Name: Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 s
Description: Erfahren Sie die Untersuchung von Amyloid-Toxizität an mitochondrialen Membranen mit Rattenhirn-Mitochondrien als in vitro Modell. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in neurodegenerative Mechanismen.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Research Council des Institute for Advanced Studies in Basic Sciences (IASBS), Zanjan, Iran, unterstützt.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Medizinischen Wissenschaften der Universität Teheran durchgeführt. Es wurden maximale Anstrengungen unternommen, um Leiden und schädliche Auswirkungen auf die Ratten zu minimieren, indem die Guillotineklingen geschärft und entschlossene und schnelle Bewegungen der Klinge angewendet wurden.
1. Hirnhomogenisierung und mitochondriale Isolation
HINWEIS: Alle Reagenzien für die mitochondriale Isolierung wurden nach Sims und Anderson14hergestellt.
<ol><li>Vorbereitung von Puffern für die mitochondriale Isolierung<ol>
<li>Bereiten Sie eine 100 mM Tris-HCl-Lösung vor: wiegen Sie 0,605 g Tris-HCl und lösen Sie sie in ca. 40 ml entionisiertem Wasser (DW) in einem Becher auf. Übertragen Sie die Lösung auf einen 50 ml Volumetkolben und erhöhen Sie das Endvolumen durch Hinzufügen von DW auf 50 ml.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 10 mM EDTA-Lösung vor: wiegen Sie 0,202 g EDTA und lösen Sie sie in ca. 40 ml DW in einem Becher auf. Übertragen Sie die Lösung auf einen 50 ml Volumetkolben und erhöhen Sie das Endvolumen durch Hinzufügen von DW auf 50 ml. HINWEIS: Beide Lösungen können bei 4 °C für mindestens 4 Wochen gelagert werden.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Tris-HCl/EDTA/Saccharose-Lagerlösung vor: 30 ml 100 ml Tris-HCl und 30 ml 10 mM EDTA in einem Becher hinzufügen. 32,86 g Saccharose wiegen und unter Rühren mit einem Magnetrührer in das Becherglas geben. Wenn die Saccharose gelöst ist, übertragen Sie die Lösung auf einen 100 ml Volumet-Kolben und erhöhen Sie das Endvolumen auf 100 ml durch Hinzufügen von DW. HINWEIS: Diese Lösung kann bei 4 °C für bis zu 3 Tage gelagert werden.</li>
		<li>Einen Isolationspuffer (IB) vorbereiten: 100 ml Tris-HCl/EDTA/Saccharosebestand zu ca. 150 ml DW hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein, indem Sie 0,1 M HCl hinzufügen. Erhöhen Sie das Endvolumen durch Hinzufügen von DW auf 300 ml.</li>
		<li>Bereiten Sie 15% (v/v) DichteGradientenmedium mit IB vor, indem Sie 1,5 ml Dichtegradienten mittlerer bis 8,5 ml kalter IB hinzufügen.</li>
		<li>10 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) Lösung vorbereiten: 20 mg fettsäurefreie BSA wiegen und in ca. 1,5 ml DW in einer 2 ml Durchstechflasche auflösen. Erhöhen Sie das Endvolumen auf 2 ml, indem Sie DW hinzufügen und bis zur Verwendung auf Eis speichern. HINWEIS: Bereiten Sie die Lösungen von den Schritten 1.1.4–1.1.6 am Tag der mitochondrialen Isolation frisch vor und lagern Sie sie bis zur Anwendung auf Eis.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolation des Rattenhirns HINWEIS: Enthauptung und Hirnentfernung männlicher Ratten (150–200 g) wurden nach Sims und Anderson14durchgeführt.<ol>
<li>Legen Sie einen 30 ml Becher in einen Eiskübel und fügen Sie 10 ml kalte IB in das Becherglas.</li>
		<li>Enthaupten Sie die Ratte mit einer kleinen tierischen Guillotine und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel innerhalb von 1 min der Enthauptung, um die Verschlechterung der mitochondrialen Eigenschaften zu begrenzen.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gehirn schnell auf das Becherglas, das kalte IB enthält.</li>
	</ol></li>
	<li>Hirnhomogenisierung und Zubereitung von Mitochondrien HINWEIS: Mitochondriale Brüche wurden gemäß dem von Sims und Anderson14beschriebenen Protokoll isoliert, mit einigen Modifikationen, wie zuvor beschrieben15. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und alles während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten.<ol>
<li>Waschen Sie das Gewebe 2x mit 30 ml IB, übertragen Sie es in einen Becher, der kalte IB enthält, und zerkleinern Sie das Gehirn mit einer Schere.</li>
		<li>Fügen Sie 10 Bände vorgekühlten IB (ca. 10 ml IB pro Rattenhirn) hinzu.</li>
		<li>Übertragen Sie die Gewebesuspension auf einen 20 ml kalten Dounce Homogenisator.</li>
		<li>Homogenisieren Sie die Gewebestücke mit neun Auf- und Abschlägen mit einem motorisierten Stößel. HINWEIS: Lassen Sie die Mischung nach jedem Satz von drei Homogenisierungsschlägen ca. 30 s auf Eis, um sicherzustellen, dass das Homogenat kalt bleibt.</li>
