Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils
September 28th, 2019
Hier ist ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen nativer Form, Präfibrillar und reifen Amyloidfibrillen verschiedener Peptide und Proteine mit Mitochondrien aus verschiedenen Geweben und verschiedenen Bereichen des Gehirns isoliert.
In diesem Video beschreiben wir eine Modellstudie für den Mechanismus der Amyloid-Toxizität auf Membranebene unter Verwendung von Rattenhirnmitochondrien als in vitro biologisches Modell. Trotz des akkumulierenden Berichts, der den Mechanismus der Membranstörungen durch Amyloid-Aggregat in Phospholipid-Modellsystemen beschreibt, die direkt auf die Ereignisse abzielen, die bei der Entwicklung der biologischen Membran beginnen. Im vorliegenden Video beschreiben wir Amyloidfibrillen von Alpha-Synuclein, die die Mitochondrienmembran des Rattengehirns als in vitro biologisches Modell analysieren.
Wir glauben, dass Mitochondrien als Organelle mit gut charakterisierten Membranen ein äußerst nützliches biologisches Modellsystem für molekulare Studien im Zusammenhang mit dem Mechanismus der Amyloidzytotoxizität auf Membranebene im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen bieten können. Enthaupten Sie die Ratte mit einer kleinen tierischen Guillotine und entfernen Sie das Gehirn von der Skala innerhalb einer Minute nach der Enthauptung der Ratte, um eine mögliche Verschlechterung der mitochondrialen Eigenschaften zu begrenzen. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und alles während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten.
Waschen Sie das Gewebe zweimal mit 30 Milliliter Isolationspuffer. Auf einen Becher mit Kalteisolationspuffer übertragen und das Gehirn mit einer Schere fein zerkleinern. Übertragen Sie die Gewebesuspension auf einen 20 Milliliter Kaltentun-Homogenisator.
Homogenisieren Sie die Gewebestücke mit neun Auf- und Abschlägen mit einem motorisierten Stößel. Lassen Sie die Mischung ca. 30 Sekunden nach jedem Satz von drei Homogenisierungsschlägen auf Eis, um sicherzustellen, dass das Homogenat kalt bleibt. Das Homogenat bei vier Grad Celsius drei Minuten in ein vorgekühltes Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 1, 300 G geben.
Den Überstand vorsichtig dekantieren und in ein vorgekühltes Zentrifugenrohr geben. Zentrifuge bei 21.000 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Dichtegradientenmedium wieder auf, indem Sie die Mischung vorsichtig mit der Pipette rühren.
Zentrifuge in einem festen Winkelrotor bei 30, 700 G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie mit einer Pasteur-Pipette das scharfe Ende des oben angesammelten Materials, das meist Myelin enthält. Fügen Sie der mitochondrialen Fraktion einen Isolationspuffer von acht Millilitern hinzu, während Sie die Mischung vorsichtig mit der Pipette rühren.
Zentrifuge bei 16, 700 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, so dass das untere lose Pellet ungestört bleibt. Fügen Sie einen Milliliter 10 Milligramm pro Milliliter fettsäurefreies BSA in das Zentrifugenrohr, während Sie die Mischung vorsichtig mit der Spitze der Pipette rühren.
Machen Sie das Volumen auf fünf Milliliter, indem Sie Isolationspuffer hinzufügen. Zentrifuge bei 6, 900 G bei vier Centigrade für 10 Minuten. Dadurch sollte ein festes Pellet entstehen.
Dekantieren Sie den Überstand und setzen Sie das mitochondriale Pellet im Isolationspuffer sanft wieder aus. Mitochondriales Homogenat auf ein Milligramm pro Milliliter mit Kälteisolationspuffer verdünnen und in zwei 1,5-Milliliter-Röhren, typischerweise 195 Mikroliter Mitochondrien pro Tube, geben. Fügen Sie fünf Mikroliter 20% Volumen pro Volumen Triton X-100 zu einem Rohr als positive Kontrolle für maximale Enzymaktivität und fünf Mikroliter entionisiertes Wasser zu einem anderen Rohr zur Kontrolle, gefolgt von dem Mischen mit einem Rührwerk.
