie Messungen des Kalziumflusses.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Verbindungsscreening vor, indem die NADH-korrigierte Fluoreszenz als Basislinie etabliert wird.
- Reproduzierbarkeit: Standardisiert die Auswahl der Anregungswellenlänge durch Bestimmung des isobestischen Punkts und verringert so die Variabilität zwischen Assays.
- Multiplex-Fähigkeit: Ermöglicht die gleichzeitige Messung von NADH, Calcium sowie pH oder Membranpotential unter Verwendung unterschiedlicher Anregungs- und Emissionswellenlängen.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Direkt anwendbar auf Modelle mitochondrialer Dysfunktion bei neurodegenerativen und Stoffwechselerkrankungen.
- Translationskontinuität: Verbindet Beobachtungen zum Kalziumfluss in der Entdeckungsphase mit der präklinischen Validierung unter Verwendung korrigierter Fura-2-FF-Signale.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht zuverlässigere Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung falscher Signale in mitochondrialen Kalzium-Assays.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Target-Hypothesen über die Identifizierung von Leitsubstanzen bis hin zur präklinischen mechanistischen Validierung ein, insbesondere für mitochondriale Zielstrukturen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen, indem kalziumabhängige Signale in Live-Zell-Assays von metabolischen Störungen isoliert werden.
- Screening: Verbessert die Assaytauglichkeit durch Hintergrundsubtraktion und Offset-Korrektur, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis für die Bewertung von Verbindungen erhöht wird.
- Analytik: Ermöglicht quantitative verhältnisbestimmende Messungen mittels R-Faktor-Berechnung unter Verwendung der korrigierten Emission bei 450 nm und 500 nm.
- Translationale Forschung: Schließt an präklinische Untersuchungen an, indem gleichzeitig Kalzium und das mitochondriale Membranpotenzial unter Verwendung von TMRE überwacht werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen wiederverwendbaren Korrekturrahmen, der auf verschiedene Zelltypen und fluoreszierende Sonden anwendbar ist, die anfällig für NADH-Störungen sind.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem NADH-induzierte Falsch-Positiv-Signale in der Kalziumsignalisierung eliminiert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch systematische Identifizierung des isobestischen Punkts und Hintergrundsubtraktion.
- Strategischer Wert: Unterstützt fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen, indem biologisches Rauschen in frühen Screening-Stufen reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung mitochondrialer Targets durch zuverlässige, störungsfreie funktionelle Messungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Fluoreszenzmikroskopie und im Umgang mit ratiometrischen Sonden.
- Benötigt eine Instrumentierung, die eine Wellenlängenscan-Anregung (350–365 nm) und eine Detektion mit doppelter Emission (450 nm, 500 nm) ermöglicht.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Messung des Hintergrundsignals und bei den Korrekturprotokollen für den Offset.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen, wenn die Methode auf verschiedene dye-freie Zellpräparationsabläufe angewendet wird.
- Hängt von einer sorgfältigen Messung der signalfreien Hintergrundwerte und der Zellflächensignale ab, um eine falsche Auswahl des isobestischen Punkts zu vermeiden.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Mitochondrial Fluoroprobe Loading
1:22
In Situ Isosbestic Fura-2-FF Point Identification
2:40
Background Signal Detection and Cell Area Correction
3:30
R Factor Measurement
4:12
Results: Representative Intracellular Ca2+ Measurement
5:15
Conclusion