		<li>Das Homogenat bei 1.300x g und 4 °C für 3 min in ein vorgekühltes 10 ml Zentrifugenrohr und zentrifugieren.</li>
		<li>Den Überstand vorsichtig dekantieren und 10 min auf ein vorgekühltes 10 ml Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 21.000x g bei 4 °C übertragen.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einer kalten 15%igen Gradienten-Mittellösung (5 ml für jedes Gehirn) wieder auf, indem Sie die Mischung vorsichtig mit einer Pipette rühren.</li>
		<li>Zentrifuge in einem Festwinkelrotor bei 30.700x g bei 4 °C für 5 min mit langsamer Beschleunigung (45 s von 0 U/min bis 500 U/min, gefolgt von normaler Beschleunigung) und Verzögerung (keine Bremsen). Dadurch sollten zwei unterschiedliche Materialbänder entstehen(Abbildung 1A, links).</li>
		<li>Entfernen Sie mit einer Pasteur-Pipette das scharfe Materialband, das sich oben im Farbverlauf angesammelt hat und das meist Myelin enthält. Entfernen Sie dann die Dichtegradienten-Mittellösung, die das Material (in Band 2) überlagert, so weit wie möglich, ohne eine der angereicherten mitochondrialen Brüche in Band 2 zu verlieren. HINWEIS: Das Band 2 enthält sowohl die synaptische als auch die nicht-synaptische Mitochondrien.</li>
		<li>Fügen Sie der mitochondrialen Fraktion 8 ml hinzu, während Sie die Mischung vorsichtig mit einer Pipette rühren.</li>
		<li>Zentrifuge bei 16.700x g bei 4 °C für 10 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand, so dass das untere lose Pellet ungestört bleibt.</li>
		<li>1 ml 10 mg/ml fettsäurefreies BSA in das Zentrifugenrohr geben, während die Mischung vorsichtig mit der Spitze einer Pipette gerührt wird. Erhöhen Sie das Endvolumen auf 5 ml pro Gehirn, indem Sie IB hinzufügen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 6.900x g bei 4 °C für 10 min, die ein festes Pellet produzieren sollte(Abbildung 1A, rechts).</li>
		<li>Den Überstand dekantieren und das mitochondriale Pellet in IB vorsichtig wieder aufsetzen, in 0,5 ml-Rohre auslagern und bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff lagern.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Proteinkonzentrationsbestimmung
HINWEIS: Die Proteinkonzentration wird mit der Methode von Lowry et al.16gemessen.
<ol><li>Vorbereitung von Lösungen für Lowry Assay<ol>
<li>Lösung A vorbereiten: 0,4 g NaOH und 2 g Na2CO3 wiegen und in 80 ml DW auflösen, dann die Lösung in einen 100 ml Volumetkolben übertragen und das Volumen durch Zugabe von DW auf 100 ml erhöhen.</li>
		<li>Lösung B vorbereiten: 0,1 g Kaliumnatriumtartrat und 0,05 g CuSO4 wiegen und in 8 ml DW auflösen, dann die Lösung in einen 10 ml Volumetkolben übertragen und das Volumen durch Zugabe von DW auf 10 ml erhöhen. HINWEIS: Beide Lösungen A und B können bis zu 6 Monate stabil bei 4 °C bleiben.</li>
		<li>Lösung C vorbereiten: Fügen Sie 0,5 ml Folinlösung zu 7,5 ml DW hinzu. HINWEIS: Bereiten Sie Lösung C frisch vor und halten Sie sich bis zur Anwendung vom Licht fern.</li>
		<li>Bereiten Sie BSA-Standards mit Endkonzentrationen von 0, 20, 40, 60, 80, 100 und 120 g/ml vor, indem Sie 0, 20, 40, 60, 80, 100 und 120 l mit 1 mg/ml BSA kombinieren, mit genügend DW, um 1000 l Lösung zu machen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteinkonzentrationsmessung HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt für eine höhere Genauigkeit in dreifacher Ausführung aus.<ol>
<li>Fügen Sie jedem Bohrgut einer 96-Well-Platte 50 l Standardlösungen und mitochondriales Homogenat hinzu, gefolgt von der Zugabe von 45 l der Lösung A. Dann inkubieren Sie die Platte für 10 min in einem warmen Wasserbad bei 50 °C gesetzt.</li>
		<li>Fügen Sie die Platte bei Raumtemperatur (RT) für 10 min bei Dunkelheit (RT) 5 l der Lösung B hinzu und inkubieren Sie sie.</li>
		<li>Fügen Sie 150 l Der Lösung C hinzu und brüten Sie die Platte für 10 min in einem warmwasserbad bei 50 °C.</li>
		<li>Laden Sie die Platte in einen Plattenleser und erfassen Sie die Absorptionswerte für Normen und mitochondriale Aufhängung bei 650 nm. Berechnen Sie dann mithilfe einer Kalibrierkurve den Proteingehalt der Mitochondrien.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Mitochondriale Membranintegritätsbestimmung
HINWEIS: Die mitochondriale Membranintegrität wird durch Messung der Aktivität der Malatdehydrogenase (MDH) in isolierten Mitochondrien vor und nach einer Membranstörung durch Triton X-100 bestätigt.