Inkubieren Sie die Rohre für 10 Minuten in warmes Wasserbad auf 30 Centigrade eingestellt. Pellet mitochondrien durch Zentrifugieren von Rohren in einem festen Winkelrotor bei 16 000 G vier Grad Celsius für 15 Minuten. Sammeln Sie sorgfältig resultierende Überstandmittel zur Beurteilung der Aktivität der mitochondrialen Malatdehydrogenase mit einem standardspektrophotometrischen Assay, der im nächsten Teil beschrieben wird.
Berechnen Sie die Integrität der mitochondrialen Membran wie folgt. Zur Bestimmung der Malate-Dehydrogenase-Aktivität simpere Pipette 890 und 880 Mikroliter 50 Millimolar Tris-HCL Puffer zu leeren und Probe test Küvetten jeweils gefolgt von 100 Mikroliter 50 Millimolar Oxaloacetat und 10 Mikroliter 10 Millimolar Beta-NADH. Setzen Sie die Küvetten in ein Spektralphotometer und Referenz gegen Leerzeichen.
10 Mikroliter mitochondriales Homogenat ein Milligramm pro Milliliter zur Probeküvetette geben. Sofort durch Inversion mischen. Rekordabnahme der Absorption durch NADH-Oxidation bei 340 Nanometer für eine Minute.
Für Alpha-Synuclein-Amyloid-Fibrillation, fügen Sie 294 Mikroliter Proteinlösung, 200 Mikromolar zu jeder 1,5 Milliliter Tube. Dann fügen Sie sechs Mikroliter ThT-Lösung ein Millimolar. Mischen Sie die Lösungen und inkubieren Sie die Rohre in einem Thermomixer bei 37 Centigrade unter ständigem Rühren bei 800 U/min.
Für Rinder insulin amyloid Fibrillation, fügen Sie 637 Mikroliter Proteinlösung, 250 Mikromolar zu 1,5 Milliliter Tube. Dann fügen Sie 13 Mikroliter ThT-Lösung ein Millimolar gefolgt von Rühren. Fügen Sie aliquots 200 Mikroliter Proteinlösungen zu jedem Brunnen einer klaren unteren 96-Well-Platte hinzu.
Versiegeln Sie die Platte mit kristallklarem Dichtband. Laden Sie die Platte in Cytation 5 Fluoreszenzplattenleser. Messen Sie die ThT-Fluoreszenz im 30-Minuten-Takt für 12 Stunden.
Verwenden Sie Anregung bei 440 Nanometer und Emission bei 485 Nanometer. Wählen Sie die Brunnen aus. Schütteln Sie die Platte fünf Sekunden vor jeder Messung.
Stellen Sie die Temperatur ohne Rührung auf 57 Grad Celsius ein. Bereiten Sie zwei Reihen von 1,5 Milliliter-Röhren vor, die mitochondriale Homogenate enthalten, eine Serie für MDH-Freisetzungstest und eine andere für die mitochondriale ROS-Messung. Fügen Sie Aliquots von frischen oder amyloiden Fibrillen von Alpha-Synuclein, Rinderinsulin oder Hühnereiweißlysozym zu mitochondrialem Homogenat hinzu, gefolgt von sanfter Pipettierung.
Inkubieren Sie Röhren mit mitochondrialen Suspensionen für 30 Minuten in warmem Wasserbad auf 30 Grad Celsius eingestellt. Für den Exat-Dehydrogenase-Freisetzungstest werden zentrifugierte mitochondriale Homogenate bei 16.000 G für 15 Minuten inkubiert. Sammeln Sie sorgfältig resultierende Überstand für die Aussage der Aktivität der mitochondrialen MDH, wie auf Protokollabschnitt 4 beschrieben.
Berechnen Sie die Freigabe von MDH wie folgt. Für die mitochondriale ROS-Messung, Pipette 191 Mikroliter inkubiertes mitochondriales Homogenat zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte. Fügen Sie vier Mikroliter von 50 Mikromolar DCFDA.
Dann fünf Mikroliter 200 Millimolar Succinat hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte für 30 Minuten in warmem Wasserbad auf 30 Centigrade eingestellt unter sanftem Rühren. Laden Sie die Platte in einen Cytation 5 Fluoreszenzplattenleser und messen Sie die Fluoreszenzintensität gemäß dem Protokollabschnitt.