<ol><li>Mitochondriales Homogenat mit kaltem IB auf 1 mg/ml verdünnen und in zwei 1,5 ml-Röhren (typischerweise 195 l Mitochondrien pro Tube) geben.</li>
	<li>Fügen Sie Triton X-100 (mit DW verdünnt) 5 l von 20 % (v/v) zu einem Röhrchen (als Positivkontrolle für maximale Enzymaktivität) und 5 l DW zu einem anderen Rohr (zur Kontrolle) hinzu, gefolgt vom Mischen mit einem Rührer.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Rohre für 10 min in einem warmen Wasserbad bei 30 °C.</li>
	<li>Pelletmitochondrien durch Zentrifugieren von Rohren in einem Festwinkelrotor bei 16.000 x g und 4 °C für 15 min.</li>
	<li>Sammeln Sie sorgfältig die resultierenden Überstandmittel, um die Aktivität von mitochondrialem MDH mithilfe eines im folgenden Abschnitt beschriebenen spektrophotometrischen Standard-Assays zu untersuchen.</li>
	<li>Berechnen Sie die Integrität der mitochondrialen Membran wie folgt: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59883/59883equ01v4.jpg">
</li>
</ol>4. MDH-Aktivitätsbestimmung
HINWEIS: Die MDH-Aktivität wurde spektrophotometrisch gemessen, wie von Sottocasa et al.17beschrieben.
<ol><li>Vorbereitung von Lösungen für Deninataum MDH<ol>
<li>50 mM Tris-HCl-Lösung (pH = 7,5) vorbereiten: Eine 7,9 mg/ml Lösung in DW mit Tris-HCl vorbereiten und den pH-Wert bei 25 °C bei 1,0 M NaOH auf 7,5 einstellen.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 50 mM Oxaloacetat-Lösung vor: Bereiten Sie eine 6,6 mg/ml-Lösung mit Oxaloacetat in Tris-HCl vor. HINWEIS: Diese Lösung ist nicht stabil einmal in der Lösung und sollte unmittelbar vor der Verwendung vorbereitet werden.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 10 mM-NADH-Lösung vor: Bereiten Sie eine 7,81 mg/ml-Lösung mit der Verwendung von NADH in Tris-HCl vor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MDH-Aktivitätsbestimmung HINWEIS: Die Endkonzentrationen in einem 1,0 ml-Reaktionsgemisch sind 50 mM Tris-HCl, 5 mM Oxaloacetat und 0,1 mM NADH.<ol>
<li>Stellen Sie das Spektralphotometer auf 25 °C und 340 nm ein. Pipette 890 L Tris-HCl Puffer, 100 l Oxaloacetat-Lösung und 10 l NADH-Lösung für eine leere Küvette und 880 L Tris-HCl-Puffer, 100 l Oxaloacetat-Lösung und 10 l NADH-Lösung in eine Probenküvette.
</li>
		<li>Inkubieren Sie Küvetten im Spektralphotometer für 3-4 min und Referenz gegen Leer.</li>
		<li>Dann 10 l mitochondriales Homogenat (1 mg/ml) in die Probenküvette geben, sofort durch Inversion mischen und Absorptionsabnahmen durch NADH-Oxidation bei 340 nm für 1 min aufzeichnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. In-vitro-Synuclein, Rinderinsulin und HEWL-Fibrillenbildung
<ol><li>Proteinzubereitung<ol>
<li>Synuclein: ANMERKUNG: Die Expression und Reinigung des rekombinanten Synucleins wird wie von Hoyer et al.18 mit einigen Modifikationen beschrieben durchgeführt, und die Reinheit von '-Synuclein wird durch SDS-PAGE bestätigt.<ol>
<li>Dialyse-gereinigtes Synuclein über Nacht gegen phosphatgepufferte Saline (PBS).</li>
			<li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem Aussterbekoeffizienten von 5600 M-1 cm-1 bei 275 nm19.</li>
			<li>Aliquots Protein in 1,5 ml Tuben und lagern bei -80 °C bis zur Verwendung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Rinderinsulin und HEWL:<ol>
<li>Geben Sie sowohl Rinderinsulin als auch HEWL an.</li>
			<li>Lösen Sie jedes Protein in 50 mM Glycinpuffer (pH = 1,6; pH mit HCl einstellen).</li>
			<li>Bestimmen Sie die Rinderinsulin- und HEWL-Konzentration mit einem Aussterbekoeffizienten von 1,0 und 2,63 für 1,0 mg/ml bei 276 nm bzw. 280 nm bzw.20,21.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amyloid-Fibrillationsinduktion<ol>
<li>Vorbereitung von Lösungen für Amyloid-Fibrillation:<ol>
<li>Thioflavin T (ThT) Puffer vorbereiten: 0,3 g NaH2PO4 wiegen und in 80 ml DW auflösen, den pH-Wert auf 6,5 einstellen und das Volumen durch Zugabe von DW auf 100 ml erhöhen.</li>
			<li>ThT-Stammlösung (5 mM) vorbereiten: 1,6 mg ThT wiegen und in 1 ml ThT-Puffer auflösen, ein 0,22 m Filterpapier passieren und bis zum Gebrauch von Licht bei 4 °C fernhalten. HINWEIS: Diese Lösung kann bei 4 °C für bis zu 4 Wochen gelagert werden.</li>
			<li>ThT-Lösung (1 mM) vorbereiten: Fügen Sie 200 L ThT-Stammlösung (5 mM) zu 800 l ThT-Puffer hinzu. HINWEIS: Diese Lösung kann bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>In-vitro-Synuclein-Amyloid-Fibrillenbildung:<ol>
<li>Fügen Sie Aliquots (294 l) Proteinlösung (200 m) und 6 l ThT-Lösung (1 mM) zu 1,5 ml-Röhren hinzu, gefolgt vom Rühren.</li>
			<li>Die Rohre in einem Thermomixer bei 37 °C unter ständigem Rühren bei 800 U/min 4 Tage bebrüten.</li>
			<li>Nehmen Sie nach regelmäßigen Zeitintervallen Aliquots (10 l) inkubierter Proben und fügen Sie 490 L ThT-Puffer hinzu, gründlich gemischt und 5 min bei RT inkubieren.</li>
			<li>Setzen Sie anregungs- und Emissionsschlitzbreiten auf 5 nm bzw. 10 nm, und messen Sie die ThT-Fluoreszenz durch Anregung bei 440 nm und die Emission mit einem Fluoreszenzspektrophotometer bei 485 nm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>In-vitro-Rinderinsulin Amyloid-Fibrillenbildung:<ol>
<li>Fügen Sie 637 l Proteinlösung (250 m) zu 1,5 ml Röhre hinzu. Fügen Sie dann 13 l ThT-Lösung (1 mM) gefolgt von Rühren hinzu.</li>
			<li>Fügen Sie Aliquots (200 l) Proteinlösung (250 m) mit 20 M ThT zu jeder Bohrung einer klar bodengebundenen 96-Wellplatte hinzu und versiegeln Sie die Platte mit kristallklarem Dichtband.</li>
			<li>Die Platte in einen Fluoreszenzplattenleser laden und bei 57 °C ohne Rührung brüten.</li>
			<li>Messen Sie thT Fluoreszenz in 30 min Intervallen, mit Anregung bei 440 nm und Emission bei 485 nm, für 12 h. HINWEIS: Schütteln Sie die Platte vor jeder Messung 5 s lang.</li>
		</ol>
</li>
		<li>In-vitro-HEWL-Amyloid-Fibrillenbildung:<ol>
<li>Fügen Sie Aliquots (200 L) Proteinlösung )1 mM) mit 20 M ThT zu jeder Bohrung einer klar bodengebundenen 96-Wellplatte hinzu und versiegeln Sie die Platte mit kristallklarem Dichtband.</li>
			<li>Die Platte in einen Fluoreszenzplattenleser laden und bei 57 °C ohne Rührung brüten.</li>
			<li>Messen Sie die ThT-Fluoreszenz in 2-Stunden-Intervallen, mit Anregung bei 440 nm und Emission bei 485 nm, für 4 Tage. HINWEIS: Für alle drei Proteine wird die Amyloid-Fibrillenbildung durch Atomkraftmikroskopie bestätigt (Abbildung 2B).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Behandlung von Mitochondrien mit Amyloidfibrillen, MDH-Freisetzungstest und ROS-Messung
<ol><li>Inkubation isolierter Mitochondrien mit Amyloidfibrillen<ol>
<li>Zentrifuge und Warmwasserbad einschalten und auf 4 °C bzw. 30 °C einstellen.</li>
		<li>Mit IF mitochondrialem Homogenat auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnen.</li>
		<li>Bereiten Sie zwei Reihen von 1,5 ml-Röhren vor, die mitochondriale Homogenate enthalten (eine Serie für MDH-Freisetzungstest und eine weitere für die mitochondriale ROS-Messung).</li>
		<li>Fügen Sie Aliquots von frischen oder amyloiden Fibrillen von ,-Synuclein, Rinderinsulin oder HEWL (bei Endkonzentrationen von 5 m, 10 m, 20 m und 25 m; verwenden Sie PBS oder Glycinpuffer als Kontrolle) zum mitochondrialen Homogenat (Endvolumen = 200 l) (siehe Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3) anschließend sanft mit einer Pipette rühren. HINWEIS: Für den MDH-Freisetzungstest verwenden Sie Triton X-100 (bei einer Endkonzentration von 0,5% [v/v]) als positive Kontrolle für die maximale Enzymfreisetzung.</li>
		<li>Inkubieren Sie Röhren mit mitochondrialen Suspensionen für 30 min im Warmwasserbad auf 30 °C eingestellt.</li>
		<li>Messen Sie die mitochondriale MDH-Freisetzung und den ROS-Inhalt gemäß den Abschnitten 6.2 und 6.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mitochondrial MDH Release Assay<ol>
<li>Zentrifugieren Sie die inkubierten mitochondrialen Homogenate bei 16.000 x g für 15 min, und sammeln Sie dann sorgfältig die resultierenden Überwälten, um die Aktivität der mitochondrialen MDH, wie in Abschnitt 4 beschrieben, zu bewerten.</li>