Die mitochondriale Membranintegrität wurde durch Messung der MDH-Aktivität in den isolierten Mitochondrien vor und nach Membranunterbrechung und Enzymfreisetzung durch Triton X-100 bewertet. Wie Sie sehen, haben wir in der Regel festgestellt, dass mitochondriale Präparate etwa 93% intakt sind. ThT Fluoreszenz-Assay wurde durchgeführt, um das Wachstum von Amyloidfibrillen zu überwachen.
Die Kurve für Amyloid-Fibrillation von drei Proteinen zeigte ein typisches sigmoidales Muster, das bei Alpha-Synuclein, Rinderinsulin und Hühnereiweißlysozym bis zu einem Plateau reichte, was auf die Bildung von Amyloidfibrillen hindeutet, die durch AFM-Messung mehr bestätigt wurden. Mögliche Permeabilisierung und Schädigung der mitochondrialen Membran durch Amyloidfibrillen wurde durch die Freisetzung von mitochondrialer MDH und mitochondrialer ROS-Messung untersucht. Wie Sie in der linken Grafik sehen, wurde eine wesentliche Freisetzung von MDH bei Zugabe der Alpha-Synuclein-Amyloidfibrillen zu Mitochondrien beobachtet.
Während eine leichte Freisetzung durch Insulinfibrillen festgestellt wurde, wurden Hühnerei-Weiß-Lysozyme-Fibrillen als unwirksam befunden. Rechte Grafik zeigt die Wirkung von Amyloidfibrillen auf den mitochondrialen ROS-Gehalt. Während keine signifikante Verbesserung der mitochondrialen ROS wurde bei Zugabe von Hühnerei Weiß Lysozym oder Insulin Amyloid Fibrillen beobachtet, Behandlung mit Alpha-Synuclein Fibrillen führte zu einem erheblichen Anstieg des ROS-Gehalts des Gehirns Mitochondrien.
Das vorliegende Video beschreibt eine Modellstudie für den Mechanismus der Fibel-Aggregatzytotoxizität auf Membranebene und zeigt, wie Amyloidfibrillen, die aus verschiedenen Proteinen entstehen, unterschiedliche Grade von Membranschäden und Permeabilisierung verursachen können. Während einige Themen der Amyloidfibrillen und ihre spezifische Bindungsmembran scheinen mit der Fähigkeit zu interagieren und verursachen Destabilisierung und nachfolgende Störungen der Membranen. Nach diesem Video werden Sie in der Lage sein, die Wechselwirkung von nativer Form, Präfibrillar und reifen Amyloidfibrillen verschiedener Peptide und mit Mitochondrien aus verschiedenen Geweben oder verschiedenen Bereichen des Gehirns isoliert zu untersuchen.
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Überblick
Dieses Protokoll untersucht die Wechselwirkungen zwischen Amyloid-Fibrillen und isolierten Mitochondrien aus verschiedenen Hirngeweben. Es konzentriert sich auf den Mechanismus der Amyloid-Toxizität auf Membranebene unter Verwendung von Rattenhirn-Mitochondrien als In-vitro-Modell.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Neurodegenerative Erkrankungen
Hintergrund
- Amyloid-Aggregate sind bekannt dafür, biologische Membranen zu stören.
- Das Verständnis ihrer Wechselwirkung mit Mitochondrien ist entscheidend für die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen.
- Die Rattenhirn-Mitochondrien bieten ein gut charakterisiertes Modell für diese Studien.
- Die schnelle Isolierung von Mitochondrien ist unerlässlich, um ihre Eigenschaften zu erhalten.
Zweck der Studie
- Um den Mechanismus der Amyloid-Zytotoxizität an der mitochondrialen Membran zu erforschen.
- Um Rattenhirn-Mitochondrien als biologisches Modell für diese Untersuchung zu nutzen.
- Um die Auswirkungen verschiedener Amyloid-Fibrillen auf die mitochondriale Integrität zu analysieren.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Mitochondrien aus Rattenhirngewebe.
- Analyse von Amyloid-Fibrillen von Alpha-Synuclein.
- In-vitro-Experimente zur Beurteilung von Membranstörungen.
- Aufrechterhaltung niedriger Temperaturen zur Verhinderung der mitochondrialen Verschlechterung.
Hauptergebnisse
- Charakterisierung der Auswirkungen von Amyloid-Fibrillen auf mitochondriale Membranen.