		<li>Berechnen Sie die Freisetzung von MDH als Bruchteil des maximalen Effekts (Triton X-100) wie folgt:</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59883/59883equ02v4.jpg">
<ol start="3"><li>Mitochondriale ROS-Messung HINWEIS: Der mitochondriale ROS-Gehalt wird mit dem oxidationsempfindlichen fluorogenen Vorläufer Dihydrodichlorocarboxyfluorescein-Diaacetat (DCFDA)22bestimmt.<ol>
<li>Bereiten Sie Lösungen für die mitochondriale ROS-Messung vor. Bereiten Sie eine 50 M DCFDA-Lösung vor, indem Sie sie in Methanol (frisch vorbereiten) und eine 200 mM-Succinatlösung auflösen, indem Sie sie in DW auflösen.</li>
		<li>Pipette 191 l inkubiertes mitochondriales Homogenat zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte und 4 l mit 50 M DCFDA (1 M Endkonzentration) und 5 l mit 200 mM Succinat (5 mM Endkonzentration) hinzufügen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte 30 min in einem warmen Wasserbad bei 30 °C unter sanftem Rühren.</li>
		<li>Laden Sie die Platte in einen Fluoreszenzplattenleser und messen Sie die Fluoreszenzintensität, mit Anregung bei 485 nm und Emission bei 530 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Statistische Analyse
<ol><li>Führen Sie alle Experimente mindestens 2x oder 3x mit dreifachen Assays durch und führen Sie entsprechende statistische Tests durch. Hier werden die Ergebnisse als mittelwertige SD dargestellt, und ein Student es paired t-testwurde verwendet, um die statistische Signifikanz zu berechnen. P-Werte unter 0,01 und 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen (*p &lt; 0,05; **p &lt; 0,01).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Eine Fülle von experimentellen Ergebnissen stützt die Hypothese, dass die Zytotoxizität von fibrillaren Aggregaten signifikant mit ihrer Fähigkeit verbunden ist, mit biologischen Membranen zu interagieren und sie zu durchdringen4,5. Die meisten Daten basieren jedoch auf künstlichen Lipid-Doppelschichten, die nicht unbedingt die intrinsischen Eigenschaften biologischer Membranen widerspiegeln, die heterogene Strukturen mit einer Vielzahl von Phospholipiden und Pro...

Amyloid-bedingte Störungen, bekannt als Amyloidosen, stellen eine große Gruppe von Krankheiten dar, die durch das Auftreten unlöslicher Proteinablagerungen in verschiedenen Geweben und Organen definiert sind1,2. Unter ihnen sind neurodegenerative Erkrankungen die häufigsten Formen, in denen Proteinaggregate im zentralen oder peripheren Nervensystem auftreten2. Obwohl eine Reihe von Mechanismen vorgeschlagen wurden, um in die Toxizität von Amyloid-Aggregaten beteiligt werden3, eine wachsende Menge von Beweisen deutet auf Zellmembran-Störung und Permeabilisierung als primärer Mechanismus der Amyloidpathologie4, 5. Neben der Plasmamembran können auch innere Organellen (d.h. Mitochondrien) betroffen sein.
Interessanterweise deuten neue Erkenntnisse darauf hin, dass mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen spielt, einschließlich Alzheimer und ParkinsonErkrankungen 6,7. In Übereinstimmung mit dieser Ausgabe haben zahlreiche Berichte auf eine Bindung und Akkumulation von Amyloid-Peptid, -synuclein, Huntingtin und ALS-verknüpften mutierten SOD1-Proteinen an Mitochondrien8,9,10 11. Der Mechanismus der Membranpermeabilisierung durch Amyloidaggregate wird entweder durch Bildung diskreter Kanäle (Poren) und/oder durch einen unspezifischen Waschmittel-ähnlichen Mechanismus5,12, 13. Bemerkenswert ist, dass die meisten dieser Schlussfolgerungen auf Berichten mit Phospholipid-Modellsystemen basieren, und Studien, die direkt auf die Ereignisse in biologischen Membranen abzielen, sind selten. Es ist klar, dass diese künstlichen Lipid-Doppelschichten nicht unbedingt die intrinsischen Eigenschaften biologischer Membranen widerspiegeln, einschließlich der mitochondrien, die heterogene Strukturen sind und aus einer Vielzahl von Phospholipiden und Proteinen bestehen.
In der vorliegenden Studie werden Von Rattenhirnen isolierte Mitochondrien als in vitro biologisches Modell verwendet, um die zerstörerischen Wirkungen von Amyloidfibrillen zu untersuchen, die aus dem signifikante strukturelle Homologie mit humanem Insulin, das an einer injektionslokalisierten Amyloidose beteiligt ist), und Hühnereiweißlysozym (HEWL; als gemeinsames Modellprotein zur Untersuchung der Amyloid-Aggregation). Die Wechselwirkungen und möglichen Schäden von mitochondrialen Membranen, die durch Amyloidfibrillen induziert werden, werden dann untersucht, indem die Freisetzung von mitochondrialer Malatdehydrogenase (MDH) (in der mitochondrialen Matrix) und mitochondrienem reaktiven Sauerstoff beobachtet wird. Arten (ROS) Verbesserung.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlordidihydrofluoresceindiacetat</td><td>Sigma</td><td>35845</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Merck</td><td>1012171000</td><td></td></tr><tr><td>Schwarz 96-Well-Platte</td><td>Corning</td> Black 96-Well-Platte Corning <td></td><td></td></tr><tr><td>Black 96-Well-Platte mit klarem Boden</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderinsulin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>BSA im Wesentlichen fettsäurefrei</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kristallklares Dichtband</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma 451657</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dialysebeutel (abgeschnitten 2 KDa)</td><td>Sigma</td><td>D2272</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homogenisator</td><td>Potter Elvehjem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzplatten-Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Spektrophotometer</td><td>Cary Eclipse VARIAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folin</td><td>Merck</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Guillotine</td><td>Hergestellt im Iran</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Hühnereiweiß Lysozym (HEWL)</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Oxalacetat</td><td>Sigma</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Gesundheitswesen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma</td><td>CS0030</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumnatriumtartrat</td><td>Sigma</td><td>217255</td><td></td></tr><tr><td>Quarzküvette</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>analytik jena</td><td>SPEKOL 2000 Modell</td><td></td></tr><tr><td>Succinat</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck</td><td>1076871000</td><td></td></tr><tr><td>Thermomischer</td><td>Eppendorph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Merck</td><td>1082191000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>QUELAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hefe-Extrakt</td><td>QUELAB</td>&beta;<td></td><td></td></tr><tr><td>-NADH</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr></tbody></table>

wechselwirkungen mit und membranpermeabilisierung des gehirns mitochondrien durch amyloid fibrils

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass Membranpermeabilisierung, einschließlich der inneren Membranen wie Mitochondrien, ist ein gemeinsames Merkmal und primärer Mechanismus der Amyloid-Aggregat-induzierte Toxizität bei neurodegenerativen Erkrankungen. Die meisten Berichte, die die Mechanismen der Membranstörung beschreiben, basieren jedoch auf Phospholipid-Modellsystemen, und Studien, die direkt auf Ereignisse abzielen, die auf der Ebene biologischer Membranen auftreten, sind selten. Beschrieben hier ist ein Modell für die Untersuchung der Mechanismen der Amyloid-Toxizität auf Membranebene. Für die mitochondriale Isolierung wird ein Dichtegradientenmedium verwendet, um Präparate mit minimaler Myelinkontamination zu erhalten. Nach der Bestätigung der mitochondrialen Membranintegrität wird die Wechselwirkung von Amyloidfibrillen, die aus dem In-vitro-Biologischen Modell von Synuclein, Rinderinsulin und Hühnereiweißlysozym (HEWL) mit Rattenhirn-Mitochondrien als in vitro biologisches Modell entstehen, untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung von Hirnmitochondrien mit fibrillaren Baugruppen unterschiedliche Grade der Membranpermeabilisation und ROS-Gehaltsverbesserung verursachen kann. Dies deutet auf strukturabhängige Wechselwirkungen zwischen Amyloidfibrillen und mitochondrialer Membran hin. Es wird vermutet, dass biophysikalische Eigenschaften von Amyloidfibrillen und deren spezifische Bindung an mitochondriale Membranen Erklärungen für einige dieser Beobachtungen liefern können.

Das Protokoll beschreibt ein Modell zur Untersuchung der Wechselwirkungen von Amyloidfibrillen mit Mitochondrien des Rattenhirns als in vitro biologisches Modell. Für die mitochondriale Präparation wurde 15% (v/v) Dichtegradientenmedium verwendet, um Myelin als größere Kontamination des Hirngewebes zu entfernen14. Wie in Abbildung 1Adargestellt, erzeugte die Zentrifugation bei 30.700 x g zwei unterschiedliche Materialbänder, Myelin <span style="font-size: 14p...

Hier ist ein Protokoll zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen nativer Form, Präfibrillar und reifen Amyloidfibrillen verschiedener Peptide und Proteine mit Mitochondrien aus verschiedenen Geweben und verschiedenen Bereichen des Gehirns isoliert.