- Belege für Membranstörungen durch Amyloid-Aggregate.
- Einblicke in die Beziehung zwischen Amyloid-Toxizität und mitochondrialer Funktion.
- Etablierung eines zuverlässigen In-vitro-Modells für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Mitochondrien dienen als wertvolles Modell zur Untersuchung der Amyloid-Toxizität.
- Das Verständnis dieser Wechselwirkungen kann zu Erkenntnissen über neurodegenerative Mechanismen führen.
- Zukünftige Forschung kann auf diesem Modell aufbauen, um therapeutische Strategien zu erkunden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol provides a biologically relevant in vitro model to assess amyloid-induced mitochondrial membrane permeabilization, a key mechanism in neurodegenerative disease pathology. By using isolated rat brain mitochondria, the approach enables direct evaluation of amyloid fibril interactions with native organelle membranes, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The structure-dependent effects observed—particularly with alpha-synuclein fibrils—offer predictive insights for prioritizing therapeutic candidates based on mitochondrial toxicity profiles.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of amyloid fibril interactions with mitochondrial membranes to clarify structure-toxicity relationships.
- Operational Value: Provides a reproducible assay for assessing mitochondrial integrity via MDH release and ROS generation as functional readouts.
- Predictive Value: Supports early identification of amyloid species with high membrane-disrupting potential, informing lead selection and de-risking.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized workflow for preparing brain mitochondria with confirmed membrane integrity for downstream compound or fibril screening.
- Quantitative Output: Delivers measurable endpoints—MDH release and ROS fluorescence—that enable dose-response and comparative analysis across amyloid preparations.
- Scalability: The protocol supports multi-well formats (e.g., 96-well plates) for ROS measurement, facilitating medium-throughput screening of fibril variants or inhibitory compounds.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models a proposed mechanism of amyloid toxicity in neurodegenerative diseases, linking in vitro findings to pathophysiological processes.
- Translational Continuity: Supports biomarker-aligned studies by quantifying mitochondrial dysfunction, a feature observed in patient-derived models and clinical specimens.
- Preclinical De-risking: Helps prioritize amyloid-targeting interventions by identifying fibrillar forms most likely to impair mitochondrial function in relevant tissue contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, particularly after target engagement and before lead optimization, by providing mechanistic insight into amyloid-induced organelle damage. It complements biochemical and cellular assays by adding a native membrane context to toxicity assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on amyloid-mitochondria interactions and pathway clarification related to oxidative stress and bioenergetic failure.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility testing when evaluating compound effects on amyloid-induced mitochondrial permeabilization.
- Analytics: Generates quantitative readouts (MDH activity, ROS levels) that allow comparison of toxic potential across amyloid preparations or genetic variants.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling a conserved mechanism of mitochondrial dysfunction seen in neurodegenerative disease models.
- Enterprise Reuse: The mitochondrial isolation and integrity validation steps create a reusable platform applicable to other amyloidogenic proteins or tissue-specific mitochondria.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking amyloid fibril structure to mitochondrial membrane disruption.
- Operational Value: Promotes reproducibility through standardized isolation, integrity confirmation (MDH activity), and controlled incubation conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying amyloid species with high mitochondrial toxicity potential, reducing investment in non-mechanistically relevant targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by flagging early signals of organelle-level toxicity that may predict late-stage safety concerns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation techniques and enzymatic activity assays to ensure preparation quality.
- Depends on centrifugation equipment capable of precise g-forces and temperature control (4°C) to maintain mitochondrial integrity.
- Necessitates standardization across teams for membrane integrity assessment (e.g., MDH activity thresholds) to enable cross-study comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the model to mitochondria from different brain regions or species, which may affect baseline susceptibility.
- Limited by the in vitro nature of the model, which may not fully capture dynamic cellular environments or compensatory mechanisms present in vivo.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:10
Brain Homogenization and Mitochondrial Isolation
4:33
Mitochondrial Membrane Integrity Determination
5:58
Malate Dehydrogenase Activity Determination
7:07
In vitro α-synuclein, Bovine Insulin, and HEWL Fibril Formation
10:11
Treatment of Mitochondria with Amyloid Fibrils, MDH Release Assay, and ROS Measurement
12:14
Results
14:07
Conclusion