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

In diesem Video beschreiben wir eine Modellstudie für den Mechanismus der Amyloid-Toxizität auf Membranebene unter Verwendung von Rattenhirnmitochondrien als in vitro biologisches Modell. Trotz des akkumulierenden Berichts, der den Mechanismus der Membranstörungen durch Amyloid-Aggregat in Phospholipid-Modellsystemen beschreibt, die direkt auf die Ereignisse abzielen, die bei der Entwicklung der biologischen Membran beginnen. Im vorliegenden Video beschreiben wir Amyloidfibrillen von Alpha-Synuclein, die die Mitochondrienmembran des Rattengehirns als in vitro biologisches Modell analysieren.Wir glauben, dass Mitochondrien als Organelle mit gut charakterisierten Membranen ein äußerst nützliches biologisches Modellsystem für molekulare Studien im Zusammenhang mit dem Mechanismus der Amyloidzytotoxizität auf Membranebene im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen bieten können. Enthaupten Sie die Ratte mit einer kleinen tierischen Guillotine und entfernen Sie das Gehirn von der Skala innerhalb einer Minute nach der Enthauptung der Ratte, um eine mögliche Verschlechterung der mitochondrialen Eigenschaften zu begrenzen. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und alles während des gesamten Verfahrens auf Eis zu halten.Waschen Sie das Gewebe zweimal mit 30 Milliliter Isolationspuffer. Auf einen Becher mit Kalteisolationspuffer übertragen und das Gehirn mit einer Schere fein zerkleinern. Übertragen Sie die Gewebesuspension auf einen 20 Milliliter Kaltentun-Homogenisator.Homogenisieren Sie die Gewebestücke mit neun Auf- und Abschlägen mit einem motorisierten Stößel. Lassen Sie die Mischung ca. 30 Sekunden nach jedem Satz von drei Homogenisierungsschlägen auf Eis, um sicherzustellen, dass das Homogenat kalt bleibt. Das Homogenat bei vier Grad Celsius drei Minuten in ein vorgekühltes Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 1, 300 G geben.Den Überstand vorsichtig dekantieren und in ein vorgekühltes Zentrifugenrohr geben. Zentrifuge bei 21.000 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Dichtegradientenmedium wieder auf, indem Sie die Mischung vorsichtig mit der Pipette rühren.Zentrifuge in einem festen Winkelrotor bei 30, 700 G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie mit einer Pasteur-Pipette das scharfe Ende des oben angesammelten Materials, das meist Myelin enthält. Fügen Sie der mitochondrialen Fraktion einen Isolationspuffer von acht Millilitern hinzu, während Sie die Mischung vorsichtig mit der Pipette rühren.Zentrifuge bei 16, 700 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, so dass das untere lose Pellet ungestört bleibt. Fügen Sie einen Milliliter 10 Milligramm pro Milliliter fettsäurefreies BSA in das Zentrifugenrohr, während Sie die Mischung vorsichtig mit der Spitze der Pipette rühren.Machen Sie das Volumen auf fünf Milliliter, indem Sie Isolationspuffer hinzufügen. Zentrifuge bei 6, 900 G bei vier Centigrade für 10 Minuten. Dadurch sollte ein festes Pellet entstehen.Dekantieren Sie den Überstand und setzen Sie das mitochondriale Pellet im Isolationspuffer sanft wieder aus. Mitochondriales Homogenat auf ein Milligramm pro Milliliter mit Kälteisolationspuffer verdünnen und in zwei 1,5-Milliliter-Röhren, typischerweise 195 Mikroliter Mitochondrien pro Tube, geben. Fügen Sie fünf Mikroliter 20% Volumen pro Volumen Triton X-100 zu einem Rohr als positive Kontrolle für maximale Enzymaktivität und fünf Mikroliter entionisiertes Wasser zu einem anderen Rohr zur Kontrolle, gefolgt von dem Mischen mit einem Rührwerk.Inkubieren Sie die Rohre für 10 Minuten in warmes Wasserbad auf 30 Centigrade eingestellt. Pellet mitochondrien durch Zentrifugieren von Rohren in einem festen Winkelrotor bei 16 000 G vier Grad Celsius für 15 Minuten. Sammeln Sie sorgfältig resultierende Überstandmittel zur Beurteilung der Aktivität der mitochondrialen Malatdehydrogenase mit einem standardspektrophotometrischen Assay, der im nächsten Teil beschrieben wird.Berechnen Sie die Integrität der mitochondrialen Membran wie folgt. Zur Bestimmung der Malate-Dehydrogenase-Aktivität simpere Pipette 890 und 880 Mikroliter 50 Millimolar Tris-HCL Puffer zu leeren und Probe test Küvetten jeweils gefolgt von 100 Mikroliter 50 Millimolar Oxaloacetat und 10 Mikroliter 10 Millimolar Beta-NADH. Setzen Sie die Küvetten in ein Spektralphotometer und Referenz gegen Leerzeichen.10 Mikroliter mitochondriales Homogenat ein Milligramm pro Milliliter zur Probeküvetette geben. Sofort durch Inversion mischen. Rekordabnahme der Absorption durch NADH-Oxidation bei 340 Nanometer für eine Minute.Für Alpha-Synuclein-Amyloid-Fibrillation, fügen Sie 294 Mikroliter Proteinlösung, 200 Mikromolar zu jeder 1,5 Milliliter Tube. Dann fügen Sie sechs Mikroliter ThT-Lösung ein Millimolar. Mischen Sie die Lösungen und inkubieren Sie die Rohre in einem Thermomixer bei 37 Centigrade unter ständigem Rühren bei 800 U/min.Für Rinder insulin amyloid Fibrillation, fügen Sie 637 Mikroliter Proteinlösung, 250 Mikromolar zu 1,5 Milliliter Tube. Dann fügen Sie 13 Mikroliter ThT-Lösung ein Millimolar gefolgt von Rühren. Fügen Sie aliquots 200 Mikroliter Proteinlösungen zu jedem Brunnen einer klaren unteren 96-Well-Platte hinzu.Versiegeln Sie die Platte mit kristallklarem Dichtband. Laden Sie die Platte in Cytation 5 Fluoreszenzplattenleser. Messen Sie die ThT-Fluoreszenz im 30-Minuten-Takt für 12 Stunden.Verwenden Sie Anregung bei 440 Nanometer und Emission bei 485 Nanometer. Wählen Sie die Brunnen aus. Schütteln Sie die Platte fünf Sekunden vor jeder Messung.Stellen Sie die Temperatur ohne Rührung auf 57 Grad Celsius ein. Bereiten Sie zwei Reihen von 1,5 Milliliter-Röhren vor, die mitochondriale Homogenate enthalten, eine Serie für MDH-Freisetzungstest und eine andere für die mitochondriale ROS-Messung. Fügen Sie Aliquots von frischen oder amyloiden Fibrillen von Alpha-Synuclein, Rinderinsulin oder Hühnereiweißlysozym zu mitochondrialem Homogenat hinzu, gefolgt von sanfter Pipettierung.Inkubieren Sie Röhren mit mitochondrialen Suspensionen für 30 Minuten in warmem Wasserbad auf 30 Grad Celsius eingestellt. Für den Exat-Dehydrogenase-Freisetzungstest werden zentrifugierte mitochondriale Homogenate bei 16.000 G für 15 Minuten inkubiert. Sammeln Sie sorgfältig resultierende Überstand für die Aussage der Aktivität der mitochondrialen MDH, wie auf Protokollabschnitt 4 beschrieben.Berechnen Sie die Freigabe von MDH wie folgt. Für die mitochondriale ROS-Messung, Pipette 191 Mikroliter inkubiertes mitochondriales Homogenat zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte. Fügen Sie vier Mikroliter von 50 Mikromolar DCFDA.Dann fünf Mikroliter 200 Millimolar Succinat hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte für 30 Minuten in warmem Wasserbad auf 30 Centigrade eingestellt unter sanftem Rühren. Laden Sie die Platte in einen Cytation 5 Fluoreszenzplattenleser und messen Sie die Fluoreszenzintensität gemäß dem Protokollabschnitt.Die mitochondriale Membranintegrität wurde durch Messung der MDH-Aktivität in den isolierten Mitochondrien vor und nach Membranunterbrechung und Enzymfreisetzung durch Triton X-100 bewertet. Wie Sie sehen, haben wir in der Regel festgestellt, dass mitochondriale Präparate etwa 93% intakt sind. ThT Fluoreszenz-Assay wurde durchgeführt, um das Wachstum von Amyloidfibrillen zu überwachen.Die Kurve für Amyloid-Fibrillation von drei Proteinen zeigte ein typisches sigmoidales Muster, das bei Alpha-Synuclein, Rinderinsulin und Hühnereiweißlysozym bis zu einem Plateau reichte, was auf die Bildung von Amyloidfibrillen hindeutet, die durch AFM-Messung mehr bestätigt wurden. Mögliche Permeabilisierung und Schädigung der mitochondrialen Membran durch Amyloidfibrillen wurde durch die Freisetzung von mitochondrialer MDH und mitochondrialer ROS-Messung untersucht. Wie Sie in der linken Grafik sehen, wurde eine wesentliche Freisetzung von MDH bei Zugabe der Alpha-Synuclein-Amyloidfibrillen zu Mitochondrien beobachtet.Während eine leichte Freisetzung durch Insulinfibrillen festgestellt wurde, wurden Hühnerei-Weiß-Lysozyme-Fibrillen als unwirksam befunden. Rechte Grafik zeigt die Wirkung von Amyloidfibrillen auf den mitochondrialen ROS-Gehalt. Während keine signifikante Verbesserung der mitochondrialen ROS wurde bei Zugabe von Hühnerei Weiß Lysozym oder Insulin Amyloid Fibrillen beobachtet, Behandlung mit Alpha-Synuclein Fibrillen führte zu einem erheblichen Anstieg des ROS-Gehalts des Gehirns Mitochondrien.Das vorliegende Video beschreibt eine Modellstudie für den Mechanismus der Fibel-Aggregatzytotoxizität auf Membranebene und zeigt, wie Amyloidfibrillen, die aus verschiedenen Proteinen entstehen, unterschiedliche Grade von Membranschäden und Permeabilisierung verursachen können. Während einige Themen der Amyloidfibrillen und ihre spezifische Bindungsmembran scheinen mit der Fähigkeit zu interagieren und verursachen Destabilisierung und nachfolgende Störungen der Membranen. Nach diesem Video werden Sie in der Lage sein, die Wechselwirkung von nativer Form, Präfibrillar und reifen Amyloidfibrillen verschiedener Peptide und mit Mitochondrien aus verschiedenen Geweben oder verschiedenen Bereichen des Gehirns isoliert zu untersuchen.

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Research

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Biochemistry

Biochemie

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Hier ist eine modifizierte Roller Schlauch Methode zur Kultivierung und intermittierende hochauflösende Bildgebung des Gehirns Nagetier Scheiben über viele Wochen mit präzisen Neupositionierung auf komplexeste Deckgläsern. Neuronalen Lebensfähigkeit und Slice Morphologie sind gut gepflegt. Anwendungen dieses komplett geschlossenes System mit Viren für Zelltyp spezifische Ausdruck stehen zur Verfügung.

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